组织工程学研究中偏光显微镜的应用

偏光显微镜是地质界用来观察晶体矿物的重要仪器。其理论基础是结晶光学，特点是即可观察结构，又可根据光学性质（折光率值不同）来判断成分。通过在研究ＮＥＣＭ和注射性胶原制作的过程中，用偏光显微镜和光镜观察同一部位的组织片，加以对比分析。因为胶原是生物体内的特殊“晶体”，故认为偏光显微镜应用在组织工程研究中，不仅开阔了观察领域，而且是重要的观测手段和方法。用偏光显微镜观察了猪骨ＥＣＭ胶原框架，以及注射性胶原制作过程中胶原变化特点。认为本方法简单不需染色，并可特异的观察到胶原的分布和走行。     

动物皮肤、肌腱、软骨和骨的ECM制作

细胞外基质（ＥＣＭ）研究是组织工程学的重要部分，即是重要基础研究内容，又是研究细胞外基质的替代物课题。针对目前临床上大量应用人工合成的ＥＣＭ存在的问题（炎性反应、排斥反应、相容性等），本研究试图用动物的组织（自然的）ＥＣＭ替代人工合成的ＥＣＭ。用组织工程学方法处理动物组织，获得的产物经ＨＥ、奥新蓝染色、光镜观察和不染色切片偏光显微镜观察，证实经处理后的动物组织ＥＣＭ仅剩下肌腱、皮肤、软骨和骨的胶原框架。     

动物皮肤,肌腱,软骨和骨的ECM制作

细胞外基质研究是组织工程学的重要部分，即是重要基础研究内容，又是研究细胞外基质的替代物课题。针对目前临床上大量应用人工合成的ＥＣＭ存在的问题（炎性反应，排斥反应、相容性等），本研究试图用动物的组织（自然的）ＥＣＭ替代人工合成的ＥＣＭ。用组织工程学方法处理动物组织，获得的产物经ＨＥ、奥新蓝染色、光镜观察和不染色切片偏光显微镜观察，证实经处理后的动物ＥＣＭ仅剩下肌腱、皮肤、软骨和骨的胶原框架。     

从NECM制取的可注射性胶原的生物学评价

从ＮＥＣＭ制取可注射胶原是从大分子降解为胶原分子，因此不需要交联剂和稳定剂。溶液中仅有胶原分子、无交联剂。本实验是将可注射胶原液注入大鼠尾部皮下组织内，共注射３０只，分三批杀死（１．５个月，３．０个月和半年），取注射部位的皮下组织作组织切片，染色（ＨＥ）、光镜观察（包括偏光显微镜）。     

从NECM制取的可注射性胶原的生物学评价

从ＮＥＣＭ制取可注射胶原是从大分子降解为胶原分子，因此不需要交联剂和稳定剂。溶液中仅有胶原分子，无交联剂。本实验是将可注射胶原液（１２０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ注入大鼠尾部皮下组织内，共注射３０只，分三批杀死（１．５个月，３．０个月和半年），取注射部位的皮下组织作组织切片、染色（ＨＥ）、光镜观察（包括偏光显微镜）。发现三组在注射部位皮下组织内均有胶原分散存在。半年时胶原量少而且排列有序，未见包裹现象。除１．５个月少数动物皮下组织内有轻度炎性反应外，其余均未见到炎性反应。无排斥反应。局部组织无坏死现象。实验认为：本法所制可注射胶原液在半年内未发现特殊的生物学反应，胶原未完全吸收。     

动物NECM的稳定性评价

“动物ＮＥＣＭ的制作”文章发表近半年，已制作好的动物皮肤、肌腱、软骨和骨的ＮＥＣＭ已在保存液中保存了１３个月。为了观察ＮＥＣＭ和保存液的稳定性，本文做了如下几个方面的研究：①保存液：未放置ＮＥＣＭ新配制的和已放置１年的保存液；放置ＮＥＣＭ的保存液（１９９７年２月）。上述保存液均做细菌培养、镜下观察和成分分析。②电镜和组织学光镜观察：１９９７年２月制作的ＮＥＣＭ的光镜观察；放置１３个月后的ＮＥＣＭ电镜和光镜观察（包括偏光显微镜）；新鲜的正常相应组织的电镜和光镜观察。实验结果证明：猪皮肤和牛肌腱的ＮＥＣＭ已无细胞成分，基质为平行排列的胶原纤维丝或松散的胶原纤维网。而正常组织中细胞完整，胶原纤维呈致密交叉的网状编织结构。保存液清晰，无细菌生长，成分未变。     

从皮肤的细胞外基质（NECM）中制取可注射胶原

常规制取注射性胶原的方法是用酶降解法，经反复酸提、盐析、离心、交联等步骤，进行纯化，该法将胶原降解，酶提取分子片断，用交联剂组成可注射胶原。本法是从ＮＥＣＭ开始制取，ＮＥＣＭ已为胶原框架，因此步骤简化很多，仅需解裂胶原网状结构，酶解末端蛋白以消除特异性，最后降解成３００ｎｍ左右胶原。本法不用交联剂和稳定剂。生物原材料来源广泛，有利临床推广应用。经半年动物实验证明，本法制取的可注射胶原无排斥反应和炎     

从皮肤的细胞外基质(NECM)中制取可注射胶原

常规制取注射性胶原的方法是用酶降解法，经反复酸提、盐析、离心、交联等步骤，进行纯化，该法将胶原降解，酸提取分子片断，用交联剂组成可注射胶原。本法是从ＮＥＣＭ开始制取，ＮＥＣＭ已为胶原框架，因此步骤简化很多，仅需解裂胶原网状结构，酶解末端蛋白以消除特异性，最后降解成３００ｎｍ左右胶原。本法不用交联剂和稳定剂。生物原材料来源广泛，有利临床推广应用。经半年动物实验证明，本法制取的可注射胶原无排斥反应和炎性反应，也无包裹现象，半年时仍残留有部分胶原     

肾病患儿免疫细胞对肾小球上皮细胞合成基质的影响

目的为了明确免疫细胞对肾小球上皮细胞（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌＧＥＣ）合成功能的直接作用。方法应用肾小球细胞体外培养，同位素掺入及放射免疫技术，以总胶原，层粘连蛋白，Ⅲ型前胶原及Ⅳ型胶原的合成为观察指标，动态研究了不同病理类型原发性肾病综合征（ＩＮＳ）患儿外周血单个核细胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌＰＢＭＣ）对ＧＥＣ生物功能的影响。结果（１）肾病极期未经激素治疗组（未治组）ＰＢＭＣ上清明显促进了ＧＥＣ合成层粘连蛋白；（２）未治ＰＢＭＣ上清抑制了ＧＥＣ合成总胶原；（３）未治组ＰＢＭＣ上清促进了Ⅲ型前胶原的合成，而对Ⅳ型胶原的合成无明显影响；（４）肾病患儿ＰＢＭＣ的上述作用与是否足量激素治疗有关，而与尿蛋白能否阴转、肾组织病理类型、肾病临床类型等无直线相关关系。结论原发性肾病患儿循环免疫细胞可影响ＧＥＣ合成细胞外基质的功能。免疫细胞的这种活性可被激素治疗改变。     

胆固醇结石的综合研究

为了探讨胆结石形成的机制，作者用立体显微镜、偏光显微镜、比重测定仪，油浸、电子显微镜、红外光谱仪、能谱仪、Ｘ射线衍射仪等现代观察测试方法对胆结石进行了综合研究，获得了有关胆固醇晶体的习性、偏光性、折光率、胆固醇结石的比重等数据。胆固醇结石的成分除胆固醇外尚含少量的Ａｌ，Ｓｉ，Ｆｅ，并在胆固醇晶体中发现有单质Ａｌ的包体，胆固醇结石形成属胶体成因，并经过重结晶作用，在一定程度上揭示了胆固醇结石形成的机     

血吸虫病鼠肝纤维化早期肝脏细胞外基质的改变

以免疫组化法（ＬＳＡＢ法），辅以电镜，观察感染血吸虫尾蚴６、８周小鼠肝脏细胞外基质（ＥＣＭ）中Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤粘连蛋白（ＦＮ）、层粘连蛋白（ＬＮ）的表达与分布。发现肝门管区、肝窦壁及中央静脉壁有ＥＣＭ异常聚积，电镜可见Ｄｉｓｓｅ腔有纤维束，可形成门管区纤维化、肝窦毛细血管化和中央静脉硬化。表明ＥＣＭ在血吸虫病性肝纤维化的形成与发展中起重要作用。     

肾小球硬化及老年肾细胞外基质的变化研究

本文通过一侧肾切加重复阿霉素注射制作加速肾小球硬化大鼠模型，应用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）对分离的肾小球内细胞外基质［胶原Ⅲ、胶原Ⅳ、层粘连蛋白（ＬＮ）和纤维连结蛋白（ＦＮ）］进行了硬化过程动态的定量研究，并将正常鼠（３月）和老年鼠（２６月）作了比较。结果显示，胶原Ⅲ在正常鼠肾小球内用ＥＬＪＳＡ方法未检测到；疾病所致的肾小球硬化过程胶原Ⅲ持续增加，弥漫性肾小球硬化期，较正常肾增加１１．８倍。胶原Ⅳ、ＬＮ和ＦＮ为正常肾小球内存在的细胞外基质（ＥＣＭ），在肾小球硬化的早、中期明显增加；弥漫性肾小球硬化期分别为正常肾的１２．３、１６．３和５．１倍。老年鼠与正常鼠相比，胶原Ⅲ无显著性变化（Ｐ＞０．０５），胶原Ⅳ、ＬＮ和ＦＮ分别为正常鼠的９．１、１０．０和２．８倍。本研究证实，ＥＣＭ的积聚是肾小球硬化过程中重要的病理特征，胶原Ⅲ（一种间质胶原）似与疾病所致的肾小球硬化发展有更密切和直接的关系。     

注射胶原的临床应用

注射胶原的临床应用辽宁省人民医院整形外科（１１００１５）汪晓蕾，王志军，高景恒胶原是细胞外基质（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘＥＣＭ）中的主要结构蛋白［１］，广泛存在于人体及动物体内，目前主要来源是人和牛［２］，提取后的可注射胶原移植物（Ｉｎ...     

TNFα与病理性瘢痕中成纤维细胞胶原的关系

增生性瘢痕及瘢痕疙瘩是较常见的病理性瘢痕。其形成是由于创伤愈合过程中成纤维细胞合成胶原能力增强，导致细胞外基质（ＥＣＭ）增多和过度沉积，胶原为其主要成分。已发现多种细胞因子在创伤愈合和瘢痕形成中具有重要作用，本文就ＴＮＦα与病理性瘢痕的研究进展作一简...     

天然神经细胞外基质桥接周围神经缺损的实验研究

周围神经缺损的修复一直是困扰临床医生的一个难题，为此我们尝试了用组织工程方法修复周围神经缺损的实验研究，旨在了解天然神经细胞外基质（Ｎａｔｕｒｅ ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｉｘ，ＮＥＣＭ）在神经再生中的作用，为临床修复周围神经缺损寻求新的替代材料。实验用ＳＤ大鼠４８只各组１２只分别用ＮＥＣＭ，自体坐骨神经；腹壁浅静脉桥接坐骨神经１０ｍｍ缺损，空白对照组缺损旷置。术后８周，观察运动功能、再生     

免疫电镜技术研究肾小球硬化过程中细胞外基质的变化

为探讨肾小球硬化机制，应用胶体金免疫电镜技术对重复阿霉累注射加一侧肾切除所诱发的进行性肾小球硬化模型中细胞外基质（ＥＣＭ）成份－Ⅲ型、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白（ＬＮ）和纤维连结蛋白（ＦＮ）进行了定位、定量、定性的研究，并对肾小球基底膜（ＧＢＭ）和系膜区上述成份的正常分布及硬化过程中的变化作了比较。结果显示：正常鼠ＬＮ、ＦＮ在系膜区和ＧＢＭ中的含量有显著性差异（Ｐ＜０．０１），而Ⅳ型胶原则基本相同，这三种成份在ＧＢＭ分布有一定的规律。肾小球硬化过程中ＬＮ、ＦＮ、Ⅳ型胶原明显积聚，弥漫性肾小球硬化期与正常鼠相比，增加幅度为１．０～３．２倍（Ｐ＜０．０１）；肾小球硬化后期ＧＢＭ内不再显著增加，而系膜区内则持续增加．正常肾小球内不存在的Ⅲ型胶原在硬化早期无明显积聚，其后急聚增多至弥漫性肾小球硬化期。与对照组相比，ＧＢＭ与系膜区Ⅲ型胶原分别增加了１３．９及３２．３倍。我们用该技术证实了ＥＣＭ成份积聚是肾小球硬化的基本病理特征。Ⅲ型间质胶原从无至有，增加幅度最大，似提示与肾小球硬化有更直接、密切的关系。     

骨延长区组织愈合过程中胶原变化的偏光显微镜观察

目的观察骨延长区骨组织修复过程中胶原变化特点及规律. 方法健康新西兰白兔27只,制成左胫骨中段骨延长模型,于术后第5天以1.5 mm/d延长,共延长14 d.于延长结束时,延长结束后7、14、21、30、40、50、60和70 d分批处死动物,取材(n=3).石蜡包埋切片,饱和苦味酸天狼星红染色,偏光显微镜观察新骨组织的胶原变化. 结果延长区胶原变化主要有以下特点:①在延长结束时及延长结束后的早期纤维组织中,除Ⅲ型胶原外,还含有大量Ⅰ型胶原;②在软骨组织中有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原;③假性生长板中存在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原;④骨延长区新骨再生与修复的后期Ⅰ型胶原占绝对优势. 结论骨延长区的骨组织修复是在牵张应力下进行的,其胶原变化显示出与骨折愈合不同的特点;饱和苦味酸天狼星红染色后,在偏光显微镜下可清晰地区分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原,为研究骨组织修复过程中胶原变化的分型提供了新的方法.     

成年大鼠破骨细胞体外培养及细胞凋亡的观察

目的　为研究骨重建过程中破骨细胞的关键作用,建立成年大鼠（１２ ～５０ 周龄） 破骨细胞的体外培养方法并进行细胞凋亡观察。方法　大鼠处死后,在无菌条件下取出股骨,剪去两骺端,以αＭＥＭ 将骨髓细胞冲洗出, 并离心洗细胞２ 次,置于αＭＥＭ 培养液,内含αＭＥＭ,体积分数为１０％ 的胎牛血清（ＦＣＳ） 和１α,２５（ＯＨ）２ Ｖｉｔ Ｄ３ １０ －８ ｍｏｌ／Ｌ,在２４ 孔板内,以体积分数为５ ％ 的ＣＯ２ ,３７ ℃,培养８ 天。按原位ＤＮＡ 末端标记（ＴＵＮＥＬ）检测试剂盒方法染色细胞,以荧光显微镜观察细胞凋亡。结果　经活体观察、ＨＥ染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（ＴＲＡＰ） 染色,光学显微镜、扫描电镜观察骨片之陷窝的形成,证实培养的细胞为破骨细胞;ＴＵＮＥＬ 检测,荧光显微镜下可见破骨细胞核染色质浓缩、裂解等凋亡细胞的典型变化与未凋亡的破骨细胞。结论　本实验建立了成年大鼠破骨细胞的体外培养方法并进行细胞凋亡观察。     

系膜增生性肾炎患者血清C Ⅳ、LN的变化及意义

系膜增生性肾炎 (ＭＳＰＧ)是以肾小球系膜细胞增生及系膜基质增厚为主要表现的一组疾病 ,细胞外基质 (ＥＣＭ)聚集、系膜细胞的增生是造成肾小球纤维化、硬化的基础 ,血清Ⅳ型胶原 (ＣⅣ )、层粘连蛋白 (ＬＮ)是ＥＣＭ和病理肾基底膜的重要化学成分。研究表明 ,肾小球疾病的发展过程中 ,ＣⅣ、ＬＮ伴有合成和降解的异常 ,因此对ＭＳＰＧ患者血清ＣⅣ、ＬＮ的研究能进一步提高对ＭＳＰＧ发病机制的认识 ,对判定疾病的发展及肾脏病理的严重程度有重要意义 ,我们对ＭＳＰＧ患者血清ＣⅣ、ＬＮ进行了检测并分析了二者水平与肾脏病理及肾功能的…     

动物NECM的稳定性评价

“动物ＮＥＣＭ的制作”文章发表近半年，已制作好的动物皮肤、肌腱、软骨和骨的ＮＥＣＭ已在保存液中保存了１３个月，为了观察ＮＥＣＭ和保存液的稳定性，本文做了如下几个方面的研究：（１）保存液：未放置ＮＥＣＭ新配制的和已放置１年的保存液；放置ＮＥＣＭ的保存液（１９９７年２月）。上述保存液均细菌培养，镜下观察和成分分析。（２）电镜和组织学光镜观察；１９９７年和２月制作的ＮＥＣＭ的光镜观察；放置１３个月后的Ｎ