用同源重组法构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库的探索

目的探索卵巢成熟及明确早胚发育过程中,构建小鼠卵母细胞cDNA文库筛选所涉及的相互作用蛋白。方法利用SMART技术,构建酵母双杂交筛选卵母细胞中与输卵管蛋白相互作用的靶分子成分为目的,构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库。采用Stratagene RNA prepkit抽提500枚卵母细胞总RNA,应用线性化载体pGADT7-Rec在体构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库。结果文库的滴度为3.7×106,重组片段大小主要集中在0.6-0.9kb,重组率为60%。结论所构建的小鼠卵母细胞cDNA文库可用于酵母双杂交筛选。     

利用膜蛋白酵母双杂交系统构建人尿道上皮细胞cDNA文库

利用基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交技术,构建人永生尿道上皮细胞(SV-HUC-1)cDNA文库。Trizol法提取人尿道上皮细胞总RNA,并分离纯化其mRNA;以mRNA为模板,合成cDNA第一链、第二链;通过T4 DNA聚合酶将DNA链两端加上5′接头;并将其大于1 kbp的片段与膜蛋白酵母双杂交载体pPR3-N连接,经电转化大肠杆菌感受态细胞,以构建基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并检测文库的库容量和随机性。本研究成功构建了人尿道上皮细胞的基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,为进一步研究泌尿生殖道感染病原体与宿主尿道上皮细胞的相互作用奠定了实验基础。     

hTCF4酵母双杂交载体的构建

目的　研究Wnt Frizzled信号传导通路上的主要信号分子T细胞因子 (TCF4)在细胞核内转导的辅激活物和辅阻遏物。方法　通过PCR法以真核表达载体pCDNA TCF4为模板 ,扩增获得了15 0 0bp的TCF4基因的末端及DNA结合域片段 ,经过SalI ,NotI酶切后 ,基因重组的方法定向克隆于酵母双杂交载体pPC86和pDBleu中 ,构建形成pDBleu TCF4和pPC86 TCF4真核表达载体。结果　经转化 ,提取质粒酶切鉴定表明构建成功。结论　hTCF4酵母双杂交载体的构建成功为Wnt Frizzled信号通路的深入研究奠定了基础。     

与人巨细胞病毒UL132编码蛋白相互作用蛋白的初步筛选和鉴定

目的：探讨应用酵母双杂交系统筛选出与人巨细胞病毒（HCMV）UL132编码蛋白相互作用的人胎脑cDNA文库组织蛋白,阐明其在先天性巨细胞病毒感染中可能的致病机制。方法：采用聚合酶链式反应扩增HCMV UL132片段,酶切、纯化扩增的目的片段及酵母诱饵表达载体pGBKT7,连接HCMV UL132片段到载体pGBKT7上,将连接后的重组体pGBKT7-UL132转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA也转化到酵母AH109中,筛选与HCMVUL132编码蛋白相互作用的人胎脑文库蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果：成功构建诱饵表达载体pGBKT7-UL132,双酶切鉴定可见800及7500bp2条目的条带;转化文库质粒后计算转化效率为6.6×10³ cfu·μg^-1,显色反应显示有95个菌落呈蓝色,最终确认10个克隆与HCMV UL132编码蛋白相互作用,Blast结果显示7个克隆与CAML高度同源。结论：利用酵母双杂交系统成功筛选出与HCMVUL132编码蛋白相互作用的人胎脑cDNA文库蛋白CAML,推测该目的蛋白可能在HCMV感染所致神经系统损伤、病毒的入侵和增殖过程中发挥重要作用。     

顺序转化法进行酵母双杂交筛选相互作用蛋白质

目的：利用顺序转化法进行酵母双杂交从人胎脑cDNA文库中筛选PAK4新的相互作用蛋白。方法：将PAK4激酶域序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒。提取质粒并转化酵母菌AH109,验证蛋白表达。用顺序转化法将质粒和人胎脑cDNA文库转化酵母菌AH109,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/x-α-gal平板上筛选,对阳性克隆质粒进行酶切鉴定。结果：利用顺序转化酵母双杂交方法筛选出了多个与PAK4蛋白质相互作用的Ade＋/His＋/LacZ＋阳性转化子。结论：利用顺序转化酵母双杂交方法成功筛选了与PAK4相互作用的蛋白质。     

人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

目的：构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）发生发展中的相关机制。方法：采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库。将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布。结果：提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接。将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库。在原始电转化菌稀释100倍后取10 μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×10⁶ CFU·mL^-1,转化后原始菌液共计5 mL,总库容量为1.25×10⁷ CFU。文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1200 bp,阳性率为100%。结论：成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础。     

应用酵母双杂交方法筛选与鉴定组蛋白乙酰基转移酶hTIP60β相互作用蛋白

目的 克隆人组蛋白乙酰基转移酶TIP60β基因,应用酵母双杂交技术研究筛选与TIP60β发生相互作用的蛋白.方法 运用RT-PCR 方法从人脑组织克隆TIP60β cDNA,构建酵母双杂交BD诱饵载体pGBKT7- TIP60β,以其为诱饵从成人肝cDNA文库中筛选与之相互作用的阳性克隆,并对阳性克隆进行序列测定和相关生物学分析.结果 诱饵载体pGBKT7-TIP60β经双酶切可释放出1 443 bp DNA片段,与理论值大小一致,测序比对分析表明序列正确.以其为诱饵经酵母双杂交筛选共获得32个克隆,进一步验证与测序分析,最终确认HDAC7A、DMD2、CREB1、BD73、PHF17、AR等 9个克隆基因. 结论 以TIP60β为诱饵利用酵母双杂交系统获得9个基因编码的蛋白,它们很可能与TIP60β转录活性调节功能有关.     

利用酵母双杂交系统筛选Pak4相互作用蛋白质

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选信号转导分子Pak4相互作用蛋白.方法 将Pak4激酶域序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒.质粒转化到酵母感受态AH109和Y187中验证蛋白表达.将人胎脑cDNA文库转化酵母Y187,与已转化诱饵质粒的AH109酵母进行交配实验.交配子在SD/-Leu/-Trp/-His和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal平板上筛选,阳性克隆质粒酶切鉴定.结果 成功构建了pGBKT7-Pak4 KD诱饵质粒,Western blot证实其在酵母菌AH109和Y187中表达,筛选了多个与Pak4相互作用的阳性转化子.结论 利用酵母双杂交系统筛选出Pak4相互作用蛋白质.     

肿瘤坏死因子受体相关因子家族成员间相互作用的初步研究

目的 探讨肿瘤坏死因子受体相关因子 (TRAFs)各成员间的相互作用及各成员间的关系.方法 利用PCR技术扩增出TRAFs;构建到pDBLeu、pPC86载体上,分别形成诱饵、猎物质粒;转化,扩增酵母菌;将诱饵、猎物菌液结合酵母双杂交阵列组合(Mating)技术筛选相互作用.最后用免疫共沉淀技术进行验证.结果 成功构建...     

小鼠Dnd1酵母双杂交系统诱饵载体的构建及自身激活检测

目的:构建用于酵母双杂交系统的诱饵载体pDBLeu-Dnd1,并检测其是否有自身激活作用。方法:设计引物引入SalⅠ、NotⅠ酶切位点,使用PCR方法从质粒pcDNA3.1-Dnd1中扩增小鼠Dnd1基因的编码区序列,连至pMD18-T载体。酶切验证及测序正确后,用SalⅠ,NotⅠ内切酶分别消化pMD-T-Dnd1及pDBLeu载体而后构建诱饵载体pDBLeu-Dnd1,并检测其在G IBCO/BRL公司的酵母双杂交系统中的自身激活作用。结果:成功构建诱饵载体pDBLeu-Dnd1,并证明其在该系统中无自身激活作用。结论:pDBLeu-Dnd1可应用该酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白。     

天麻钩藤饮加减治疗肝阳上亢型高血压病临床分析

目的:观察天麻钩藤饮对肝阳上亢型高血压病患者的疗效及其生活质量的影响。方法:选择肝阳上亢型高血压病人172例,随机分为治疗组86例和对照组86例,治疗组采天麻钩藤饮加减治疗,对照组采用洛汀新治疗,两组均治疗4周,分别对两组的血压和生活质量进行测评。结果:治疗后,两组血压均明显下降,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05),而治疗组生活质量评分明显较对照组高(P<0.001)。结论:天麻钩藤饮对肝阳上亢型高血压病患者不但具有良好的降压效果,还能够明显提高高血压患者的生活质量。     

钆贝葡胺MRI增强在肝硬化结节与小肝癌诊断鉴别中的应用

目的探究钆贝葡胺(莫迪司)磁共振(MRI)增强在肝硬化结节与小肝细胞癌(HCC)诊断鉴别中的应用效果。方法回顾性分析我院86例经病理检查确诊为肝硬化合并肝内结节患者临床资料。记录86例患者病理检查结果,比较小HCC与肝硬化结节MRI增强扫描信号强度、医师对MRI增强动态三期及动态四期的诊断信心评分差异,并分析MRI增强动态三期及动态四期对小HCC和肝硬化结节的诊断准确性。结果86例患者共91个结节,其中小HCC65个(71.43%),肝硬化结节21个(23.08%),胆管细胞癌2个(2.20%),局灶性结节增生2个(2.20%),腺瘤1个(1.10%)。小HCC与肝硬化结节在动脉期、门静脉期、延迟期及肝胆期信号强度比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。医师对MRI增强动态三期诊断信心评分明显低于动态四期诊断信心评分(P<0.05)。MRI增强动态三期对小HCC及肝硬化结节诊断准确率均低于动态四期(P<0.05)。结论钆贝葡胺MRI动态增强扫描在肝硬化结节和小HCC鉴别诊断中应用效果显著,能在提升医师诊断信心的同时,提高诊断准确性,临床使用价值较高。     

常温下肝门阻断肝切除术治疗肝癌(附86例报告)(英文)

目的　介绍常温下阻断肝门切肝治疗肝癌的手术技巧。方法　回顾性分析用常温下切肝法治疗86例肝癌患者的经验体会。结果　本组86例患者,术中均未出现诸如死亡、大出血等严重并发症。术后7例发生肝功能衰竭,其中5例治愈,2例死亡;5例切口感染;胸腔积液19例,14例经保守治疗自行吸收愈合,5例通过胸腔穿刺治愈。结论　常温下肝门阻断肝切除术是治疗肝癌较为理想的手术方式。     

超声引导下经皮穿刺置管引流在肝脓肿治疗中的应甩

目的 探讨超声引导下经皮穿刺置管引流在肝脓肿治疗中的效果。 方法 回顾性分析我科在2010 年1 月- 2012 年12月超声引导下经皮穿刺置管引流治疗肝脓肿患者110 例（156 个病灶） 治疗情况及并发症发生情况。 结果 110 例（156 个病灶）均穿刺置管成功,置管成功率100%。其中86 例在穿刺置管引流后临床症状及体征消失,超声检查肝内脓腔消失,血常规白细胞总数和中性粒细胞数正常,痊愈率达到78.2%（86/110）。本组并发症发生率为4.55%（5/110）。 结论 超声引导下经皮穿刺置管引流治疗肝脓肿临床疗效可靠、创伤小、并发症少、复发率低,具备较高临床推广价值。     

大肠癌肝脏转移患者同期切除效果与相关因素研究

目的  探讨同期手术切除治疗大肠癌肝转移患者的疗效,并分析其相关影响因素。方法  收集2007年3月-2009年12月西安交通大学医学部附属红会医院行同期切除治疗的86例同时性结直肠癌肝转移患者的临床资料,观察患者术后的近期及远期疗效,采用Logistic回归分析与预后相关的危险因素。结果  86例患者围手术期无死亡病例,术后5例患者出现切口感染,2例吻合口瘘,1例吻合口出血,3例发生胆漏。术后并发症发生率为12.79%（11/86）,经腹腔引流和抗感染等对症支持治疗后获得治愈或明显缓解。至随访结束共42例患者死亡,中位生存时间为60个月,51例患者出现肿瘤复发或远处转移,其中肝内复发38例,肺内转移7例,其他部位转移者6例。患者1、3及5年总生存率分别为93.84%、75.58%及50.74%,无瘤生存率分别为88.37%、61.10%及31.80%。Logistic多因素回归模型结果显示：淋巴结转移阳性、肝脏转移灶数≥4个、肝切缘阳性及术前癌胚抗原水平≥100μg/L是影响患者预后的主要危险因素;术前新辅助化疗可以改善患者的预后。结论  采用同期切除治疗大肠癌肝脏转移患者安全可行,淋巴结转移阳性、肝脏转移灶数≥4个、肝切缘阳性及术前癌胚抗原水平≥100μg/L是影响患者长期预后的主要因素,术前给予新辅助化疗对提高患者生存率有一定积极作用。

     

肝脏移植术后患者医嘱依从性调查与对策

目的观察肝脏移植患者出院后对医嘱依从性的状况以及医嘱依从性对移植肝功能的影响。方法通过对86例肝脏移植术后患者的随访,记录其性别、年龄、职业、文化程度、肝病类型、是否按医嘱要求服药、复查等情况及不依从医嘱的原因。结果肝脏移植术后患者对医嘱的依从率为41.86%,依从率低的主要原因有药费贵且需长期服用,其次是交通不便、家属的支持督导不力和心理疾病。依从性好的患者总体一年成活率可达86%,而依从性差的为54%,经χ2检验,医嘱的依从性好对疗效影响显著（P〈0.01）。结论提高患者对医嘱的依从性,可以保证移植肝的功能,提高患者的远期存活率。     

XAGE-1b mRNA在肝癌患者血液中的表达

目的探讨原发性肝癌外周血液中XAGE—1bmRNA的表达意义。方法采集86例原发性肝癌患者静脉血,实时荧光定量PCR检测其中XAGE—1bmRNA的表达。结果原发性肝癌患者血液中XAGE—1bmRNA检出率为80．8％。结论XAGE—1bmRNA可作为一种肿瘤标志物诊断原发性肝癌。