缺氧对体外培养的鼠胚神经干细胞分化的影响

目的分离大鼠胚胎皮质神经干细胞（NSCs）进行体外培养,探讨缺氧对体外培养的鼠胚大脑皮质神经干细胞分化的影响。方法对孕14d（E14d）大鼠取鼠胚脑皮质用无血清培养技术分离培养神经干细胞,血清：培养基贴壁诱导分化。通过免疫细胞化学染色检测细胞分化情况;NSCs采用三气培养箱予以不同缺氧干预,缺氧培养后再用10％胎牛血清培养基进行贴壁分化,用MAP2免疫荧光染色检测缺氧对NSCs向神经元方向分化的影响。结果①大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;②缺氧干预实验中,5％O2组尤以72h组可诱导NSCs向神经元方向分化。结论从大鼠胚胎皮质可成功分离NSCs,缺氧可影响NSCs的分化,适度缺氧可诱导离体培养的大鼠脑皮质NSCs向神经元方向分化。     

大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞的培养和分化

目的探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体—巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果获得了大量能自我增殖并分化的神经干细胞,分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和少突胶质细胞三种神经组织细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞,其细胞核中可见荧光标记物。结论大鼠胚胎脊髓能分离、培养出神经干细胞,并能诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶细胞。     

小鼠胚胎神经干细胞体外培养及鉴定的实验研究

目的:探讨小鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法:分离孕13～15d的小鼠胚胎脑组织,在加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的B27无血清培养基中克隆培养,并用10%的胎牛血清诱导其贴壁分化,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白(Nestin),β-微管蛋白(β-tublin),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色,对神经干细胞(NSCs)及其分化的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞可形成典型的神经球,并传代。细胞表达神经巢蛋白,并可诱导分化为神经细胞和神经胶质细胞。结论:小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下大量增殖,并且具有多向分化潜能。     

胚胎神经上皮干细胞体外克隆增殖与分化的实验研究

目的观察胚胎神经上皮干细胞在体外克隆增殖和诱导分化的情况。方法取孕11 d大鼠的胚胎,经分离获得神经管上皮细胞,在无血清培养基内克隆、增殖、传代。取不同时期的神经球进行神经干细胞的鉴定和诱导分化,并通过免疫组织化学染色鉴定分化的结果。结果胚胎神经上皮干细胞在体外能够克隆、增殖,形成的神经球呈nestin阳性,在分化培养基内可分化为星型胶质细胞和神经元。结论胚胎神经上皮干细胞可在体外进行单细胞克隆和诱导分化。     

EPO对鼠胚脑皮质神经干细胞抗凋亡作用的研究

目的探讨促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）对体外培养神经干细胞（neural stem cells,NSCs）凋亡的影响,为NSCs移植治疗脑损伤和脑部疾病提供实验依据。方法孕14 d（El4）大鼠取鼠胚脑皮质悬浮培养、贴壁诱导分化。采用光电镜观察,用免疫细胞化学染色以Nestin蛋白作为鉴定NSCs的标记物,以MAP2、GFAP蛋白检测NSCs的分化。取第3代（P3）NSCs向悬浮培养基中分别添加不同剂量的EPO,EPO浓度分别为0.5U/ml,5U/ml,50U/ml,500U/ml,并设不添加EPO的对照组,通过Caspase-3蛋白检测NSCs的凋亡。结果 1）提取和分离E14d SD大鼠的胚脑皮质,在添加B27、bFGF、EGF的无血清培养基中培养,可形成大量悬浮的神经球并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈Nestin阳性、BrdU阳性。在添加10%胎牛血清的培养基中,神经干细胞可自然分化为神经元和神经胶质细胞。2）加入≥5U/ml EPO,神经球内Caspase-3的表达显著下降（P〈0.01）。结论 1）大鼠胚胎脑皮质体外培养可得到大量增殖的NSCs并能分化为神经元和神经胶质细胞,为NSCs的研究提供了适宜的细胞培养模型。2）加入≥5U/ml EPO可降低体外培养的鼠胚脑皮质NSCs的凋亡率。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和鉴定

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎端脑皮层在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体———巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。结果获得了大量自我增殖并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。结论成功分离并获得了大鼠胚胎端脑皮层神经干细胞,并连续稳定传代,具有多向分化潜能,可用于进一步的实验研究。     

神经干细胞球和单层贴壁神经干细胞的培养及鉴定

目的：探讨小鼠大脑皮层源性神经干细胞（NSCs）体外培养的两种方法并对培养的细胞进行鉴定。方法：分别取孕14-16d的昆明小鼠胚胎脑皮质并用细胞球悬浮培养和单层贴壁培养两种方法进行体外培养，用光学显微镜观察NSCs的生长情况，并用免疫细胞化学鉴定NSCs特异性抗原的表达，经过血清对NSCs分化诱导后进行胶质纤维酸性蛋白及微管相关蛋白．2的检测。结果：①培养出来的细胞可以扩增生长；②这两种方法分别培养的神经干细胞球和单层神经干细胞经抗巢蛋白免疫细胞染色均呈阳性；③两种培养方法培养出的NSCs经诱导分化后，免疫细胞化学染色显示微管相关蛋白-2、神经胶质酸性蛋白染色阳性。结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的神经干细胞球培养和单层贴壁两种培养技术，可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的NSCs。     

胚胎大鼠神经干细胞的培养及鉴定

目的：探讨胚胎大鼠神经干细胞培养，传及鉴定方法。方法：从胚胎大鼠脑室下区（SVZ）组织分离得到神经干细胞，采用无血清培养技术进行培养，并诱导分化，采用SABC法对分化后后的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸蛋白（GFAP）检测及姬姆萨染色进行细胞鉴定。结果：成功培养出了胚胎大鼠神经干细胞，培养出的细胞具有自我更新能力的增殖能力，可分化为神经元，神经胶质细胞及少突胶质细胞，结论：胚胎大鼠神经干细胞在体外适宜的培养条件下具有自我更新，增殖和多向分化潜能。     

胚胎大鼠纹状体区神经干细胞的体外培养

目的探讨胚胎大鼠纹状体区神经干细胞的培养、分化和鉴定技术。方法从胚胎大鼠纹状体区分离神经干细胞,用无血清培养技术进行体外原代培养、传代,加血清进行诱导分化。荧光免疫染色技术进行鉴定。结果从胚胎大鼠纹状体区分离出神经干细胞,并可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论采用该体外培养技术分离的纹状体区神经干细胞可在体外大量增殖,并有多向分化潜能。     

新生大鼠海马区神经干细胞分离培养和单细胞克隆系建立及鉴定

目的:分离培养新生大鼠海马区神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),建立NSCs单细胞克隆系。方法:取新生SD大鼠海马组织分离NSCs后无血清技术培养,建立其克隆系并行单细胞传代克隆培养。采用细胞免疫荧光和RT-PCR等技术对NSCs进行鉴定,分子标志物选择Nestin和Sox2。NSCs诱导分化的神经元的鉴定,标示物选择早期神经元特异性微管蛋白(β-tubulin),星形胶质细胞标示物为特异性胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),少突胶质细胞特异性标记蛋白为髓鞘相关蛋白(cyclic nucleotide phosphodiesterase,CNP)。结果:无血清培养法可维持NSCs生长和促进其增殖。成功建立NSCs单细胞克隆系,传代可获得大量亚克隆NSCs株团。单细胞克隆NSCs球团经早期酶消化结合后期机械吹打法传代,分散为单细胞或类单细胞后,增殖及分化能力依然存在。单细胞克隆系株经Nestin和Sox2细胞免疫荧光或RT-PCR检测均为阳性表达。在加有胎牛血清培养基条件下进行诱导分化,来自单细胞克隆系的细胞株同样可分化为神经元样、星形胶质细胞样和少突胶质细胞样3种神经细胞,即β-tubulin、GFAP、CNP免疫荧光染色分别呈阳性。结论:无血清培养可成功建立新生SD大鼠海马区NSCs单细胞克隆系,并可稳定传代增殖,并在一定条件下可诱导分化为成熟的神经元和神经胶质细胞。     

缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响.方法:随机选取新生1天(Q1组)、新生7天(Q7组)、新生14天(Q14组)大鼠各6只,分别缺氧2小时.将各组大鼠海马在无血清培养液中,进行原代、单克隆和传代培养;单克隆培养细胞进行巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色;传三代细胞诱导分化3d后...     

胎鼠脊髓神经干细胞分离培养及诱导分化

目的 探讨机械分离法与酶消化法在脊髓源性神经干细胞（NSCs）体外培养的优劣,并观察脊髓源性NSCs体外培养时增殖和分化的特点.方法 取妊娠第15天（E15 d）的胎鼠神经管组织,分别采用酶消化法和机械吹打分离法离散细胞,进行无血清培养,并以上述两种方法传代培养.借助免疫细胞化学法对NSCs及分化结果进行鉴定,细胞球计数法检测成球率,测量神经球直径分析细胞增殖能力,MTT法监测细胞生长情况.结果 ①培养的细胞具有增殖成球生长的特性并且抗巢蛋白免疫荧光阳性、血清可诱导分化出胶质细胞酸性蛋白（GFAP）、神经元特异性希醇化酶（NSE）阳性表达的细胞.②细胞直径：酶消化组（137.74±11.62）μm,机械分离组（143.69±12.20） μm（P ＞0.05）.③生长曲线结果显示酶消化组NSCs综合生长增殖能力较高,OD值：酶消化组（0.39 ±0.15）,机械分离组为（0.36±0.13）.结论 胎鼠脊髓组织中存在具有自我增殖和多分化潜能的NSCs,原代无血清成球培养时采用酶消化法更有利于获得较多NSCs.     

胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法新生1日龄大鼠禁食24 h后腹腔注射胰岛素50 u.kg-1,血糖值<1.0 mmol.L-1后取脑海马组织在含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和B27的无血清培养基中进行原代和传代培养,并分别对原代和传3代的细胞进行单克隆培养及诱导分化:单克隆培养细胞行巢蛋白(Nestin)免疫细胞荧光染色;诱导分化后的细胞分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞荧光染色,计数NSE阳性细胞比例。结果原代组培养细胞与传代组和对照组原代细胞相比生长较快;单克隆培养的细胞均Nestin阳性表达,诱导分化后的细胞分别呈NSE或GFAP阳性表达;原代组的细胞诱导分化为神经元的比例明显高于传代组和对照组(P<0.05);传代组的细胞诱导分化为神经元的比例与对照组传代细胞比较无统计学意义(P>0.05)。结论低血糖能够短暂地促进新生大鼠海马神经干细胞增殖及提高向神经元分化比例。     

TAG-1与神经干细胞分化的相关性研究

目的研究微环境蛋白TAG-1与神经干细胞分化之间的关系。方法使用免疫荧光染色检测神经干细胞中巢蛋白nestin的表达,并过表达TAG-1后使用实时荧光定量PCR技术分析神经干细胞中分化相关蛋白的表达变化。结果体外培养的神经干细胞中过表达TAG—1以后,干性相关基因nestin和转录因子SOX2（SRY—box2）表达降低,神经元标志物神经元微管蛋白β Ⅲ （neuronalclass Ⅲ β-Tubulin,Tujl）和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达升高。结论TAG-1可能与神经干细胞的分化存在正相关的关系,其分子调节机制有待进一步研究。     

新生大鼠海马神经元的改良培养

探讨体外培养高纯度神经元的方法。方法：体外培养新生大鼠海马神经干细胞,再使神经干细胞在无血清N2添加剂培养基条件下向神经元方向分化。结果：从新生大鼠海马组织培养出的神经干细胞,表达巢蛋白,神经干细胞的分化细胞绝大部分表达MAP2,极少数几个细胞表达GFAP。结论：通过本实验方法可获得高纯度的神经元,为后续实验奠定基础。     

不同脑区来源的成体大鼠神经干细胞体外增殖特性

目的：探讨成年大鼠神经干细胞的脑内分布及体外培养条件，增殖特性，为自体神经干细胞移植修复神经损伤提供理论依据。方法：分离成年大鼠纹状体，室区（VZ）和室下区（SVZ）的细胞，利用无血清培养技术培养并观察神经干细胞的生长规律，采用SABC法进行神经上皮干细胞蛋白（Nestin)，增殖细胞核抗原（PCNA）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）及胶质纤维酸蛋白（GFAP）检测，并作姬母萨染色，对细胞进行鉴定，结果：由成年大鼠纹状体，VZ和SVZ区获得的细胞群，均可在体外分裂增殖形成神经球，Nestin阳性，进一步分化后分别呈现NSE和GFAP阳性。结论：成年大鼠脑内特定区域具有存在神经干细胞。     

神经干细胞移植对大鼠脑自由落体撞击伤的治疗作用

目的通过神经干细胞(NSCs)移植治疗大鼠脑自由落体撞击伤,探讨NSCs对脑外伤功能恢复的影响。方法体外培养NSCs并用5-2溴脱氧尿嘧啶(B rdU)标记。自由落体撞击大鼠左侧大脑皮质运动感觉区以制作脑外伤模型,脑外伤后24h内移植NSCs,分别于脑外伤前、脑外伤后1、2、4周时行神经运动行为学评分(NMFE)和免疫组织化学染色检测B rdU、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷酯(GalC)蛋白表达。结果大鼠自由落体撞击伤后,右下肢神经运动功能障碍明显。神经运动行为学评分在第1周时,实验组与对照组无明显差异,而在第2、4周时,实验组的评分明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。第2、4周时实验组NSE、GFAP和GalC染色阳性细胞数多于对照组,nestin染色在第1周时表达最高,以后逐渐下降。B rdU阳性细胞在损伤灶中心区最高多,在损伤灶的远隔部位也有少许发现。结论NSCs移植有利于大鼠脑自由落体撞击伤后期的功能恢复。移植的NSCs可以在损伤部位存活并增殖分化与迁移。     

外源性重组HMGB1对神经干细胞增殖分化的影响及其机制研究

目的研究外源性重组高迁移率组蛋白B1（HMGB1）对神经干细胞增殖及分化的影响及其作用机制。方法在无血清的神经干细胞培养基中培养SD鼠大脑皮层细胞,传代扩增及纯化神经干细胞,免疫荧光检测神经干细胞标记物巢蛋白（nestin）,分析神经干细胞纯度。CCK-8测定加入不同浓度的重组HMGB1对神经干细胞增殖活性的影响,选择重组HMGB1的最适浓度进行后续实验;细胞免疫荧光检测重组HMGB1对神经干细胞分化的影响,Real-time PCR检测晚期糖基化终末产物受体（RAGE）mRNA、Toll样受体（TLRs）mRNA、基质金属蛋白酶9（MMP-9）mRNA、神经生长因子（NGF）mRNA的表达,Western blot检测RAGE、TLRs、MMP-9、NGF蛋白的表达。结果大鼠大脑皮层细胞在培养至第3代时,nestin鉴定神经干细胞纯度可达99%及以上。在重组HMGB1 10 ng/mL刺激下,神经干细胞增殖活性最高。实验组神经Ⅲ类β-微管蛋白（TUJ1）表达高于对照组(P<0.05),实验组RAGE、TLRs、MMP-9、NGF mRNA及蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。结论外源性重组HMGB1或可通过RAGE、TLRs、MMP-9等信号通路促进神经干细胞增殖及其向神经元方向分化。