十二指肠钩虫金属蛋白酶组织抑制剂同源物Ad-TIMPL-1基因克隆及其原核表达

目的克隆十二指肠钩虫金属蛋白酶组织抑制剂同源物(TIMPL)Ad-TIMPL-1基因并进行原核表达。方法分别用3’RACE及RT-PCR技术从十二指肠钩虫成虫cDNA中扩增编码Ad-TIMPL-1的cDNA3’末端及5’末端序列;序列经拼接后进行初步生物信息学分析;将Ad-TIMPL-1成熟肽编码序列克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组表达质粒;重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。结果成功克隆获得了编码Ad-TIMPL-1的全长cDNA序列并登记到GenBank(accession no.EF495071);Ad-TIMPL-1完整阅读框为396bp,编码132个氨基酸残基组成的蛋白,含16个氨基酸残基组成的信号肽;成功构建了原核表达重组质粒pET-32a/Ad-TIMPL-1,并在大肠杆菌中得到了表达。结论本研究首先从十二指肠钩虫中克隆到了Ad-TIMPL-1基因并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

十二指肠钩虫谷胱甘肽转移酶AduGST-1基因的克隆和重组表达

目的克隆十二指肠钩虫谷胱甘肽转移酶(GST)AduGST-1基因,并在大肠埃希菌中表达获得重组AduGST-1。方法设计特异引物,以十二肠钩虫成虫cDNA为模板,通过PCR扩增AduGST-1基因。将获得的AduGST-1编码序列克隆至原核表达载体pETHF,构建重组表达质粒pETHF/AduGST-1。重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达、Ni亲和层析分离纯化重组AduGST-1,SDS-PAGE分析重组蛋白表达及纯化情况。结果成功扩增到AduGST-1全长编码序列,并登记到GenBank(accession no.JQ812812)。AduGST-1编码序列长度为624bp,编码307个氨基酸残基。成功构建了重组表达质粒pETHF/AduGST-1,在BL21(DE3)中表达并纯化了重组AduGST-1。结论首次报道从十二指肠钩虫中分离到GST基因,该基因可在大肠埃希菌中高效表达,并分离纯化了重组GST蛋白,为进一步研究AduGST-1功能与应用奠定了基础。     

美洲钩虫Ascris型蛋白酶抑制剂1的特性鉴定

目的 制备重组美洲钩虫Ascris型蛋白酶抑制剂1(rNaTIL-1),并观察其抗凝血活性及抑制丝氨酸蛋白酶作用.方法 从美洲钩虫成虫cDNA中扩增获得NaTIL-1编码基因,连接入原核表达质粒pET32a-sumo后转入到大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,重组产物经Ni-NTA亲和层析纯化,纯化柱上...     

十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1) 基因的克隆及原核表达

目的克隆十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因并在大肠杆菌中表达。方法运用3′RACE及RT-PCR技术分别扩增Ad-FAR-1 cDNA部分片段,获得序列经拼接后利用在线BLAST程序检索GenBank中相似的核酸序列及推导的氨基酸序列;设计引物,将Ad-FAR-1成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。结果成功克隆到Ad-FAR-1全长cDNA序列并构建了pET32a/Ad-FAR-1原核表达重组质粒,Ad-FAR-1融合蛋白在大肠中得到了高效表达。结论成功获得并表达了十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因,为进一步研究该蛋白的特性与功能奠定了基础。     

十二指肠钩虫ASP-2基因密码子优化及在大肠杆菌中高效表达

目的:获得十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)分泌蛋白2(mAd-ASP-2)编码基因,构建其高效表达的大肠杆菌表达体系?方法:以RT-PCR的方法得到克隆了编码mAd-ASP-2的成熟肽全基因序列,克隆入原核表达载体pET-22b(+)中,组装成表达载体pET-22b-mAd-ASP-2?利用大肠杆菌偏爱密码子和GenScript rare codon analysis 软件获得优化密码子优化的mAd-ASP-2*基因序列并人工合成该基因,将其克隆入原核表达载体pET-22b(+),组装成表达载体pET-22b-mAd-ASP-2*?将这2个表达载体分别转化入大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami-2(DE3)中,经IPTG诱导表达?结果:同样条件下,密码子优化的mAd-ASP-2*基因比优化前能够获得较高的表达,且以可溶形式存在?利用His Trap HP亲和柱获得了纯化的重组蛋白mAd-ASP-2*,确定了纯化重组蛋白咪唑洗脱液最佳浓度为200 mmol/L?Western blot分析结果进一步显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白?结论:通过密码子优化实现了十二指肠钩虫ASP-2的高效表达,为进一步研究Ad-ASP-2的功能和以其作为血清学诊断抗原或保护性疫苗奠定了基础?     

白色念珠菌天冬氨酸蛋白酶与菌株毒力的研究

目的：观察分泌型天冬氨酸蛋白酶（secreted aspartic proteinase,SAP)与念珠菌致病性的关系。方法：从住院病人中分离培养出50株念珠菌，鉴定菌种后采用限制氮盐的培养基半定量测定天冬氨酸蛋白酶，并筛选蛋白酶阳性或阴性菌株。经证实为系统感染的10株菌株腹腔感染健康小鼠。结果：白色念珠菌天冬氨酸蛋白酶阳性率高达90%。类星型和伪热带次之。蛋白酶阳性或阴性的念珠菌对健康小鼠均无致病性。结论：天冬氨酸蛋白酶在正常条件下并不能增加白念菌的侵蚀性和致病力。     

HIV蛋白酶抑制剂的抗白念珠菌作用

由白念珠菌引起的口咽念珠菌病是HIV感染者常见的机会感染.自从应用高效抗逆转录病毒治疗以来,HIV感染者口咽念珠菌病的发生率明显下降.HAART降低口咽念珠菌病发病率不仅是由于改善了患者的免疫力,而且还由于HAART中的蛋白酶抑制剂抑制了白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶的活性、形态转换及其生长过程而发挥其抗念珠菌的作用.本文综述了PI抗白念珠菌的机制.     

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9的研究进展

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)是一类半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶族,该家族是执行细胞凋亡的主要酶类,近年来的研究发现,该酶参与多种疾病的发生发展,尤其是肿瘤、自身免疫性疾病和病理性瘢痕。caspase-9是该家族中的启动分子,在凋亡途径中起了重要的作用,本文综述caspase-9的结构特点、活化与调节,以及导致凋亡的机制和与临床上部分疾病的关系。     

建鲤重组Cystatin蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体制备

目的:对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPIs)Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并以重组Cystatin为抗原制备多克隆抗体。方法:用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导转入pET-30a-Cystatin的E.coli BL21(DE3)表达重组蛋白,经过Ni 2+-NTA镍离子亲和层析纯化重组Cystatin,高效液相色谱鉴定重组Cystatin的纯度,Azocasein法测定其对木瓜蛋白酶的抑制作用。利用QuickAntibody-Mouse5W快速佐剂和纯化的重组Cystatin免疫Balb/C小鼠获得抗血清,采用夹心ELISA法鉴定抗血清的效价,Western blotting和免疫组织化学法鉴定抗血清的抗原识别特异性。结果:原核表达的目的蛋白相对分子质量约20 000;镍亲和层析纯化后重组Cystain在SDS-PAGE上显示单一条带,纯度>95%;Azocasein法检测,0.014μg重组Cystain抑制木瓜蛋白酶活性达50%以上;ELISA夹心法检测获得的Cystatin抗血清效价达到1∶512 000;Western blotting检测,转入pET-30a空质粒的全菌蛋白中未检测到Cystatin存在,而在转入pET-30a-Cystatin的全菌蛋白及纯化各步样品中均检测到Cystatin信号,且均为单一条带;免疫组织化学检测,建鲤各组织呈现不同强度的Cystatin阳性染色,抗血清中的多克隆抗体与原核和真核表达的Cystatin均特异性结合。结论:成功表达和纯化了建鲤Cystatin;获得含高效价多克隆抗体的Cystatin抗血清,具有高特异性和灵敏性。     

犬钩虫抗凝肽AcaNAP8的原核表达及其抗凝活性

目的在大肠杆菌中重组表达犬钩虫抗凝肽AcaNAP8基因,并检测表达产物抗凝活性。方法设计引物,将AcaNAP8成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,构建重纽表达质粒;成功构建的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中用IPTG诱导表达,SDS—PAGE分析表达情况;诱导表达的重组蛋白用Ni亲和层析进行纯化;用凝血酶原时间（PT）和活化的部分凝血活酶时间（aPTT）检测重组产物体外抗凝活性。结果成功构建了pET32a／AcaNAP8原核表达重组质粒,在大肠杆菌中成功表达并获得了重组AcaNAP8,表达产物能明显延长PT及aPTT。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP8融合蛋白,表达产物具有显著抗凝活性。该实验为进一步探讨AcaNAP8的作用机制及应用奠定了基础。     

克氏锥虫的新过氧化物酶基因克隆表达研究（英文）

目的为了探索克氏锥虫的谷胱甘肽依赖的过氧化物酶活性。方法使用基因克隆与表达鉴定的方法学对克氏锥虫谷胱甘肽依赖的过氧化物酶基因克隆和表达。结果一个全新的、18kDa的克氏锥虫单拷贝过氧化物酶基因被完全克隆到E.coli的表达载体pHrcHis上,并测序。蛋白序列分析表明与基因库谷胱甘肽依赖的过氧化物酶有高度的同源性。其表达蛋白被纯化分离,测定其酶活性显示了良好的活性,并能被亚油酸-氢过氧化物饱和。结论结果证实克氏锥虫仍然存在过氧化物酶介导的生物代谢。     

大肠杆菌偏嗜性密码子组成的人降钙素(hCT)编码序列的克隆

目的：克隆适于在大肠杆菌(Escherichia coli，E．coli)中表达的人降钙素(hCT)基因，为提高其表达水平奠定基础。方法：根据大肠杆菌密码子频率表，在不改变hCT。氨基酸组成的前提下，设计并合成适于在大肠杆菌中表达的编码hCT的DNA序列，经PCR扩增后，与质粒载体pGEM^R-Teasy进行连接。连接产物转化感受态JM109大肠杆菌，筛选阳性菌落，经扩大培养后，对所含重组质粒进行鉴定。结果：经酶切鉴定及DNA序列分析证实，hCT编码DNA序列成功地克隆人pGEM^R-Teasy载体中，其序列与设计的完全一致。结论：完成了大肠杆菌偏嗜性人降钙素基因的克隆，为下一步hCT表达载体的构建及在大肠杆菌中进行表达的研究奠定了基础。     

结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究

目的　为结核病新型疫苗研制提供靶基因和靶抗原。方法　根据结核杆菌 H 37Rv株免疫保护性抗原 Ag85 A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物 ,以结核杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增获得具有完整开架读码框 (ORF)的 Ag85 A抗原基因 ,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体 p BK- CMV构建重组质粒 ,重组质粒转入大肠杆菌后 IPTG诱导表达 ,并对其表达产物进行 Western- blotting分析。结果　PCR扩增获得了具有完整开架读码框的 Ag85 A抗原基因 ;构建了 Ag85 A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体 ;Ag85 A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达。结论　成功地对结核杆菌免疫保护性抗原 Ag85 A进行了基因克隆与表达 ,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础     

大肠杆菌S—腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与表达

应用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中扩增出长约１．１ｋｂ的Ｓ－腺苷甲硫氨酸合成酶基因,将其插入高表达载体ｐＥＴ１１ｃ的ＮｄｅＩ和ＢａｍＨＩ位点中,转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描结果表明,重组菌Ｓ－腺苷甲硫 酸合成酶的表达量点菌体总可溶性蛋白含量的５８．３％,酶活测定结果表明,重组菌Ｓ－腺苷甲硫氨酸合成酶的活力比宿主菌高７倍。     

入免疫缺陷病毒1型蛋白酶抑制剂的微生物筛选模型的建立

目的采用基因工程方法,建立人免疫缺陷病毒１型蛋白酶（ＨＩＶ－１ＰＲ）的微生物检测法,用以筛选抗ＨＩＶＰＲ抑制剂。方法合成编码ＨＩＶ－１ＰＲ识别序列２４ｂｐ低聚核苷酸片段,并将其插入质粒ｐＢＲ３２２四环素耐药基因ｔｅｔｒ,经亚克隆构建含突变之四环素耐药基因ｍｔｅｔｒ的ｐＡＣＹＣ１８４Ｍ。以后者转染含ＨＩＶ－１ＰＲ表达载体（ｐＰＯＬＯ）的大肠杆菌,构建能同时表达四环素耐药蛋白及ＨＩＶ－１ＰＲ之工程菌（ＴＬＶ３３１）。结果在选择培养基内,ＴＬＶ３３１生长受ＨＩＶ－１ＰＲ控制,ＨＩＶ－１ＰＲ表达时可破坏ＴＬＶ３３１四环素抗性;ＨＩＶ－１ＰＲ活性受到抑制时,其四环素抗性则恢复。此特性经ＨＩＶ－１ＰＲ的已知抑制剂验证并以该法对３１个化学合成样品进行筛选。结论通过基因工程方法建立了ＨＩＶ－１ＰＲ的微生物检测法,该法可作为抗ＨＩＶＰＲ抑制剂之初筛模型。