胚胎大鼠神经干细胞的体外培养与鉴定

目的利用无血清培养和细胞克隆培养技术从孕鼠(14 d)胚胎中分离出神经干细胞,并进行传代培养和诱导分化。 方法 采用免疫细胞荧光化学染色方法观察不同代数细胞克隆球中nestin、neuN、GFAP阳性细胞比例,鉴定培养的原代和传代的细 胞类型结果随着传代次数增加,克隆球中nestin阳性细胞的比例无明显变化(P>0．05),不同代数的神经干细胞克隆球诱导分化 后均有一定比例的neuN与GFAP阳性细胞。结论 证实从胚胎大鼠大脑皮层分离培养的细胞是神经干细胞,提示体外培养体系中 培养的神经干细胞可以长期传代并保持于细胞的特性。     

鼠胚胎神经干细胞的体外培养及诱导分化

背景：随着神经干细胞培养技术条件的成熟,为颅脑损伤后神经系统功能重建、神经再生和神经系统疾病治疗提供了新的思路和途径。但移植所用的细胞来源及移植后的神经干细胞能否分化为神经细胞是急需解决的重要问题。 目的：拟将体外分离培养的鼠胚胎神经干细胞稳定增殖传代,并诱导分化出神经系统的3种基本细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-06/2008-06在新疆维吾尔自治区人民医院完成。 材料：14~16 d孕龄Wistar大鼠胚胎,由新疆自治区实验动物研究所和新疆医科大学实验动物中心提供。 方法：取胎鼠额叶大脑皮质,组织块消化法体外分离培养神经干细胞,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖。原代培养7 d后,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导14 d。 主要观察指标：倒置显微镜下观察神经干细胞的生长形态,并行巢蛋白免疫荧光染色鉴定。应用免疫组化染色检测诱导后神经干细胞的分化情况。 结果：原代培养一两天细胞散在分布,胞体较小,呈圆形,折光性较好,3 d后逐渐形成由数个细胞组成的细胞球;传代后贴壁细胞多数分化为长梭形或扁平形的胶质细胞,10 d时可见大量由数十至数百个细胞组成的较大细胞球,其生长速度基本与原代培养相同,但成球速度明显加快;免疫荧光染色呈巢蛋白阳性反应。以含体积分数为10%胎牛血清的培养液诱导后,免疫化学染色示神经干细胞球呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白阳性表达。 结论：实验成功从鼠胚胎脑皮质分离培养出神经干细胞,并诱导分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 关键词：神经干细胞;体外培养;诱导分化     

大鼠胚胎神经干细胞的体外培养及冻存

目的体外培养、冻存大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点及复苏后的活性。方法取孕15d的大鼠海马区细胞,体外培养。以20%牛血清白蛋白(BSA)加10%二甲基亚砜(DMSO)作冷冻保护剂,于液氮中冻存。复苏后计数活细胞数,免疫细胞化学鉴定其分化状态。结果第1~4代NSCs复苏后神经干细胞存活率在40%~63%之间,差异无统计学意义。冻存复苏后的NSCs能够存活、传代,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞能够在体外增殖、分化,并且冻存复苏不影响其生物学特点和细胞活性。     

神经干细胞的体外培养与鉴定

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是具有自我更新能力和多向分化潜能的祖细胞,近年来,NSCs选择性培养法及NSCs的永生化的发展,使得体外长期大量扩增NSCs成为可能。Nestin和Musashil是目前常用的鉴定NSCs的特异性标记物。另外骨髓基质细胞、脐血干细胞来源的NSCs为中枢神经系统细胞移植提供了新的细胞来源。现就中枢神经系统干细胞的体外培养及鉴定进行综述。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法 原代培养．培养细胞生长状况观察用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）检测以作细胞鉴定。结果 成功培养出大鼠胚胎神经干细胞，了解其生长规律，并对其进行传代、冻存及复苏，培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论 大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏，并具有多向分化潜能。     

大鼠神经干细胞体外培养

目的:介绍一种较成熟的大鼠神经干细胞体外培养方法。方法:取新生大鼠(1d之内)侧脑室前角周围的脑组织,用EDTA:胰蛋白酶(1:1)消化,制成单细胞悬液,以2-5×105个细胞/ml接种于无血清培养基中。观察其增殖、分化情况,并用nestin、GFAP、NSE免疫细胞化学对细胞进行定性。结果:培养细胞呈悬浮生长,具有增殖能力,倍增时间为2d,nestin阳性。诱导分化后细胞贴壁生长,体积增大,并发出形态各异的突起。可见GFAP和NSE阳性细胞。结论:培养细胞经鉴定为神经干细胞。本方法简单、易操作,可行性强。     

大鼠胚胎神经干细胞的培养与鉴定

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点。方法取孕15d的大鼠,采用机械分离法获取海马区细胞,以106个细胞/m l的密度接种到无血清NSCs培养基中培养,分离纯化至第5代。以10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果取NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈小鼠抗巢蛋白(nestin)、小鼠抗微管蛋白(-βtubu lin)、豚鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及小鼠抗O4免疫化学反应阳性。结论大鼠胚胎脑海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。     

SD大鼠胚胎神经干细胞分离、培养及鉴定

目的 体外培养并鉴定神经干细胞，为相关实验研究奠定基础。方法 分离SD大鼠胎鼠的间脑，加入神经生长因子EGF和bFGF在神经干细胞条件培养基中克隆培养。用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果 分离培养的细胞具有不断增殖的能力，表达神经巢蛋白（nestin），并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞。结论 成功建立了神经干细胞的分离培养方法，可用于进一步的实验研究。     

大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究

目的 从孕龄15d SD胚胎鼠脑皮质中分离并培养神经干细胞（neural stem cells。NSCs），观察其生长、增殖及分化。方法 采用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养及单细胞克隆技术，对胚胎鼠脑皮质神经干细胞进行原代、传代培养及诱导其分化。用Nestin染色鉴定神经干细胞特性，用免疫组化方法（β-Ⅲ-tubulin、GFAP染色）检测神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞状况。结果 从孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质中分离的组织，经原代及传代培养均可形成细胞克隆．切具有增殖能力。原代及传代培养细胞呈Nestin（神经上皮干细胞蛋白）表达阳性．诱导分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞的特异性抗原。结论 本实验分离、培养的孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质细胞Nestin表达阳性．分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的神经干细胞，并具有多向分化潜能。     

大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆实验研究

目的：探索大鼠神经干细胞在胚胎脑内的分布特点,并用三种不同的方法对干细胞进行克隆化培养。方法：对胚龄16天左右的大鼠胚胎脑组织做连续冠状位冰冻切片,特异的抗nestin免疫组化染色,以显示干细胞在胚胎的分布特点。我们还把胚龄16天左右的胎鼠室管膜下脑进行原代及传代培养,传代的神经干细胞用三种方法有限稀释法,饲细胞克隆培养法,软琼脂克隆培养法进行克隆培养。结果：1．神经干细胞在胚胎的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位如：脑室、脑室下区,中脑导水管周围。神经干细胞多表现为复层上皮样排列,细胞突起呈放射状伸向脑的表层并之与保持密切联系。有的干细胞在离室管膜较远处呈簇状分布好似群状迁移的干细胞群也好似干细胞的发生中心。2．干细胞的原代及传代培养显示：神经细胞易呈聚集状生长的特点及神经细胞的迁移性的生长特点,各细胞群之间有密切的纤维联系。3．神经细胞生长的细胞密度依赖效应与细胞之间的接触在生长发育中的重要作用。结论：神经干细胞在胚胎的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位,软琼脂克隆法是一种成功的干细胞克隆方法。     

人胚神经干细胞的体外培养和超微结构观察

目的观察体外分离培养的人胚脑神经干细胞的生物学行为和超微结构特征。方法利用无血清培养和单细胞克隆技术从人胚脑组织中分离培养神经干细胞并用血清诱导其分化,应用免疫荧光细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定,并分别用扫描电镜和透射电镜观察其超微结构。结果从人胚脑组织分离的细胞群呈悬浮球状生长,具有连续增殖的能力,并可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。扫描电镜发现神经干细胞球中的细胞之间连接较为松散,无紧密连接结构;透射电镜发现神经干细胞的胞核巨大,胞浆少,核浆比例较大,胞浆内细胞器简单,以核糖体和内质网居多。结论神经干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,其超微结构显示早期原始幼稚细胞的发育特征。本研究为进一步的神经干细胞基础研究和临床应用奠定了基础。     

兔间充质干细胞诱导纹状体神经干细胞分化为神经细胞的研究

目的研究兔纹状体间充质干细胞诱导神经干细胞分化为神经细胞的可行性和机制。方法培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)融合达90%时,更换培养基无血清培养24h,收集细胞培养液即为其条件培养基。取成年兔纹状体细胞进行神经干细胞培养,加BMSC条件培养基进行神经干细胞的诱导分化。结果2～4h后神经干细胞开始贴壁,随后有突起从干细胞长出,7d后出现大量不同形态的分裂增殖新生神经细胞,较对照组神经元数量增加,有显著性差异,细胞折光性强,突起长,生存时间延长。结论间充质干细胞能提高神经干细胞诱导分化为神经元的数量,并能延长神经元的生存时间。     

基因芯片技术筛选不同中药诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的差异表达基因

目的 从基因水平了解中药在诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的分子机制。方法 应用基因芯片技术分析了黄芪（Radix Astragali Seu Hedysari,RASH）和天麻（Gastrodiaelata,GE）诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化过程中差异表达的基因。结果 在黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化过程中,有96个差异表达基因（上调或下调倍数大于2）;在天麻组有118个差异表达基因（上调或下调倍数大于2）。在两组中共发现与细胞分化相关的差异表达基因17个,其中差异表达明显的有3个,包括bHLH,Epiregulin,fibroblast growthfactor。 9.结论 黄芪和天麻可有效地诱导骨髓间充质干细胞分化神经元,其作用机制涉及多种基因。     

含IKVAV两亲性肽自组装凝胶二维诱导神经干细胞分化的研究

目的：将鼠神经干细胞(NSCs)接种于含IKVAV两亲性肽自组装凝胶表面,观察其对细胞分化影响。 方法：机械分离法从乳鼠大脑皮层获取细胞,免疫组织化学鉴定;1wt%两亲性肽溶液在DMEM/F12触发下自组装为三维多孔凝胶,TEM观察凝胶结构;1×105/ml NSCs悬液分别接种于凝胶表面（实验组,EG）及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面(对照组,CG)培养两周,免疫细胞化学染色鉴定。 结果：分离的细胞为Nestin 阳性的NSCs,可分化为NSE阳性神经元及GFAP阳性胶质细胞;TEM示凝胶由纳米纤维构成,纤维直径有3～5纳米,长度100纳米～1500纳米;培养7天后,实验组可观察到细胞长出突起, 可发现NF（+）神经元样细胞,标记为红色荧光, GFAP（+）胶质细胞样细胞,标记为绿色荧光;对照组仅形成未分化细胞球,Nestin(＋),标记为绿色荧光。 结论：含IKVAV肽自组装三维凝胶与NSCs有良好的细胞相容性,可诱导NSCs分化为神经元及胶质细胞。     

EGF对神经干细胞迁移的影响

目的研究表皮生长因子(EGF)对神经干细胞迁移的影响。方法取孕13—14dSD大鼠胚胎纹状体行神经干细胞培养，7d后取悬浮神经球制成单细胞悬液再培养，EGF作用下连续培养14d后分为实验组和对照组，继续培养，观察：EGF对神经干细胞迁移的影响。结果原代培养的细胞球是神经干细胞，EGF传代培养14d时细胞球大小约100个细胞左右，实验组观察到第14d细胞球增殖变慢，细胞球长出突起与邻近的细胞球相接触，14—17d观察到神经干细胞迁移，17d后细胞迁移现象消失；对照组中未观察到细胞迁移。结论：EGF在某一特定时间内能够诱导神经干细胞迁移。     

大鼠胚胎NSCs与人胚NSCs的比较

目的 探讨体外培养的大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）及人胚NSCs的生长增殖特点。方法 取孕15d的大鼠，采用胰酶消化法获取海马区细胞，以106个／ml的细胞密度接种到无血清NSCs培养基中培养，分离纯化至第5代后，以10％胎牛血清（FBS）和2％多聚赖氨酸诱导分化，免疫细胞化学鉴定。同样方法分离、培养人胚海马区细胞。结果 取大鼠胚胎NSCs和人胚NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定，细胞分别呈巢蛋白（nestin）、微管蛋白（β—tubulin）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学反应阳性。结论 大鼠胚胎海马区与人胚海马区均有NSCs存在，离体培养时能分裂增殖，并能被诱导分化，且两者形态相似，但是其生长速度、体积大小有差异。     

神经干细胞移植对AD鼠基底前脑NOS阳性神经元的影响

目的 探讨神经干细胞（neural stem cells,NSCs）移植对老年性痴呆鼠基底前脑一氧化氮合酶（NOS）阳性神经元的影响.方法 切断成年SD大鼠左侧穹窿海马伞（fimbria-fornix,FF）,于基底前脑行神经干细胞移植,4周后行组织化学染色结合图像分析技术观察各组大鼠基底前脑NOS阳性神经元数量和形态学参数的变化. 结果 损伤后大约1个月,损伤侧基底前脑内侧隔核（MS）和斜角带垂直支（VDB）内可观察到NOS阳性神经元明显减少,分别为正常组的35.5%和55.8%,（与正常组相比P＜0.01）;移植组NOS阳性神经元数恢复到正常组的74.7%和95.7%,（与损伤组相比P＜0.01）.细胞形态学参数提示移植组NOS阳性神经元中含部分中等大小的未成熟细胞.结论 神经干细胞移植治疗,对AD模型鼠基底前脑MS、VDB的NOS阳性神经元有明显的补充和保护作用。     

慢性应激抑制卒中后大鼠海马内源性神经干细胞增殖和分化研究

目的 观察慢性应激对卒中后海马内源性神经干细胞增殖和分化的影响。方法 将雄性SD大鼠分为正常、卒中、慢性应激组。建立左侧大脑中动脉闭塞卒中动物模型并予以慢性不可预见温和应激刺激结合孤养。经溴脱氧尿苷嘧啶（BrdU）标记，免疫组化、荧光双标染色及共聚焦成像动态检测并比较各研究组大鼠左侧海马齿状回BrdU及其与神经元核性蛋白（NeuN）共表达。结果 与卒中组相比，慢性应激组大鼠病灶侧海马齿状回BrdU+细胞数在脑梗死后第7天未见减少，第21天明显减少（28.5±1.9 vs 72.2±1.4），差异有统计学意义（P<0.001）。与卒中组相比，慢性应激组大鼠病灶侧海马齿状回BrdU+/NeuN+细胞比例在脑梗死后30 d[（69.0±3.4）%）]和45 d[（78.3±2.4）%]均明显减少，差异有统计学意义（P<0.001； P<0.01）。结论 慢性应激能明显抑制卒中后海马内源性神经干细胞的增殖和分化，可能是卒中后抑郁发病的因素之一。     

脑源性神经营养因子诱导大鼠骨髓基质细胞成为神经干细胞及其分化作用的实验研究

目的探讨脑源性神经营养因子（BDNF）诱导大鼠骨髓基质细胞（BMSCs）成为神经干细胞及其分化作用。方法取大鼠BMSCs。分别以BDNF和BDNF＋RA（维甲酸）作为诱导物诱导,于诱导3d、7d后行巢蛋白（Nestin）、神经元特异烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。结果后BDNF和BDNF＋RA诱导组均有大量Nestin染色阳性细胞,BDNF＋RA组阳性率高于BDNF组（P〈0．01）。NSE、GFAP免疫阳性细胞在诱导3d后也有少量表达。诱导7d后BDNF和BDNF＋RA诱导组Nestin阳性细胞明显减少．与诱导3d后比较差异有显著性（P〈0．01）,而NSE、GFAP阳性细胞敷增多,与诱导3b比较差异有显著性（P〈0．01）,且BDNF＋RA组阳性率高于BDNF组（P〈0．01）。结论联合应用BDNF与RA可提高BMscs神经转化．并促进其向神经元及星形胶质细胞细胞分化。     

缺血性脑损伤与神经干细胞的再生

脑缺血可在成年哺乳动物脑内诱发神经再生,这可能有潜在的治疗价值。本文阐述了脑缺血后神经干细胞的增殖、迁移、分化和整合情况及血管微生态的重要作用,分析了侧脑室下区、齿状回和其他部位的神经再生情况以及老年脑神经再生的特点。