糖皮质激素对骨髓微血管内皮细胞活性氧代谢影响的实验研究

目的糖皮质激素的应用是引起非创伤性股骨头缺血性坏死的主要原因之一。通过研究经糖皮质激素处理后的骨髓微血管内皮细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的代谢变化,进一步探讨激素性股骨头缺血性坏死的发病机制。方法取行人工全髋关节置换术患者自愿捐献的股骨头内松质骨,利用酶消化法分离培养骨髓微血管内皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞,分别与不同浓度(0、0.03、0.10、0.30、1.00 mg/mL)氢化可的松培养后,采用MTT法测定细胞增殖抑制率;流式细胞仪观测细胞凋亡率;采用荧光探针检测细胞中ROS含量变化,以及与ROS代谢相关的黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)含量变化。结果原代培养2～3 d后,镜下见单个细胞为梭形,呈铺路石样排列;1周后细胞趋于融合状态。0.03、0.10、0.30、1.00 mg/mL组细胞增殖抑制率分别为20.22%±2.97%、22.94%±4.52%、43.98%±3.35%、78.29%±3.85%,0.30、1.00 mg/mL组的细胞增殖抑制率明显高于0.03、0.10 mg/mL组(P<0.05)。0、0.03、0.10、0.30、1.00 mg/mL组细胞凋亡率分别为0.10%±0.01%、0.23%±0.02%、1.83%±0.04%、6.34%±0.11%、15.33%±0.53%,0.30、1.00 mg/mL组细胞凋亡率明显高于0 mg/mL组(P<0.05)。0、0.30、1.00 mg/mL组ROS含量分别为57.35±7.11、120.47±15.68、166.15±11.57,XOD含量分别为0.017 9±0.000 9、0.028 3±0.001 7、0.067 7±0.004 1;以上两指标3组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论糖皮质激素通过使血管内皮细胞内ROS生成增加,引起氧化应激反应,进而导致细胞功能受损。     

糖皮质激素对人股骨头骨微血管内皮细胞功能的影响

[目的]通过基因芯片对人股骨头骨微血管内皮细胞表达谱分析及荧光定量PCR验证,探讨糖皮质激素对骨微血管内皮细胞损伤后发生的功能变化。[方法]采用本实验室建立的方法进行人股骨头骨微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定,证明细胞为骨微血管内皮细胞。用0.1 mg/ml的含氢化可的松的培养基培养细胞,建立糖皮质激素骨微血管内皮细胞损伤模型。设正常对照组,用晶芯mRNA表达谱芯片对细胞损伤模型和对照组进行差异性转录本检测,对差异性表达基因行q PCR验证。[结果]mRNA芯片表达基因筛选结果发现ICAM-1、ET-1受体、PAI-1、血管紧张素II受体较对照组明显上调,e NOS、ET-1、PGI2合成酶、VEGF、PGE合成酶及PGE受体表达明显下调。q PCR验证结果与芯片结果一致。[结论]糖皮质激素促进了人股骨头骨微血管内皮细胞分泌缩血管因子、促凝血的因子及相关受体的表达,降低了舒张血管因子及相应受体的表达。     

釉丛蛋白1表达对结直肠腺癌细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响

目的:探究釉丛蛋白1(TUFT1)表达对结直肠腺癌细胞(HCT-15)增殖、凋亡及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的影响。方法:2019年3月至2021年5月,20例结直肠癌(CRA)患者癌组织及相应癌旁组织。将HCT-15细胞分为对照组、siRNA-NC组、siRNA-TUFT1组、siRNA-TUFT1+IGF-1(PI3K/Akt通路激活剂25 ng/mL)组;实时荧光定量PCR检测组织及细胞中TUFT1表达;CCK-8法、克隆形成实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况;Western blot检测组织及细胞中增殖、凋亡及PI3K/Akt通路相关蛋白表达情况。结果:与癌组织相比,癌旁组织中TUFT1 mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.05);与对照组相比,siRNA-TUFT1组细胞增殖抑制率、G0/G1期细胞、细胞凋亡率、Caspase-3、Bax表达水平显著增加,而c-Myc、Cyclin D1表达水平、克隆细胞数、S期和G2/M期细胞、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt水平显著降低(P<0.05);IGF-1可逆转TUFT1沉默对上述指标的影响。结论:TUFT1表达沉默可能通过抑制PI3K/Akt通路激活来抑制HCT-15细胞增殖、促进凋亡。     

DESI2基因干扰联合PI3K抑制剂对人胰腺癌细胞ASPC-1的影响

目的 研究人凋亡相关新基因DESI2基因和PI3K抑制剂对人胰腺癌细胞ASPC-1的影响。方法 构建DESI2慢病毒干扰载体,并将细胞分为四组：（1）溶剂对照组;（2）PI3K抑制剂组;（3）DESI2干 扰+PI3K抑制剂组;（4）DESI2空载+PI3K抑制剂组。采用MTT检测细胞活性,流式检测细胞周期和调亡, Transwell检测细胞侵袭情况,qRT-PCR检测细胞DESI2、Caspase3、AKT、PI3K和mTOR mRNA的表达, Western blotting检测细胞DESI2、Caspase3、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、mTOR和p-mTOR蛋白表达情 况。结果 与溶剂对照组相比,PI3K抑制剂组和DESI2空载+PI3K抑制剂组细胞活性明显下降,G1期比 例升高,S期和G2期比例降低,凋亡明显升高,细胞侵袭能力明显下降,DESI2和Caspase3的mRNA和蛋 白水平表达明显升高,AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的蛋白表达量明显下降。与PI3K抑制剂组相比, DESI2干扰+PI3K抑制剂组细胞活性明显升高,G1期比例降低,S期比例升高,凋亡明显下降,细胞侵袭能 力明显升高,DESI2和Caspase3 mRNA和蛋白水平表达明显下降,AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的蛋白 表达量明显升高,研究数据组间比较均达到统计学显著水平（P<0.05）。 结论 PI3K抑制剂通过阻断PI3K/ AKT/mTOR信号通路,可以抑制人胰腺癌细胞ASPC-1的增殖及侵袭,促进细胞调亡;PI3K/AKT/mTOR信 号通路的功能状态能反馈调节上游DESI2基因的表达。     

壳五糖对骨肉瘤细胞抗肿瘤作用的研究

目的探讨壳五糖对骨肉瘤细胞的抗肿瘤作用及其作用机制。方法使用不同质量浓度的壳寡糖单糖(聚合度为2~6)处理3种骨肉瘤细胞系(MNNG、MG63、U2OS),48 h后采用CCK-8法评估细胞活力及细胞增殖情况,并通过流式细胞技术分析细胞周期及细胞凋亡的变化情况。利用Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。采用蛋白质免疫印迹法检测壳五糖处理前后细胞中磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号转导通路中关键蛋白表达水平的变化。结果壳寡糖单糖以剂量依赖性方式抑制骨肉瘤细胞的增殖,其中以壳五糖作用效果最佳,其在3种骨肉瘤细胞中的半数抑制浓度(IC50)分别为1.55 mg/mL(MNNG)、0.84 mg/mL(MG63)、0.76 mg/mL(U2OS)。壳五糖处理3种骨肉瘤细胞后显著抑制这些细胞的增殖和迁移能力,同时影响骨肉瘤细胞周期并促进细胞凋亡。蛋白质免疫印迹法检测显示,PI3K/AKT信号转导通路中的磷酸化PI3K、磷酸化AKT的表达明显下降。结论壳五糖可有效抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力,其作用机制可能是通过调控PI3K/AKT信号转导通路产生的。     

PTEN-PI3K/AKT信号传导途径对胃癌细胞株MKN28凋亡的影响

目的 探讨PTEN-PI3 K/AKT信号传导途径对胃癌细胞株MKN28凋亡的调控作用及其机制.方法 构建PTEN真核表达载体,转染至胃癌细胞株MKN28中(转染组);同样方法转染空载体和等量的PBS分别作为阴性对照组和空白对照组,检测对胃癌细胞株MKN28凋亡的影响及对PI3K、AKT、Caspase-3、Caspase-9的影响.MTT检测细胞生长曲线,TUNEL染色法检测细胞凋亡,Western blot检测蛋白的表达.PI3K抑制剂LY294002处理未转染PTEN的胃癌细胞株MKN28(处理组);对照组加入等量的PBS,抑制PI3K活性后检测细胞凋亡蛋白及凋亡相关蛋白的表达.组间比较采用t检验,时间依赖性检验采用相关分析方法.结果 成功构建PTEN真核表达质粒并转染至胃癌细胞株MKN28中,获得稳定过表达PTEN的细胞模型.MTT检测发现转染组胃癌细胞株MKN28生长明显受到抑制,且呈时间依赖性(r =0.938,P＜0.05).转染组平均凋亡率达到27.86％ ±4.78％,明显高于阴性对照组的0.01％±0.01％(t=9.527,P＜0.05).转染PTEN后,转染组PI3K蛋白表达量为0.25±0.03,明显低于空白对照组的0.93 ±0.16及阴性对照组的0.96±0.15(t=7.235,8.883,P＜0.05).转染组活化的AKT (P-AKT)蛋白表达量为0.21±0.03,明显低于空白对照组的0.93 ±0.13及阴性对照组的0.91±0.12(t =9.347,9.802,P＜0.05).而转染组凋亡相关蛋白Caspase-3及Caspase-9表达量分别为0.86±0.11和0.87±0.12,明显高于阴性对照组的0.16±0.03和0.18 ±0.04及空白对照组的0.15±0.02和0.16 ±0.03(t=10.634,10.999,9.448,9.942,P＜0.05).抑制PI3K活性后,处理组细胞凋亡率为28.60％ ±4.50％,明显高于对照组的0.12％±0.06％(t=10.961,P＜0.05).Western blot检测发现处理组PI3K和P-AKT的蛋白表达量分别为0.18 ±0.02和0.11 ±0.01,明显低于对照组的0.93 ±0.14和0.90 ±0.12(t =9.186,11.363,P＜0.05);同时处理组PTEN的蛋白相对表达量为1.15 ±0.15,明显高于对照组的0.21±0.08(t =9.577,P＜0.05).处理组的凋亡相关蛋白Caspase-3及Caspase-9相对表达量分别为0.86 ±0.12和0.88 ±0.11,明显高于对照组的0.25±0.02和0.21±0.03(t =8.685,10.178,P＜0.05).结论 高表达PTEN可以抑制PI3K/AKT途径,促进胃癌细胞凋亡;抑制PI3K途径可以促进PTEN的表达,两者之间相互作用,共同调控着胃癌细胞的凋亡.     

间充质干细胞外泌体通过TGF-β信号通路抑制成骨分化

目的 探究间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）来源外泌体对MSC成骨分化的影响及其可能的机制。方法 超速离心获得未被地塞米松干预和用地塞米松（10 μmol/L）干预的MSC外泌体：Exo-1和Exo-2。将MSC分为3组：对照组、Exo-1组和Exo-2组,成骨诱导分化培养7 d。生化检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性。流式检测细胞凋亡率。qRT-PCR检测炎症因子及TGF-β信号通路相关基因表达。Western blot检测TGF-β信号通路相关蛋白表达。结果 用地塞米松干预的MSC来源外泌体能够降低MSC细胞中ALP活性,细胞凋亡率升高,下调NF-κB mRNA表达、Smad3和RUNX2 mRNA和蛋白表达（P＜0.05）,上调IL-1β和TNF-α mRNA表达、TGF-β mRNA和蛋白表达（P＜0.05）。结论 用地塞米松（10 μmol/L）干预的MSC来源外泌体能通过TGF-β信号通路抑制MSC成骨分化,促进细胞凋亡和炎症反应。     

血管内皮细胞EA.hy926对短期低氧的反应性研究

目的观察短期低氧应激对血管内皮细胞的影响。方法制作血管内皮细胞低氧应激模型，采用低细胞毒性的染料AlamarBlue染色法测定常氧和低氧培养条件下的细胞活力，采用流式细胞技术检测细胞周期，采用膜联蛋白V-荧光素／碘化丙锭（Annexin V-fluoreseein／PI）双标记法检测细胞凋亡，应用蛋白免疫印迹方法（Westernblot），检测细胞内缺氧诱导因子和增殖细胞核抗原的表达。结果短期低氧（1～3h）应激可以增强血管内皮细胞活力，细胞周期显示细胞4倍体峰比例增高，随着低氧时间的延长（6～12h），细胞4倍体峰回落至常氧水平。短暂低氧（3h），细胞凋亡比例明显增高。蛋白免疫印迹检测显示，缺氧诱导因子-1α和增殖细胞核抗原在低氧后表达增高，与低氧反应呈时间效应依赖关系。结论短期低氧启动了以增殖和活力增高为特征的血管内皮细胞适应性反应，同时也诱导了以细胞凋亡为特征的细胞损伤性反应。     

自噬和PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在缺氧预处理对高糖心肌细胞缺氧/复氧损伤保护中的作用

目的 探讨自噬和磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 hydroxy kinase, PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）-雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）信号转导通路在缺氧预处理（hypoxia preconditioning, HPC）对高糖心肌细胞缺氧/复氧（anoxia/reoxygenation, AR）损伤中的作用及机制。 方法 将采用高糖培养基培养72 h的心肌细胞用随机数字表法分为5组：空白对照组（S组）、AR损伤对照组（AR组）、HPC组、渥曼青霉素＋HPC组（Wo＋HPC组）、雷帕霉素＋HPC组（Ra＋HPC组）。采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）检测试剂盒检测心肌细胞LDH漏出率,Annexin V/PI双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况,蛋白印迹法检测心肌细胞微管相关蛋白1轻链3（microtubulesas sociated protein light, LC3）-Ⅱ、Beclin-1、mTOR、PI3K表达和磷酸化（phospho, p）蛋白激酶B/蛋白激酶B（p-Akt/Akt）比值。 结果 与AR组比较,Wo＋HPC组LDH漏出率、早期和晚期凋亡率降低（P〈0.05）,LC3-Ⅱ和Beclin-1表达降低（P〈0.05）,mTOR、PI3K表达和p-Akt/Akt比值升高（P〈0.05）。HPC组各指标与AR组比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。与HPC组比较,Wo＋HPC组LDH漏出率、早期和晚期凋亡率降低（P〈0.05）,Beclin-1表达降低（P〈0.05）,mTOR、PI3K表达和p-Akt/Akt比值升高（P〈0.05）。 结论 激活PI3K-Akt-mTOR信号转导通路抑制自噬可明显改善HPC对高糖心肌细胞AR损伤的保护作用。     

PI3K/AKT/FOXO1信号通路参与复方中药CFF-1诱导的前列腺癌细胞凋亡和周期阻滞

目的:研究复方中药CFF-1诱导前列腺癌细胞的凋亡作用及其相关分子机制的探讨。方法:通过形态学观察、噻唑蓝(MTT)比色实验、CCK-8实验测定前列腺癌细胞的存活能力;采用DAPI染色法测定细胞核凝缩破裂;运用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定前列腺癌细胞的凋亡率。再通过PI单染流式细胞术测定前列腺癌细胞的周期变化;以及采用蛋白质免疫印迹实验检测PI3K/AKT/FOXO1信号通路以及其下游凋亡相关蛋白和周期相关蛋白的表达。结果:复方中药CFF-1使前列腺癌细胞周期阻滞在G1期,并呈浓度依赖性降低细胞的存活能力、增加细胞核凝缩破裂以及核小体的形成,显著提高前列腺癌细胞的凋亡率。在分子机制上,CFF-1呈现浓度依赖性下调PI3K/AKT活性,降低FOXO1磷酸化水平,进而上调FOXO1的转录活性,最终影响凋亡相关基因和周期相关基因的表达。结论:CFF-1对前列腺癌细胞的生长有显著的抑制作用,并且通过PI3K/AKT/FOXO1信号通路诱导前列腺癌细胞周期阻滞并发生凋亡,对治疗前列腺癌具有潜在的临床应用价值。     

二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时PI3K mRNA和Akt mRNA表达的影响

目的 评价二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K) mRNA和蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt) mRNA表达的影响.方法 培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,以1×106个/ml密度接种于96孔培养板(100μl/孔)或培养皿(2 ml/皿),采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=25).正常对照组(C组)不作任何处理;缺氧复氧组(H/R组)、二氮嗪预先给药组(DZ组)、二氮嗪预先给药+线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-羟葵酸组(DZ+ 5-HD组)均进行缺氧2h,复氧2h.DZ组和DZ+ 5-HD组在缺氧前2h分别加入100 μmol/L二氮嗪、100μnol/L二氮嗪+ 100 μmol/L 5-羟葵酸.于复氧2h时测定细胞活力、细胞凋亡率、PI3K mRNA和Akt mRNA表达.结果 与C组比较,H/R组细胞活力降低,细胞凋亡率升高,PI3K mRNA和Akt mRNA表达上调(P＜0.05或0.01);与H/R组比较,DZ组细胞活力升高,细胞凋亡率降低,PI3K mRNA和Akt mRNA表达上调(P ＜0.05或0.01);5-羟葵酸可逆转二氮嗪预先给药导致的上述改变(P＜0.05或0.01).结论 二氮嗪预先给药减轻大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤的机制与激活线粒体ATP敏感性钾通道,促进PI3K和Akt基因的转录有关.     

基于PI3K/Akt通路研究利拉鲁肽对2型糖尿病骨质疏松大鼠的作用

目的基于磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphateidylinositol-3 kinase/serine-threonine kinase,PI3K/Akt)通路研究利拉鲁肽对2型糖尿病性骨质疏松(type 2 diabetic osteoporosis,T2DOP)大鼠的影响。方法高脂高糖、腹腔注射30mg/kg链脲佐菌素(STZ)并摘除卵巢建立T2DOP大鼠模型,将大鼠随机分为模型组、利拉鲁肽组、利拉鲁肽+LY294002组;正常饲养大鼠作为正常组,每组10只。大鼠体重,空腹血糖,股骨组织形态,血清中骨保护素(OPG)、细胞核因子KB受体活化因子配基(RANKL)水平,骨密度,股骨组织中磷酸化-PI3K(p-PI3K)、PI3K、磷酸化-Akt(p-Akt)、Akt蛋白水平进行比较。结果模型组大鼠体重、FBG,血清中RANKL水平升高(P0.05),血清中OPG水平、股骨组织骨密度,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平降低(P0.05);而利拉鲁肽组大鼠体重、FBG,血清中RANKL水平降低(P0.05),血清中OPG水平、股骨组织骨密度,pPI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平升高(P0.05);利拉鲁肽添加PI3K抑制剂LY294002后逆转利拉鲁肽症状。结论利拉鲁肽激活PI3K/Akt通路实现对T2DOP大鼠骨质疏松的保护。     

内皮细胞凋亡在脓毒症小鼠肺微血管通透性改变中的作用

目的 探讨肺微血管内皮细胞凋亡在脓毒症小鼠肺微血管通透性改变中的作用。方法 ２４只雄性昆明小鼠随机分为２组,盲肠结扎穿孔组（ＣＬＰ组）和假手术组（ＳＯ组）;每组再分３ｈ和１２ｈ２个时间点。以流式细胞仪和原位凋亡检测试剂盒检测肺微血管内皮细胞的凋亡。用ＲＴ－ ＰＣＲ的方法检测肺微血管内皮细胞中ｂｃｌ－２基因的表达善况。同时还用尾静脉注射伊文蓝的方法检测了肺微血管通透性的改变。结果 在ＣＬＰ组１２ｈ点     

二甲双胍调控PI3K/Akt/mTOR通路减轻糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡

目的探讨二甲双胍(Met)调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路对糖皮质激素地塞米松(Dex)诱导的成骨细胞凋亡的影响。方法将体外培养的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1分为对照组(正常培养)、Dex组(以Dex处理)、Met组(以Dex和Met共同处理)、Met+IGF-1组(以Dex、Met和PI3K/Akt/m TOR通路活化剂IGF-1共同处理)、Met+NVP-BEZ235组(以Dex、Met和PI3K/Akt/m TOR通路抑制剂NVP-BEZ235共同处理),采用免疫印迹法(WB)检测MC3T3-E1细胞中PI3K、Akt、磷酸化(p)-Akt、m TOR和p-mTOR蛋白表达水平,通过噻唑蓝(MTT)法检测MC3T3-E1细胞存活率、流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡率、实时荧光定量PCR检测MC3T3-E1细胞中Bcl-2和Bax mRNA表达水平、Caspase-3活性测定试剂盒检测MC3T3-E1细胞Caspase-3活性、JC-1探针检测MC3T3-E1细胞线粒体膜电位变化。结果与对照组比较,Dex组细胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平和细胞存活率、Bcl-2 mRNA表达水平以及线粒体膜电位均明显降低,而细胞凋亡率、Bax mRNA表达水平和Caspase-3活性均明显升高(P0.05);与Dex组比较,Met组细胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平和细胞存活率、Bcl-2 mRNA表达水平以及线粒体膜电位均明显升高,而细胞凋亡率、Bax mRNA表达水平、Caspase-3活性明显降低(P0.05);给予IGF-1作用后Met对MC3T3-E1细胞的作用效果明显增强,而给予NVP-BEZ235作用后Met对MC3T3-E1细胞的作用效果明显减弱(P0.05)。结论 Met可通过激活PI3K/Akt/m TOR通路抑制线粒体凋亡途径,减轻糖皮质激素Dex诱导的成骨细胞凋亡。     

PI3K／PKB信号转导通路在重症急性胰腺炎胰腺损伤中的作用

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/PKB）信号转导通路对重症急性胰腺炎胰腺损伤的作用。方法 健康成年雄性SD大鼠30只，随机分为对照组、SAP组（S组）和SAP＋wortmannin（S＋W）组，每组10只。胆胰管内逆行注射法制作SAP模型。制模6h后取胰腺组织，检测各组含水量、MPO水平及病理改变；采用酶联免疫吸附法（ELISA）及RT-PCR技术检测胰腺组织TNF-α和IL-1β的蛋白及mRNA的变化、蛋白印迹（Western Blot）法检测p-PKB的活性变化。结果 制模6h后S组和S+W组较对照组胰腺组织含水量增加（P<0.01），MPO水平明显升高（P<0.01）；病理学发现胰腺明显出血、坏死和炎性细胞浸润；胰腺组织TNF-α和IL-1β的蛋白及mRNA水平明显增加（P<0.01），p-PKB水平明显升高（P<0.01）。S＋W组较S组胰腺组织水肿及病理改变减轻（P<0.01）、MPO水平降低（P<0.01），同时TNF-α和IL-1β的蛋白含量及mRNA表达减少（P<0.01），p-PKB水平降低（P<0.01）。结论 PI3K/PKB信号传导通路被激活是重症急性胰腺炎胰腺损伤的重要发病机制之一。     

Effects of hyperparathyroidism patients’ serum and klotho protein on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells

Objective To investigate the effects and underlying mechanism of secondary hyperparathyroidism (SHPT) patients’serum and klotho protein on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods Three types of mixed serum from 15 patients with SHPT (serum S), 10 CKD stage 5 patients without SHPT (serum C) and 15 healthy volunteers (serum H) were collected. HUVECs were incubated with 10% serum H,10% serum C, 10% serum S and 10% serum S plus klotho respectively. The apoptosis rate of endothelial cells was evaluated by flow cytometry. The activity of Caspase-3 was measured by spectrophotometry. The levels of AKT and phosphorylated forms of AKT (p- AKT) were detected by Western blotting (with or without PI3K/AKT inhibitor LY294002). Results The apoptosis of HUVECs was both induced by the serum S and serum C. The apoptosis rate was greater in serum S group than that in serum C group (P＜0.05). The apoptosis was partly inhibited when klotho protein (50-100 μg/L) was added (P＜0.05), accompanying the up-regulation of p-AKT. The above effects could be blocked by LY294002. The activity of Caspase-3 was up-regulated in SHPT group compared to healthy control group (P＜0.05) and the up-regulation could also be inhibited by klotho protein (P＜0.05). Conclusions The apoptosis of HUVECs is induced by the serum from CKD stage 5 patients without SHPT and SHPT patients. Klotho protein can protect the HUVECs from apoptosis by up-regulating p-AKT and inhibiting Caspase-3.     

染料木黄酮通过促进VEGF 表达改善去势大鼠骨质疏松的作用机制

目的观察染料木黄酮(Genistein Gen)通过促进VEGF表达改善去势大鼠骨质疏松的作用机制。方法建立绝经大鼠模型,6月龄雌性大鼠40只,随机分为对照组,假手术组、去势组、Gen干预6周组、Gen干预12周组。光镜下观察各组股骨头结构,分析大鼠股骨头空缺骨陷窝数的变化。ELISA检测血管内皮生长因子(VEGF),观察VEGFmRNA原位杂交表达强度并分析。结果与对照组相比,去势组骨密度值下降,Tb.Th明显下降(P0.05)。干预10周组骨密度值明显升高,Tb.Th明显升高,差异均有统计学意义(P0.05)。糖尿病大鼠股骨头随病程发展骨小梁变稀薄。Gen对去卵巢大鼠血清中VEGF的表达无影响。VEGF mRNA在骨髓腔血管内皮细胞表达上升(P0.05)。结论 Gen可促进血管内皮细胞增殖,促进血管形成,改善去势大鼠骨质疏松抗骨质疏松倾向。     

人脐带间充质干细胞防治早期激素性股骨头坏死的作用及其机制

目的探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对大鼠早期激素性股骨头坏死(GC-ONFH)防治作用及其机制。方法将48只SD大鼠完全随机法分为4组:对照组、模型组、低剂量治疗组、高剂量治疗组。使用注射用甲泼尼龙琥珀酸钠建立GC-ONFH的模型,并给予不同剂量的hUC-MSCs干预。6周后分离股骨头组织,利用苏木精-伊红(HE)染色、原位缺口末端标记法(TUNEL)染色、微型CT(Micro-CT)、蛋白质印迹法(Western blot)和定量聚合酶链反应(qPCR)评价股骨头坏死、细胞凋亡、骨密度及凋亡相关蛋白mRNA表达水平。采用t检验和完全随机设计的方差分析。结果对照组、模型组、高剂量治疗组和低剂量治疗组股骨头坏死发生率分别为0(0/12)、83%(10/12)、17%(2/12)、50%(6/12),空骨陷窝率和细胞凋亡率分别为(2.301±1.238)%、(26.138±2.742)%、(10.229±2.658)%和(13.518±2.241)%,治疗组中空骨陷窝率和细胞凋亡率显著低于模型组(F=13.45,P<0.05),差异有统计学意义。Micro-CT结果显示对照组、模型组、高剂量治疗组和低剂量治疗组骨体积分数分别为(0.618±0.147)%、(0.250±0.130)%、(0.563±0.127)%、(0.358±0.057)%,骨小梁厚度分别为(0.448±0.086)、(0.218±0.082)、(0.418±0.059)、(0.292±0.051)mm,骨小梁间隙分别为(0.042±0.010)、(0.016±0.008)、(0.036±0.004)、(0.023±0.004)mm,骨小梁数量分别为(4.233±1.137)、(1.950±0.650)、(3.633±0.717)、(2.333±0.457)/mm,治疗组上述指标显著高于模型组(F=11.75、13.02、14.22、10.79,P<0.05),差异有统计学意义。Western blot检测对照组、模型组、高剂量治疗组和低剂量治疗组B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bcl-2)蛋白表达分别为(1.000±0.039)、(7.508±0.253)、(1.540±0.182)、(3.778±0.160),bcl-2蛋白表达分别为(1.000±0.053)、(0.202±0.046)、(0.745±0.083)、(0.485±0.065),半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达分别为(1.000±0.045)、(8.917±0.238)、(1.694±0.189)、(4.250±0.164),qPCR检测对照组、模型组、高剂量治疗组和低剂量治疗组bax mRNA表达分别为(1.000±0.056)、(4.433±0.192)、(1.933±0.142)、(2.367±0.134),bcl-2 mRNA表达分别为(1.000±0.037)、(0.227±0.029)、(0.793±0.032)、(0.617±0.036),Caspase-3 mRNA表达分别为(1.000±0.062)、(4.467±0.393)、(1.800±0.180)、(2.600±0.131),模型组bcl-2表达显著低于对照组,Caspase-3、bax表达显著高于对照组,经hUC-MSCs干预后情况改善显著(F=67.74、54.68、104.40,P<0.05),差异有统计学意义。结论hUC-MSCs可能通过调节bax、bcl-2、Caspase-3的表达,抑制糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡,有助于防治大鼠早期GC-ONFH。     

磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路在丁苯酞保护心肌缺血再灌注损伤中作用机制的实验研究

目的观察丁苯酞预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用以及磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路在此过程中的作用。方法将大鼠心肌细胞(H9C2)随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、丁苯酞预处理组(I/R+NBP组)。通过氧气剥夺以及无糖培养基的更换模拟6 h缺血4 h复灌心肌缺血模型。通过细胞计数检测试剂盒(CCK-8)检测不同药物浓度细胞活性,探索丁苯酞的最佳药物浓度;比色法检测各组乳酸脱氢酶(LDH)以及丙二醛(MDA)含量;蛋白质印迹法(Western blot)检测PI3K、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和Akt的蛋白表达水平;定量聚合酶链反应(qPCR)技术检测白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在核糖核酸(mRNA)水平的表达。多组之间比较采用单因素方差分析,两组之间比较采用t检验。结果丁苯酞的最佳用药浓度为100μmol/L;I/R组MDA、LDH的表达量高于Sham组[(172.03±14.99)nmol/L比(38.98±6.49)nmol/L、(195.04±14.50)%比(100.00±0.00)%,t=14.106、11.354,P<0.05];I/R组IL-1β、TNF-α的表达量高于Sham组(22.36±2.71比1.00±0.00、6.20±0.31比1.00±0.00,t=13.660、28.874,P<0.05);I/R组PI3K、p-Akt的表达量也高于Sham组(0.61±0.34比0.34±0.01、0.95±0.04比0.36±0.04,t=13.487、18.392,P<0.05),差异有统计学意义。I/R+NBP组MDA、LDH的表达量低于I/R组[(56.98±4.79)nmol/L比(172.03±14.99)nmol/L、(140.34±4.44)%比(195.04±14.50)%,t=12.661、7.890,P<0.05];I/R+NBP组IL-1β、TNF-α的表达量低于I/R组(6.66±0.60比22.36±2.71、1.76±0.11比6.20±0.31,t=9.798、23.352,P<0.05),差异有统计学意义;I/R+NBP组PI3K、p-Akt的表达量高于I/R组(1.00±0.05比0.61±0.34、1.27±0.04比0.95±0.04,t=11.440、10.432,P<0.05),差异有统计学意义。结论丁苯酞可以通过减少细胞损伤、抑制氧化及炎性反应进而减轻心肌缺血再灌注损伤,该过程可能有PI3K/Akt通路的参与。