牛乳中β-乳球蛋白的仿生亲和纯化

目的研究牛乳中β-乳球蛋白的仿生亲和分离技术。方法从仿生亲和介质库中筛选亲和配体,并进行吸附条件优化。结果得到可以特异吸附乳球蛋白的固定化三乙烯四胺亲和配体,确定最佳结合缓冲液为10mmol/L磷酸盐缓冲液(含0.15 mmol/L NaCl,pH7.0),在此条件下,可实现一步从牛乳中纯化乳球蛋白,其纯度达到95%以上,回收率为83.35%。测定得到固定化三乙烯四胺的最大吸附容量为52.54 mg/g干介质。结论固定化三乙烯四胺亲和介质可从牛乳中纯化出高纯度β-乳球蛋白,且纯化流程简便,介质吸附量较大(52.54 mg/g干介质),适合工业化生产。     

重组人乳铁蛋白大鼠致畸试验

<正>利用转基因与体细胞克隆技术培育高效表达重组人乳铁蛋白的转基因奶牛,转基因奶牛泌乳时重组人乳铁蛋白分泌至牛奶中。通过牛奶的收集、预处理、层析分离、病毒灭活与去除、超滤浓缩与缓冲液置换、无菌过滤、冷冻干燥等工艺步骤,获得纯度大于95%的重组人乳铁蛋白~([1-3])。现有的重组人乳铁蛋白毒理研究资料表明,重组人乳铁蛋白为无毒;同时也并不存在     

重组人Siglec-1蛋白的制备及基于超滤亲和-液质联用技术天然配体的筛选

目的 构建唾液酸免疫球蛋白凝集素1（Siglec-1）原核表达载体,表达纯化Siglec-1重组蛋白,构建超滤亲和-液质联用技术（UF-LC-MS）筛选 Siglec-1蛋白天然配体。方法 利用 DNA重组技术构建 Siglec-1重组蛋白原核表达载体,转化到BL21（DE3）感受态细胞中表达Siglec-1重组蛋白,通过Ni柱亲和色谱柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分析Siglec-1重组蛋白纯度。建立UF-LC-MS技术研究金银花、甘草、迷迭香、菊苣中6个主要组分绿原酸、迷迭香酸、阿魏酸、甘草酸、甘草次酸、菊苣酸对 Siglec-1蛋白的亲和力,通过比较样品组和蛋白变性组超滤液中待测物的峰面积,计算各待测物特异结合率。结果 经双酶切及测序鉴定证明,重组表达质粒 pET-22b-Siglec-1-His构建正确;纯化的人Siglec-1重组蛋白质量分数达90%以上;建立了UF-LC-MS筛选体系,筛选出甘草次酸可与Siglec-1蛋白特异性结合。结论 成功表达了高纯度、高产量的人Siglec-1重组蛋白,筛选出甘草次酸可与Siglec-1蛋白特异性结合。     

日本医蛭中一种新抗凝血蛋白质的仿生亲和纯化及鉴定

目的从日本医蛭中快速提取和纯化生物活性蛋白质。方法利用仿生亲和介质库进行配体筛选和1步纯化。结果从日本医蛭中纯化出了1种具有抗凝血活性的新型低丰度蛋白质,命名为NLP-1(New Leech Protein-1)。通过进一步分析,其相对分子质量为13800,蛋白回收率可达到69.2%,其在血浆中含量为0.02 mg/mL时即可产生明显的抗凝血现象。利用MALDI-TOF-TOF分析,在蛋白质数据库中未找到相似蛋白质或多肽。结论从日本医蛭中纯化出的NLP-1蛋白质是1种新型的抗凝血物质,具有很高的开发研究价值。     

重组人Tim-3蛋白的制备及基于亲和超滤-液质联用技术的天然配体筛选

目的 构建人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（Tim-3）-His表达载体，表达纯化Tim-3重组蛋白，建立亲和超滤-液质联用技术筛选Tim-3蛋白天然配体。方法 利用DNA重组技术构建人Tim-3-His表达质粒，转染HEK293细胞表达Tim-3重组蛋白，通过Ni柱亲和色谱柱进行蛋白纯化，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析Tim-3重组蛋白纯度。10 μL受试物（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、白术内酯Ⅰ、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮）溶液、180 μL磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4，50 mmol·L^-1）与10 μL Tim-3（0.84 mg·mL^-1）混合，在37℃黑暗孵育1 h后，转移至1×10⁴超滤离心管中以12 000 r·min^-1离心10 min ，将沉淀加入200 μL甲醇-水（90∶10）中室温解离10 min，12 000 r·min^-1离心10 min，收集滤液，进行UPLC-MS/MS分析。通过比较受试物组和Tim-3蛋白变性组中超滤液中待测物的峰面积，计算各待测物特异结合率。结果 经双酶切及测序鉴定证明，人Tim-3-His重组表达质粒构建正确；纯化的人Tim-3重组蛋白质量分数达90%以上；建立的亲和超滤-液质联用筛选体系专属性、精密度、重复性、稳定性良好；白术内酯Ⅰ可与Tim-3蛋白特异性结合。结论 成功表达了可溶性、高纯度的人Tim-3重组蛋白，成功建立亲和超滤-液质联用筛选体系，白术内酯Ⅰ可与Tim-3蛋白特异性结合。     

酶为标靶的前沿亲和色谱筛选天然药物的研究进展

前沿亲和色谱(Frontal affinity chromatography,FAC)用于研究分子之间的相互作用,操作简单,可求得分子之间相应的解离常数Kd,并对各种配体的亲和力大小进行排序,同时可以区分药物靶标分子的多个结合位点,已广泛应用于天然药物的筛选。酶作为临床药物常用的靶标之一,具有很强的特异性,而较游离酶相比,固定化酶具有更好的耐受性。目前,研究酶的固定化技术,以酶为标靶,采用前沿亲和色谱技术用于天然药物的筛选,已成为筛选天然药物有效的方法之一,也是开发新药的重要研究方向。文章综述了酶的固定化,酶为标靶的前言亲和色谱技术以及用于筛选天然药物的研究进展。     

磷酸激酶亲和色谱介质的制备

目的制备适合分离纯化磷酸激酶的亲和色谱介质。方法以纸纤维为载体,环氧氯丙烷等为活化剂,考察接臂、配基对磷酸激酶吸附效果的影响,确定亲和色谱介质制备的工艺路线,并对主要工艺参数进行优化。结果己糖激酶纯化倍数可达20倍以上,酶活回收率近60%。结论以自制的亲和色谱介质分离纯化啤酒酵母中的磷酸激酶,成本低,操作简单,分离效果良好。     

重组人乳铁蛋白致突变性研究

<正>乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白,主要由乳腺上皮细胞表达和分泌。能参与铁代谢,促进铁吸收、抗微生物功能、抗病毒作用、免疫调节和抗感染、抗肿瘤、抗氧化作用,并作为细胞生长因子等被广泛地研究[1-4]。尤其是在食品与营养,婴幼儿配方奶粉方面需求量非常大。但是,目前市场上的乳铁蛋白大多都是从牛乳中纯化得到的,生物活性远低于人乳铁蛋白。利用重组DNA和转基     

人源化抗人TNFα单克隆抗体纯化工艺的优化

目的考察中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO细胞)表达的人源化抗人TNFα单克隆抗体的亲和色谱过程中的杂质洗脱工艺,优化目的蛋白洗脱工艺条件。方法以目的蛋白回收率和宿主细胞蛋白残留量为评价指标,筛选最佳的杂质洗脱缓冲液;利用实验设计方法,以纯度、洗脱峰pH值、宿主细胞蛋白残留量为评价指标,考察目的蛋白洗脱缓冲液的pH值和浓度对工艺的影响,优化目的蛋白洗脱工艺条件。结果优化后的亲和色谱工艺,在保持目的蛋白高回收率(优化前为86.5%,优化后为86.7%)的同时,可显著降低目的蛋白洗脱峰中宿主细胞蛋白残留量(由1 218×10-6降低至78×10-6),提高目的蛋白纯度(优化前为95.5%,优化后为96.6%),减轻后续纯化压力;提高了目的蛋白洗脱峰的pH值(由3.59提高到4.25),有利于目的蛋白的稳定。结论优化了人源化抗人TNFα单克隆抗体的亲和色谱工艺,本工艺有效、可行。     

多级超滤及亲和超滤法分离纯化NADH工艺的研究

研究出一种经济、高效、简便且容易放大的提取、分离和纯化辅酶NADH的工艺条件并进行优化.使用化学渗透法处理啤酒酵母细胞Saccharomyces cerevisiae粗提NADH,多级超滤及亲和超滤法进一步分离和纯化NADH.选用酵母醇脱氢酶（YADH）作为亲和配体,在pH值8.0,离子强度为0.1 mol/L时,用YADH和细胞渗透液中的NADH亲和.使用MWCO=30 000的滤膜超滤.结果：NADH YADH复合物留在截留液中,从而与其它小分子物质分离.改变pH值和离子强度,NADH-YADH复合物解离,通过MWCO=1 000的滤膜超滤,NADH分离到滤过液中,YADH作为截留而回收,回收率达93%,活性损失15%.试验表明使用化学渗透法处理酵母细胞,用亲和超滤纯化可获得高的NADH产率.和以前的方法相比具有简单、经济、省时、高效等特点,且容易放大.     

转基因羊奶中促红细胞生成素的提纯

目的从pBLG-hEPO转基因母山羊的羊乳中提纯促红细胞生成素(EPO)。方法经过酸沉淀预处理、SPSepharose FF阳离子交换树脂、butyl FF 16/10疏水交换树脂、Superdex 75 26/60分子筛色谱4步分离,从转基因羊乳中纯化出EPO。结果经SDS-PAGE检测,得到的EPO相对分子质量约为32 000,全程回收率为10.1%,ELISA和蛋白质印迹实验证明其具有天然EPO抗原性。结论此工艺可用于快速分离转基因羊乳中EPO。     

A hexamer peptide ligand that binds selectively to staphylococcal enterotoxin B: isolation from a solid phase combinatorial library

Abstract: By screening a solid‐phase combinatorial peptide library, a short peptide ligand, YYWLHH, has been discovered that binds with high affinity and selectivity to staphylococcal enterotoxin B (SEB), but only weakly to other SEs that share sequence and structural homology with SEB. Using column affinity chromatography with an immobilized YYWLHH stationary phase, it was possible to separate SEB quantitatively from Staphylococcus aureus fermentation broth, a complex mixture of proteins, carbohydrates and other biomolecules. The immobilized peptide was also used to purify native SEB from a mixture containing denatured and hydrolyzed SEB, and showed little cross‐reactivity with other SEs. To our knowledge this is the first report of a highly specific short peptide ligand for SEB. Such a ligand is a potential candidate to replace antibodies for detection, removal and purification strategies for SEB.     

Transgenic ginseng cell lines that produce high levels of a human lactoferrin

In order to produce a human lactoferrin (hLf) protein in cultured plant cells, we developed Korean ginseng (Panax ginseng) cell line using an oxidative stress-inducible peroxidase (SWPA2) promoter and characterized the production of human lactoferrin in cultured cells. A construct containing a targeting signal peptide from tobacco endoplasmic reticulum fused to human lactoferrin cDNA under the control of SWPA2 promoter was engineered. Transgenic Korean ginseng cell lines that produced a recombinant hLf protein were successfully generated and confirmed by PCR and Southern blot analyses. Western blot and ELISA analyses showed that hLf protein was synthesized in the transgenic cells. The production of hLf showed a maximal level (up to 3.0% of total soluble protein) in the stationary phase of callus cultures. These results suggest that the transgenic cell lines in this study will be biotechnologically useful for the commercial production of hLf protein in cell cultures, with no need for purification.     

用亲和层析法分离纯化降纤酶

目的用亲和层析法从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化降纤酶。方法用离子交换色谱、单克隆抗体亲和色谱技术进行分离纯化。结果得到电泳纯的降纤酶，其分子量为36000。结论用单克隆抗体亲和色谱法纯化降纤酶是切实可行的。     

单克隆抗体SZ-95亲和色谱纯化人血小板第4因子

目的用单克隆抗体亲和色谱从人血小板破碎液中纯化血小板第 4因子 (PF4 )。方法将单克隆抗体SZ 95 IgG与溴化氰活化的Sepharose 4B凝胶连接成亲和色谱柱SZ 95 IgG Sepharose 4B ,人血小板破碎液经此亲和色谱柱上样后 ,经洗脱获得PF4 ,采用 15 %SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度 ,用点印迹鉴定其免疫活性。结果SZ 95 Sepharose 4B亲和色谱柱的偶联率为 72 % ,每 1ml(约 1× 10 9个血小板 )血小板破碎液中可以纯化到PF4 18μg ,其相对分子量约为 12kD ,经点印迹显示与单抗SZ 95反应显带。结论用SZ 95 Sepharose 4B亲和色谱柱纯化的PF4产品得率高、纯度高、活性好     

A 90-day safety study in Sprague-Dawley rats fed milk powder containing recombinant human lactoferrin (rhLF) derived from transgenic cloned cattle

Transgenic cloned animals expressing beneficial human nutritional traits offer a new strategy for large-scale production of some kinds of functional substances. In some cases, the required safety testing for genetically modified (GM) foods do not seem appropriate for human food safety, though regulations do not seem to provide alternatives. A 90-day rat feeding study is the core study for the safety assessment of GM foods. The test material in this 90-day study was prepared nonfat milk powder containing recombinant human lactoferrin (rhLF), which was expressed in transgenic cloned cattle. Groups of 10 male and female Sprague-Dawley rats were given a nutritionally balanced purified diet containing 7.5, 15, or 30% transgenic or conventional milk powder for 90 days. A commercial AIN93G diet was used as an additional control group. Clinical, biological, and pathological parameters were compared between groups. The only significant effect of treatment was higher mean ferritin and Fe(+) concentrations for both male and female rats fed the transgenic milk powder diets, as compared to rats fed nontransgenic milk diets or the commercial diet. The results of the present study are consistent with previous research, which indicates that milk powder containing rhLF derived from healthy transgenic cloned cattle is as safe as conventional milk powder.     

刺桐胰蛋白酶抑制剂的高效表达、纯化、亲和介质的制备及其在r-PA纯化中的应用

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,能够特异性结合胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂,抑制其活性。因此ETI可以作为配体与固定相偶联制备亲和层析介质,用于tPA(组织型纤溶酶原激活剂)及其突变体的纯化。利用基因工程方法构建了ETI的高表达工程菌株,诱导表达后目的蛋白占总蛋白的39.6%,经包涵体变性、复性、纯化,制备了纯度高于96%的ETI样品,收率达到了63.5%。利用纯化的ETI,偶联制备了亲和层析介质,偶联率达到99%。用制备的ETI亲和层析介质纯化瑞替普酶(r-PA),获得的r-PA样品纯度高于95%,生物学活性高于5×105U/mg。本研究为ETI的进一步生产及应用奠定了基础。