RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的实验研究

目的 应用RNA干扰技术构建一个载体同时编码四个基因,即血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶的短发夹重组质粒,并与单基因质粒做对比,通过体内外实验,研究其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶并含荧光素标记的短发夹RNA质粒命名为P-1,并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶的质粒,分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5,分别将其将转染人鼻咽癌CNE-2Z细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在CNE-2Z细胞及瘤体内的转染及表达情况.四甲基偶氮噻唑蓝法检测细胞增殖活性,实时PCR在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果,Trans well侵袭小室模型观察导入CNE-2Z细胞对其恶性生物学行为的改变,流式细胞仪观察各组凋亡率,体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果.结果 多基因干扰质粒转染鼻咽癌细胞后,CNE-2Z细胞增殖受到明显抑制,体外侵袭能力显著下降(P值均＜0.05).实时PCR证实多基因组4个不同基因mRNA表达均降低,免疫印迹技术验证目的基因蛋白同时表达下调.流式细胞仪结果证明多基因凋亡率明显高于单基因组(P值均＜0.05).体内抑瘤实验表明,与阴性组和空白组相比,P-1组移植瘤生长明显受到抑制(P＜0.05),并且多基因质粒抑制肿瘤细胞增长的作用要强于单基因干扰质粒(户值均＜0.05).结论 同时干扰多个基因能有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌基因治疗奠定了良好的实验基础.     

microRNA抑制鼻咽癌VEGF基因表达的实验研究

目的:观察人工构建的microRNA对鼻咽癌CNE-2细胞VEGF基因表达的调控效应,探讨microR-NA在鼻咽癌基因治疗中的应用前景.方法:构建靶向VEGF基因的microRNA表达质粒,脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞,RT-PCR检测转染细胞中VEGF基冈的mRNA水平,Western Blotting法观察microRNA对VEGF蛋白表达水平的调控效应,CCK-8比色法检测靶向VEGF的人工构建microRNA对鼻咽癌细胞生长的抑制作用,皮下注射稳定转染microRNA质粒的CNE-2细胞,构建裸鼠移植瘤模型,观察肿瘤牛长情况.结果:在mi-croRNA表达质粒转染CNE-2细胞后,VEGF的mRNA表达水平下调,蛋白表达水平降低,但是光镜和荧光显微镜下的初步观察显示CNE-2细胞牛长未发生变化,以CCK-8比色法检测的细胞增殖抑制率也无明显改变,而在初步的裸鼠移植瘤实验中,发现调控VEGF表达的microRNA重组质粒能有效抑制肿瘤生长.结论:人工构建表达microRNA的质粒,可在鼻咽癌CNE-2细胞中有效F调VEGF基因的表达水平,抑制裸鼠移植瘤的生长,为鼻咽癌基因治疗研究奠定了一定的基础.     

microRNA抑制鼻咽癌hTERT基因表达的实验研究

目的观察microRNA对鼻咽癌CNE-2细胞hTERT基因表达的调控效应，探讨microRNA在鼻咽癌基因治疗的应用前景。方法构建靶向hTERT基因的microRNA表达质粒，脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞，RT-PCR检测转染细胞中hTERT基因的mRNA水平，Western Blotting观察microRNA对hTERT蛋白表达水平的调控效应，CCK-8比色法检测microRNA对细胞生长的抑制作用，流式细胞学检测miRNA诱导细胞凋亡的作用。结果在mcroiRNA表达质粒转染CNE-2细胞后，hTERT的mRNA表达水平下调，蛋白表达水平降低，细胞周期在G0～G1期受阻，并诱导细胞凋亡。结论microRNA可在鼻咽癌中有效下调hTERT基因的表达水平，抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡，为鼻咽癌基因治疗研究奠定了一定的基础。     

小干扰RNA对喉鳞状细胞癌裸鼠移植瘤增殖细胞核抗原及p53蛋白表达的影响

目的：应用小干扰RNA（siRNA）技术抑制裸鼠喉癌皮下移植瘤人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨移植瘤中增殖细胞核抗原（PCNA）及p53蛋白表达的变化。方法：根据hTERT cDNA序列构建表达短发夹RNA（shRNA）的、靶向hTERT mRNA的真核表达质粒pshRNA,其载体质粒含荧光素报告基因。建立人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株裸鼠皮下接种模型,将pshRNA转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况。以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤体内的表达;以免疫组织化学SP法检测PCNA及p53蛋白在肿瘤内的表达。结果：所有裸鼠均接种成功,5d后可见皮下肿瘤形成,14d左右肿瘤直径达5～7mm。pshRNA及空质粒载体转染入瘤体后,共聚焦显微镜下见癌组织中有绿色荧光表达。病理学检查发现：pshRNA组肿瘤生长受到抑制,细胞分裂少见,可见大量癌细胞坏死。与注射生理盐水的对照组比较,转染质粒完毕后7d抑瘤率为76．50％,P〈0．01。pshRNA治疗后瘤体内PCNA蛋白表达显著下调（P〈0．05）,p53蛋白表达显著上调（P〈0．05）。结论：靶向hTERT mRNA的shRNA可显著抑制人喉癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能是诱导PCNA下调,促进p53蛋白表达所致。     

pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建靶向人ABCG2基因的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒,运用RNA干扰下调ABCG2基因在鼻咽癌细胞系CNE-2中的表达,并筛选出其基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法:针对ABCG2基因的mRNA序列设计3个干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,用脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞,用real-time PCR和Western blot检测ABCG2基因在mRNA和蛋白水平的抑制效果.结果:经测序证实,成功构建pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒.重组质粒转染CNE-2细胞后,ABCG2基因的mRNA水平及蛋白表达水平明显下调,其中以1号重组质粒效应最强,mRNA水平下调75%,蛋白水平下调68%.结论:成功构建以人ABCG2为靶向的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2的重组质粒.其对鼻咽癌CNE-2细胞中ABCG2的表达具有显著抑制效应,为进一步研究ABCG2在CNE-2细胞中的功能和鼻咽癌的基因治疗奠定了基础.     

沉默survivin抑制喉癌细胞Hep-2生长的实验研究

目的 探讨沉默survivin对喉癌细胞Hep-2生长的影响.方法 将重组质粒(psi-survivin)和阴性对照质粒(psi-scramble)用脂质体包裹转染人喉癌细胞株Hep-2,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)从mRNA和蛋白水平检测survivin的表达.四甲基偶氮唑蓝(MTT)观察喉癌细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡.建立裸鼠喉癌移植瘤模型,将psi-survivin和psi-scramble注射于肿瘤周围,观察其抗肿瘤的效果.免疫组化法和Western blot法检测重组质粒对肿瘤Survivin蛋白表达的影响.末端脱氧核苷酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记技术(Tunel)观察肿瘤细胞的凋亡.结果 psi-survivin不仅在mRNA水平(抑制率为54.4%),而且蛋白水平也抑制Survivin表达,抑制率为37.0%.MTT证实psi-survivin明显抑制喉癌细胞的增殖,抑制率达71.7%.流式细胞仪结果显示psi-survivin组细胞凋亡明显增加,凋亡率达(13.05±0.56)%((-x)±s,下同).体内实验表明,质粒注射后第32天,盐水组瘤体积为(1443.9±230.5)mm3,psi-scramble组为(1348.5±198.4)Rim3,而psi-survivin组为(624.6±188.4)mm3,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-5.917,P＜0.01).psi-survivin能明显抑制肿瘤survivin的表达,抑制率为41.8%,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-80.343,P＜0.01).Tunel染色结果显示psi-survivin组肿瘤组织中出现较多凋亡细胞,而对照组未见凋亡细胞.结论 沉默survivin能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长.     

胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶-磷酸核糖基转移酶融合基因/5-氟胞嘧啶治疗鼻咽癌的实验研究

目的研究胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖基转移酶融合基因/5-氟胞嘧啶(fusion cytosine deaminase- uracil phosphoribosyl transferase gene/5-Flurocy- tosine,FCU/5-FC)对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效应以及对鼻咽癌移植瘤生长的抑制作用。方法构建表达质粒载体pcDNA3．1(-)CMVe·Egr-1·FCU,BamHⅠ酶切鉴定重组质粒,分析FCU基因和融合启动子CMVe·Egr-1的序列。电穿孔法将重组质粒转染CNE-2细胞,300μg/ml～600μg/mlG418筛选14天获得稳定表达FCU基因的CNE-2细胞,RT-PCR鉴定FCU基因的表达。以转染空白载体pcDNA3．1(-)的CNE-2细胞为对照,MTT法观察5-FC对表达FCU基因的CNE-2细胞生长的抑制作用,考察FCU基因的细胞旁杀效应。5×10~6的CNE-2细胞接种裸鼠右腋下,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,12天后将裸鼠随机分成3组：CU组,CU+PBS组和CU+5-FC组,观察不同处理对移植瘤生长的抑制作用。结果酶切和序列分析证明重组质粒含完整的FCU基因和Egr-1启动子的核心序列,RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出330bp的预期片段。表达FCU基因的CNE-2细胞在5-FC干预下,生长受到抑制。随着表达FCU基因的细胞比例增加,细胞存活率相应地下降。CU组,CU+PBS组移植瘤体积与CU+5-FC组有显著性差异(P＜0．05)。结论表达FCU基因的CNE-2细胞可以被5-FC杀伤,FCU/5-FC系统抑制了移植瘤生长,为治疗鼻咽癌提供了新的策略。     

增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨改良构建人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit promoter,hTERT)启动子及巨细胞病毒原核(cytomegalovirus,CMV)增强子联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(thymidine kinase,TK)的增强型表达载体在鼻咽癌细胞体内外实验中的靶向杀伤效应及体内应用的安全性评价.方法 以pGL3-basic空载体为模板,分别酶切连接hTERT启动子、CMV增强子及TK基因构建靶向性增强型表达载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV(以hTERT单启动子调控TK基因表达载体作为对照组),转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞及用做对照组的人乳腺癌MCF-7细胞和端粒酶阴性的正常人脐静脉内皮细胞ECV-304,分别采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达差异、实时荧光定量PCR检测转染后TK基因mRNA表达差异、TeloChaser法检测上述细胞中的端粒酶活性、四甲基偶氮唑蓝(MTt)联合Boyden小室实验分析增强型载体对鼻咽癌细胞增殖及侵袭抑制的作用.将鼻咽癌细胞接种于裸鼠腋部皮下,构建裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,研究增强型载体对裸鼠移植瘤的体内生长抑制作用及对全身的毒副反应情况.结果 ①成功改良构建hTERT/CMV双调控TK基因的增强型表达载体.②转染增强型载体组及单启动子载体组的鼻咽癌5-8F细胞均有绿色荧光表达,但前者荧光数量及强度均较后者强,对照组端粒酶阳性的乳腺癌细胞也有很强的荧光表达,而ECV-304细胞几乎无绿色荧光表达.实时荧光定量PCR结果显示,增强型载体组的TK基因mRNA表达量是单启动子组的2-5倍.③ TeloChaser法结果显示,两种肿瘤细胞(5-8F细胞、MCF-7细胞)端粒酶活性均为阳性,正常对照ECV-304细胞端粒酶活性为阴性.④MTT联合Boyden小室侵袭实验结果显示,增强型表达载体对5-8F细胞体外增殖及侵袭力均有明显抑制作用.相对细胞存活率为37.0%,较对照组明显低(P<0.01).⑤体内实验结果显示,增强型靶向表达载体对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长具有明显抑制作用,抑瘤率达56.3%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),而裸鼠肝肾病理检查未发现明显损害.结论 以hTERT/CMV双调控机制介导TK基因的增强型表达载体能够高效、靶向杀伤鼻咽癌细胞及移植瘤,实验动物体内应用无明显毒副作用.     

RNA干扰抑制c-Met表达对喉癌Hep-2细胞体内外生长的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人喉癌Hep-2细胞c-Met基因表达,观察对其体外生物学活性和体内生长的影响.方法 构建能够表达针对c-Met的小干扰RNA的RNAi质粒和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂将其转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT-PCR及Western Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力.在裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c-Met-siRNA基因治疗实验中,采用Western Blot法检测重组质粒对c-Met基因及MMP-9、VEGF基因表达的影响.结果 pSilencer2.0/c-Met-shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c-Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P值分别为0.003和0.02),细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制(P值分别为0.001,0.004和0.004).肿瘤接种到裸鼠后第35天,重组质粒组肿瘤体积为(138±27)mm~3,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);重组质粒组瘤体内c-Met、MMP-9、VEGF基因表达率比对照组明显降低(P<0.05).结论 c-Met-siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动、侵袭及移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略.     

EGCG联合放疗治疗鼻咽癌裸鼠移植瘤模型

目的 研究表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对鼻咽癌裸鼠移植瘤放疗的增敏效应及survivin和VEGF的表达及意义.方法 体外培养低分化鼻咽癌CNE-2细胞,接种于20只雄性裸鼠皮下,待肿瘤结节约4～6 mm时,随机分为生理盐水组、EGCG组(30 mg/kg)...     

亚砷酸联合顺铂对人鼻咽癌裸鼠移植瘤及增殖细胞核抗原和Ki-67的影响

目的　研究亚砷酸（As2O3）对人鼻咽癌CNE-2Z裸鼠移植瘤与增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclearantigen,PCNA）、Ki-67的作用,探讨该药物的抗肿瘤机制。方法　建立人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,随机分为对照组（NaCl）组、As2O3组、顺铂（Cisplatin,DDP）组和As2O3+DDP组,观察裸鼠移植瘤生长情况;采用HE染色,于光镜下观察各组移植瘤组织细胞病理形态学变化,同时观察心、肝、肺、肾组织有无病理学改变及瘤细胞转移。进行血常规检测,采用免疫组织化学方法检测PCNA、Ki-67的表达。结果　As2O3、DDP及两药联用均明显抑制人鼻咽癌裸鼠移植瘤生长,裸鼠的心、肝、肺和肾未见病理学改变和瘤转移,联合用药未增加造血系统的毒性,并能下调PCNA和Ki-67的表达。结论　亚砷酸可抑制人鼻咽癌CNE-2Z裸鼠移植瘤的生长,此作用可能与下调PCNA、Ki-67的表达相关。     

干扰hTERT基因慢病毒载体对人鼻咽癌细胞的生长抑制作用

目的:本课题利用RNA干扰(RNAi)技术,研究短发夹RNA (siRNA)抑制人端粒酶逆转录酶( hTERT)基因表达对鼻咽癌细胞生长的抑制作用.方法:根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA的特异的、含荧光素基因的真核表达载体,包装成慢病毒.实时定量PCR及Western blot分析染细胞hTER...     

自杀基因载体对体外鼻咽癌细胞杀伤作用的研究

目的检测pcDNA3.1-Egr-CD（简写为pEC）、pcDNA3.1-hTERT-Survivin（简写为pTS）、pcDNA 3.1-Egr-CD-hTERT-Survivin（简写为pEC-TS）真核表达载体对体外鼻咽癌细胞杀伤作用。方法 pEC、pTS、pEC-TS真核表达载体分别转染CNE-2细胞,在放射线照射后用RT-PCR检测和比较胞嘧啶脱胺酶（CD）、Survivin基因的表达,并通过高效液相色谱（HPLC）检测前体药物5-FC转化成5-FU转化效率。结果检测发现用pEC、pEC-TS转染的CNE-2细胞中CD有效表达,HPLC检测前体药物5-FC转化成5-FU;pTS、pEC-TS转染的CNE-2细胞中Survivin基因表达明显降低。结论在CNE-2细胞转染pEC-TS载体后,CD基因能将5-FC转化成5-FU,并通过hTERT启动子特异性降低Survivin基因的表达,有效的提高了CNE-2肿瘤细胞对5-FU的敏感性;为鼻咽癌基因治疗提供了一种新的思路。     

短发夹RNA抑制hTERT基因对鼻咽癌细胞端粒酶活性及PCNA和Caspase-3蛋白表达的影响

目的:研究靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA)对鼻咽癌细胞系(CNE)端粒酶活性及PCNA、Caspase-3蛋白表达的影响.方法:构建表达靶向hTERT mRNA特异的shRNA的质粒pEGFP-shTERT.将pEGFP-shTERT转染CNE细胞,TRAP PCR-ELISA法检测端粒酶活性,MTT法测定细胞增殖活性,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blotting检测蛋白表达.结果:pEGFP-shTERT成功转染入CNE细胞后, 端粒酶活性显著下降;细胞增殖活性明显受抑制;大量细胞凋亡;处理后24及48 h,PCNA蛋白下调至64.41%、58.67%(P<0.05),Caspase-3上调到1.55、1.60倍(P<0.05).结论:shRNA靶向抑制hTERT基因在鼻咽癌CNE细胞系中的表达,能显著地抑制细胞的端粒酶活性,调节PCNA和Caspase-3蛋白表达,从而抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡.端粒酶、PCNA和Caspase-3共同参与了鼻咽癌的发生、发展过程.     

hTERTp在鼻咽癌中放射敏感性的研究

目的观察放射干预对人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）启动子启动活性以及鼻咽癌靶向调控的影响。方法利用基因重组技术构建pGL-3-hTERTp质粒以及pcDNA3．1．hTERT．CD／UPRT质粒,脂质体介导重组质粒pGL-3-hTERTp转染鼻咽癌CNE-2细胞以及人成纤维皮肤细胞（HDF）,并给予不同剂量放射干预,双荧光素酶活性分析其启动活性变化。pcDNA3．1．hTERT．CD／UPRT质粒转染鼻咽癌CNE-2细胞;运用RT-PCR以及免疫印迹法检测不同放射剂量下自杀基因表达。结果接受放射干预后,hTERT启动子活性明显增强,给予2、6、10Gy放射干预后,其启动活性分别增加了10倍、19倍和34倍,其差异有统计学意义（P〈0．01）。HDF组无论放射与否,其测量值与pGL-3Basic质粒无统计学差异（P〉0．05）。pcDNA3．1．hTERT．CD／UPRT质粒转染CNE-2细胞后,放射剂量增加至6、10Gy检测到目的基因表达。结论放射干预可提高hTERT启动子在鼻咽癌CNE-2细胞中的启动活性,且对其肿瘤特异性无影响。以放疗为主的肿瘤治疗中,hTERT启动子可能为潜在靶向性基因治疗的备选因子。     

Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 is a potential oncogene in nasopharyngeal carcinoma

IntroductionSerum- and glucocorticoid-inducible kinase 3, a serine/threonine kinase that functions downstream of the PI3K signaling pathway, plays a critical role in neoplastic processes. It is expressed by various tumors and contributes to carcinogenesis.ObjectiveThe objective was to investigate serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 expression in nasopharyngeal carcinoma, to study the anti-tumor effects of serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 shRNA by inhibiting its expression in nasopharyngeal carcinoma cells and to discuss the potential implications of our findings.MethodsSerum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 protein expression in nasopharyngeal carcinoma cell lines (CNE-1, CNE-2, HNE-1, HONE-1, and SUNE-1) and the human immortalized nasopharyngeal epithelium cell line NP69 were assayed by western blotting. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 expression in 42 paraffin-embedded nasopharyngeal carcinoma tissues were performed by immunohistochemistry. MTT assay, flow cytometry, and scratch tests were performed after CNE-2 cells were transfected with the best serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 shRNA plasmid selected by western blotting using lipofectamine to study its effect on cell proliferation, apoptosis, and migration.ResultsSerum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 was overexpressed in human nasopharyngeal carcinoma tissues and cells. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 expression decreased markedly after CNE-2 cells were transfected with the serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 shRNA, leading to strong inhibition of cell proliferation and migration. In addition, the apoptosis rate increased in CNE-2 cells after serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 knockdown.ConclusionSerum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 expression was more frequently observed as the nasopharyngeal epithelium progresses from normal tissue to carcinoma. This suggests that serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 contributes to the multistep process of NPC carcinogenesis. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 represents a target for nasopharyngeal carcinoma therapy, and a basis exists for the further investigation of this adjuvant treatment modality for nasopharyngeal carcinoma.