下调miR-125b逆转白血病细胞对多柔比星的耐药作用

目的:探讨下调miR-125b是否能逆转人白血病多柔比星耐药细胞株的耐药性,为白血病耐药患者寻找新的治疗方法。方法:应用实时荧光定量PCR方法检测白血病非耐药细胞株HL-60和K562及对应多柔比星耐药细胞株HL-60/DOX和K562/DOX中miR-125b的表达情况;采用电穿孔转染法上调或者抑制HL-60/DOX细胞中miR-125b的表达水平,随后采用CCK-8法检测不同浓度多柔比星处理后细胞的存活情况,绘制细胞增殖抑制率曲线并计算半数抑制浓度(IC50)。结果:与非耐药细胞株HL-60和K562相比,耐药细胞株HL-60/DOX和K562/DOX中miR-125b的表达水平明显升高。miR-125b在HL-60/DOX细胞中的表达水平比HL-60细胞中高15倍,其在K562/DOX细胞中的表达水平比K562细胞中高5倍。在耐药细胞系HL-60/DOX中过表达或抑制miR-125b的表达发现,转染miR-125b模拟物的细胞较对照组细胞的增殖抑制率显著降低(P 0. 01),而转染miR-125b抑制剂的细胞较对照组细胞的增殖抑制率显著升高(P 0. 01)。结论:miR-125b在白血病多柔比星耐药细胞株HL-60/DOX和K562/DOX中高表达。下调miR-125b的表达可逆转HL-60/DOX细胞对多柔比星的耐药性。     

白血病U937细胞系WT1基因静默的机制研究

本研究探讨白血病细胞系WT1基因的甲基化状况及其与表达的关系.用甲基化抑制剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂成功诱导WTI表达.用地西他滨、曲古抑菌素处理白血病U937、HL-60、K562细胞系,用RT-PCR、改良的硫化PCR结合限制性内切酶技术检测mRNA表达.结果表明,U937细胞不表达WT1基因,而HL-60、K562和KG1细胞高表达WT1基因;HL-60细胞WT1基因没有甲基化,而K562和U937细胞发生了甲基化.地西他滨、曲古抑菌素单药处理U937细胞不能诱导WT1基因表达,而二药联合作用可以诱导U937细胞系WT1基因重新表达.结论:单纯DNA甲基化不能抑制白血病细胞WT1基因表达;DNA甲基化与组蛋白脱乙酰基共同抑制了WT1基因表达;地西他滨、曲古抑菌素联合作用可以重新诱导WT1基因表达.     

Rheb过表达在白血病细胞株HL-60和K562中的作用

mTOR信号通路是细胞内重要的生命活动枢纽,它通过抑制细胞凋亡,促进细胞增殖来调控细胞生命活动。Rheb可以激活mTOR信号通路,进而参与多种肿瘤的发生发展。本研究以髓系白血病细胞株为研究对象,探讨Rheb在HL-60和K562中的作用及相关机制。本研究利用逆转录病毒技术使髓系白血病细胞株HL-60和K562过表达Rheb;利用Western blot和Real-Time PCR分别检测HL-60和K562细胞中Rheb的蛋白表达水平及mRNA表达水平;利用CCK-8法检测细胞活力;利用Annexin V-PE和7-AAD双染检测细胞凋亡。结果表明:成功构建了Rheb过表达的HL-60和K562细胞株,并发现Rheb过表达可以促进细胞生长;进一步研究发现,Rheb过表达加快细胞进入G2/M期(P<0.01),但不影响细胞凋亡。结论:Rheb通过加快细胞周期进程促进HL-60和K562细胞增殖。     

雷帕霉素对白血病细胞株的影响

本研究探讨雷帕霉素对白血病细胞株的增殖抑制作用及其对细胞周期的影响,并分析该药作用前后mTOR mRNA表达水平的变化。采用四唑氮蓝比色试验（MTT）观察雷帕霉素对白血病细胞株KG1、K562和U937的体外增殖抑制作用;应用流式细胞术（FCM）检测雷帕霉素干预后的白血病细胞株的细胞周期的阻滞情况;采用实时荧光定量PCR检测白血病细胞株的mTORmRNA表达。结果表明：不同浓度的雷帕霉素作用于KG1细胞株时,20nmol／L为最佳有效浓度,细胞被明显抑制,细胞周期阻滞在G0／G1期,细胞凋亡明显,mTORmRNA的表达水平亦显著降低。与雷帕霉素作用于KG1细胞株相比,雷帕霉素对K562和U937细胞株的作用相对较弱。结论：雷帕霉素与mTOR结合后可以抑制细胞增殖,KG1细胞株对雷帕霉素最为敏感。     

Survivin在白血病细胞中的表达及GM-CSF对其影响的研究

本研究旨在探讨凋亡存活蛋白survivin在白血病的原代细胞和白血病细胞系中的表达情况，并观察粒-巨噬细胞细胞集落刺激因子（GM-CSF）对其的影响。用RT-PCR方法检测37例白血病患者、10例正常成人骨髓和3种白血病细胞系（K562、HL-60、U937）中survivin的表达。以HL-60细胞为对象，加入合适浓度的GM-CSF，用RT-PCR和Western blot分别检测加药前后surivin mRNA和蛋白水平的变化。结果显示：37例白血病患者中有25例表达survivin，阳性率为67．6％，其中急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞中survivin mRNA表达阳性率为73．3％，高于急性髓系白血病（AML），但均高于正常对照组（20．0％）（P〈0．05）。3种细胞系K562、HL-60和U937全部表达survivin。合适浓度的GM-CSF作用2天后，HL-60细胞中survivin的表达明显升高，其中mRNA水平升高了26％，蛋白水平升高了49％。结论：suvivin在白血病的原代细胞和细胞系中均有较高表达，而GM-CSF能显著提高HL-60细胞中survivin的水平。     

化学诱导分化后的白血病细胞系丧失对正常骨髓集落形成的抑制

用诱导分化前、后的两株人白血病细胞系K562和HL-60细胞分别与正常骨髓细胞混合培养作为实验模型,研究白血病细胞对正常骨髓祖细胞生长的抑制。诱导剂处理前或后的10~4个K562或HL-60细胞与肋骨骨髓细胞(2.5—5×10~4个)做血浆凝块和/或血浆凝块-琼脂双层培养,于培养后第7和12天,用联苯胺-苏木素染色,分别计数CFU-E和BFU-E。K562和HL-60细胞对CFU-E、BFU-E的生长抑制率分别为:CFU-E40—60％、BFU-E54.8±2.3％。随着白血病细胞数的增加对正常骨髓细胞的抑制率也升高,当加至10~6个K562细胞与正常骨髓混合培养,则无BFU-E生长。这种抑制作用也存在于K562细胞的条件培养液中。用30—70μmol氯高铁血红素(或2μmol丁酸钠)和2μmol顺-视黄酸处理K562和HL-60细胞,在第2,3、4、5天分别收集之,用上述方法测定它们对CFU-E、BFU-E集落形成的影响。HL-60细胞用视黄酸处理4天后就失去对BFU-E的抑制作用,K562细胞用丁酸钠诱导后有同样的结果。并且,随着处理时间     

绿茶的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗血液肿瘤血管新生机制的研究

目的 对绿茶的丰要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对血液肿瘤血管新牛抑制作用进行研究,为EGCG用于白血病治疗提供依据.方法 采用MTT法,测定不同浓度的EGCG对白血病细胞株K562细胞增殖的抑制作用,并采用RT-PCR方法检测EGCG处理前后K562细胞血管内皮牛长因子(VEGF)mRNA的表达情况.结果 EGCG可明显抑制K562增殖,IC50值为118.34μM,并可以下调K562细胞VEGF mRNA的表达.结论 EGCG可下调VEGF mRNA的表达,从而减少VEGF的分泌.既可以减少VEGF的旁分泌,减弱其促进内皮细胞增生的作用;又可以减少VEGF的自分泌,削弱其通过白血病细胞细胞表而VEGF受体促进肿瘤细胞的分裂增殖、抑制肿瘤细胞的凋亡的作用.从不同途径发挥其抗血液肿瘤血管新生的作用.     

白血病细胞TGFβ1及其受体基因表达与白血病患者血清TGFβ1测定及其意义

目的:研究转化生长因子β_1(TGFβ_1)对白血病细胞增殖抑制作用的机制及急性白血病患者血清TGFβ_1变化及意义。方法:应用逆转录-聚合酶链反应方法检测白血病细胞的细胞因子及其受体基因表达;应用白血病细胞集落试验测定TGFβ_1对HL-60、DAMI、K562细胞增殖的作用;应用ELISA方法测定33例急性白血病患者血清TGFβ_1水平。结果:TGFβ_1对HL-60、K562、DAMI细胞增殖具有明显的抑制作用;白血病细胞系(HEL、HL-60、K562、U937、DAMI、MEG-01、HUT78)及CA均表达TGFβ_1及其受体mRNA。外源性TGFβ_1抑制DAMI细胞IL-6、IL-6R、GM-CSFR及IL-3的基因表达,上调DAMI细胞本身TGFβ_1表达,并诱导DAMI细胞凋亡。白血病患者血清TGFβ_1水平明显减低;患者达完全缓解时,该水平恢复正常;复发时,该水平又趋减低。结论:TGFβ_1是白血病细胞抑制性自泌因子;其抑制作用与其调控白血病细胞的细胞因子与受体表达有关;血清TGFβ_1水平是监测白血病病情转归的一项有价值指标;TGFβ_1作为负调控因子在白血病发病机制中可能起重要作用。     

重组变构人TRAIL联合柔红霉素对白血病细胞诱导凋亡作用及其机制的研究

为了研究重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（recombinanat mutant human TRAIL, rmhTRAIL）单用及与柔红霉素（DNR）联合应用对白血病细胞株U937、K562的诱导凋亡作用及其机制，以正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5作对照，采用MTT法检测体外培养的U937、K562白血病细胞株在rmhTRAIL单用和联合DNR作用下增殖的抑制效应；用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测DNR处理前后白血病细胞TRAIL死亡受体和诱杀受体的mRNA表达水平。结果表明：rmhTRAIL对白血病细胞株U937、K562有较明显的抑制增殖作用，DNR与TRAIL联合对抑制肿瘤细胞具有协同性，与各药单独使用比较均有显著差异（P〈0．05）；经DNR作用后，U937、K562细胞的死亡受体DR4、DR5水平上调，而两种诱杀受体DcR1、DcR2表达未受影响。结论：在体外rmhTRAIL单用或与DNR联用均能明显抑制白血病细胞增殖，rmhTRAIL与DNR对白血病细胞的杀伤有协同作用。其诱导机制可能与U937、K562细胞死亡受体DR4、DR5表达水平上调有关。     

二烯丙基二硫对HL-60细胞血管内皮生长因子表达及分泌的影响

目的探讨二烯丙基二硫(DADS)对白血病细胞株 HL-60的生长抑制作用和对 HL-60细胞血管内皮生长因子(VFGF)mRNA 的表达及 VEGF 蛋白分泌的影响。方法采用 MTT 法观察DADS 对体外培养的 HL-60细胞的生长抑制;应用 ELISA 法检测药物作用前后 HL-60细胞培养上清液中 VEGF 蛋白的含量;半定量 RT-PCR 法检测药物作用前后 HL-60细胞 VEGF mRNA 表达水平。结果DADS 对 HL-60细胞具有明显的生长抑制效应,0.625,1.250和2.500μg/ml DADS 作用 HL-60细胞24 h 的细胞生长抑制率分别为(8.19±3.34)%,(16.79±2.07)%,(21.30±2.72)%;作用48 h 的细胞生长抑制率分别为(11.93±3.93)%.(22.81±2.31)%,(30.74±2.03)%;作用72 h 的细胞生长抑制率分别为(16.68±2.37)%,(28.54±3.26)%,(36.59±2.37)%,其对 HL-60细胞的生长抑制率与药物浓度有明显依赖关系(r>0.9,P<0.01),各实验组随作用时间增加抑制率明显增加(r>0.7,P<0.01);0.625,1.250,2.500 μg/ml DADS 作用 HL-60细胞48 h 和72 h 与空白对照相比均能下调HL-60细胞 VEGF mRNA 的表达及 VEGF 蛋白的分泌(P<0.01),三个不同浓度 DADS 组间差异均有统计学意义(P<0.01),其下调 HL-60细胞 VEGF mRNA 的表达及 VEGF 蛋白的分泌效果与药物浓度呈相关性(r>0.9,P<0.01)。结论 DADS 能明显抑制 HL-60细胞的增殖;DADS 可能通过抑制 HL-60细胞 VEGF mRNA 的表达及 VEGF 蛋白分泌发挥抗白血病的效应。     

WT1反义寡核苷酸对白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的 了解ＷＴ１反义寡核苷酸对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法 应用ＷＴ１基因的反义寡核苷酸（ＷＴ１ＡＳＯ）处理Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＨＬ－６０细胞系,白血病患以及正常人骨髓细胞,然后以台盼蓝拒染法、细胞集落法及流式细胞仪检测法确定白血病细胞的增殖和凋亡。结果 ＷＴ１ ＡＳＯ能够抑制ＷＴ１表达阳性的Ｋ５６２细胞生长,对ＷＴ１表达阴性的Ｕ９３７细胞则无抑制作用;ＷＴ１ ＡＳＯ对８例急性髓系白血病患     

WT1基因表达对K562、HL-60细胞增殖作用的研究

目的：探讨ＷＴ１基因反义ＲＮＡ对髓系白血病细胞生长增殖和细胞凋亡的影响及作用机制。方法：用ＷＴ１基因反义ＲＮＡ培养Ｋ５６２、ＨＬ６０细胞，用氮蓝四氮唑盐染色、流式细胞仪检测、逆转录聚合酶链反应等方法观察细胞增殖、凋亡、细胞动力学和基因表达情况。结果：ＷＴ１反义ＲＮＡ可以特异性抑制Ｋ５６２细胞增殖，诱导Ｋ５６２、ＨＬ６０细胞凋亡；对ＨＬ６０细胞的增殖无影响，对ＷＴ１、ｂｃｌ２、ｍｄｍ２基因表达无显著影响。结论：ＷＴ１基因与白血病细胞的增殖、凋亡密切相关，对白血病细胞凋亡的影响与ｐ５３、ｂｃｌ２基因无关。     

低氧诱导因子抑制剂对白血病细胞株HIF-1α和VEGF表达及诱导细胞凋亡作用的研究

本研究探讨低氧诱导因子抑制剂3-(5′-hydroxymethyl-2′-furyl)-1-benzylindazole(YC-1)对人急性白血病病细胞低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor1α,HIF-1α)和血管内皮因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的调节及诱导细胞凋亡作用。应用DAPI染色检查凋亡细胞的形态;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR检测K562、U937、Jurkat白血病细胞株hif-1α和vegf mRNA表达以及YC-1对U937细胞hif-1α、vegf mRNA表达影响;Western blot检测YC-1对U937细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达,以及BAX、BCL-2、caspase-3蛋白变化,分析YC-1诱导U937细胞凋亡的可能机制。结果表明:在3种白血病细胞株均可见hif-1α和vegf mRNA表达。4μmol/L YC-1处理U937细胞(0、8、16和24小时)后,可见凋亡细胞出现的典型凋亡形态特征;流式细胞术检测的细胞0、8、16和24小时凋亡率分别为(4.87±0.70)%、(27.27±2.00)%、(51.53±2.81)%及(60.5±3.20)%;vegf mRNA表达下调,而hif-1αmRNA表达无明显变化;HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和BCL-2蛋白表达下调,而BAX和caspase-3蛋白表达上调,BAX/BCL-2比率升高并呈时间依赖性(r=0.973,p0.01)。结论:3种白血病细胞株均显示hif-1α和vegf mRNA表达,YC-1可以抑制白血病细胞HIF-1α蛋白表达,进而下调VEGF,并通过上调BAX/BCL-2比率、caspase-3蛋白表达诱导细胞凋亡。     

神经毡蛋白-1在急性髓系白血病细胞中的表达和作用

本研究旨在探索神经毡蛋白(neuropilin-1,NRP-1)和NRP-2在髓系白血病细胞中的表达及抑制NRP-1基因表达后对白血病细胞生长和迁移的影响.采用RT-PCR观察NRP-1和NRP-2 mRNA在24例急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞(MNC)及7种髓系白血病细胞系中的表达;以小干扰RNA(siRNA)干扰NRP-1基因在HEL细胞的表达,用MTT和细胞迁移试验观察细胞增殖、迁移的变化.结果显示NRP-1在24例AML患者骨髓MNC中表达,其阳性率为100%,显著高于正常对照组67%(p=0.03).79%AML患者表达NRP-2,67%正常人表达NRP-2,两者无明显差异(p=0.6).NRP-1的表达与AML患者骨髓、外周血原始细胞比例呈正相关(r=0.5,r=0.4,p＜0.05).NRP-1和NRP-2 mRNA分别在6/7和3/7种髓系白血病细胞系表达.用siRNA转染HEL细胞24小时后NRP-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低,当有VEGF165作用时,对照组细胞增殖明显增加,而干扰组无变化(MTT值对照组vs干扰组0.6±0.01 vs 0.49±0.02,p＜0.001).转染24小时后干扰组细胞迁移显著降低,其迁移细胞数干扰组vs对照组为500±17 vs 123±7(p＜0.001).结论NRP-1在AML患者骨髓MNC中表达增高,并在髓系白血病细胞的增殖和迁移中起重要作用.     

抗凋亡基因bcl－2在急性白血病骨髓与细胞株中的转录水平表达

采用原位杂交方法检测了急性白血病骨髓活检标本及细胞株中ｂｃｌ－２基因表达水平。结果２２例白血病患者骨髓中２１例（包括髓系和淋巴系）存在ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ高表达；６种白血病细胞株中５种ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ阳性（Ｍｏｌｔ－４例外），它们分别为ＣＥＭ、Ｒａｊｉ、ＨＬ－６０、Ｕ９３７及Ｋ５６２。表明造血系统肿瘤中广泛存在ｂｃｌ－２基因转录水平激活，其基因产物可能通过抑制细胞凋亡过程而影响急性白血病细胞的生物学特性。     

RT-PCR检测白血病细胞VEGF异构体及其受体基因

目的 建立逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测白血病细胞血管内皮生长因子(VEGF)异构体及其受体基因的方法。方法 用TRIZOL试剂提取体外培养的细胞系总RNA,M—MLV逆转录酶生成模板cDNA,PCR扩增VEGF异构体基因以及VEGF受体Flt-1基因,扩增产物用含溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳后,直接分析电泳结果。结果 白血病细胞(K562和HL-60)出现3条VEGF条带(516bp、588bp、648bp),分别代表VEGF3种异构体(VEGF121,VEGF145,VEGF165)的基因扩增产物,而人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)无VEGF条带出现;此外,2种白血病细胞都可以测出VEGF的Flt-1受体基因,与Flt-1阳性细胞ECV304相似。结论 RT-PCR可用于白血病细胞VEGF多种异构体及其Flt-1受体基因的检测。     

白血病细胞WT1基因启动子区DNA甲基化研究

目的：研究白血病细胞WT1启动子区DNA甲基化与其表达的关系。方法：采用RT-PCR技术、硫化PCR结合限制性内切酶技术检测白血病细胞系及正常人外周血单个核细胞WT1基因的表达及其启动子区DNA甲基化水平。结果：正常人外周血单个核细胞及U937细胞不表达WT1基因，而HL-60、K562和KG1细胞高表达WT1基因，HL-60细胞WT1基因无甲基化。结论：WT1基因启动子区DNA甲基化不能抑制其表达，尚存在其他调节WT1基因表达的因素。