重组腺病毒Ad-绿色荧光蛋白/干细胞白血病基因的构建及在Cajal间质细胞缺失模型鼠体内的分布和表达

目的研究绿色荧光蛋白(GFP)标记的人干细胞白血病基因(SCL)重组腺病毒载体的快速构建及在Cajal间质细胞(ICC)缺失模型鼠体内的分布和表达,为进一步研究慢传输型便秘(STC)的基因治疗奠定基础。方法利用Ad-Easy系统、细菌内同源重组法快速构建重组腺病毒Ad-GFP/SCL。经尾静脉注射1.6×109PFU的重组腺病毒给ICC缺失模型Balb/c小鼠,在不同的时相点检测重组腺病毒在小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠及结直肠组织内的分布和表达;苏木精-伊红染色法观察重组腺病毒的体内毒性;RT-PCR法分析重组腺病毒介导的SCL mRNA在各脏器内的表达。结果通过荧光显微镜观察,在不同时期可以观察到小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠及结直肠组织内有不同程度的GFP表达;苏木精-伊红染色法显示各脏器未见明显毒性反应;RT-PCR法分析显示各脏器均有不同程度的SCL mRNA表达。结论成功构建的重组腺病毒Ad-GFP/SCL可介导SCL基因在ICC缺失模型Balb/c小鼠体内安全、稳定地表达,为进一步在体研究STC的基因治疗奠定了基础。     

重组腺相关病毒介导的血红素加氧酶1基因和绿色荧光蛋白基因在肝移植大鼠肝脏中的表达

目的 构建提纯重组腺相关病毒介导的血红素加氧酶1基因(HO-1)和绿色荧光蛋白基因(GFP),并探讨其在肝移植大鼠肝脏中的表达情况.方法 克隆大鼠HO-1,构建重组腺相关病毒-HO-1(rAAV-HO-1)载体,酶切鉴定并进行测序,氯化钙共沉淀法与辅助质粒Virus helper、AAV-cap-rep转染包装细胞,应用肝素层析柱法纯化浓缩病毒,实时荧光定量PCR测定病毒滴度.应用二套管法建立Wistar→Wistar大鼠原位肝移植模型.将提纯的重组腺相关病毒-GFP(rAAV-GFP)在供肝冷保存阶段经门静脉靶向转染并孵育2 h后行大鼠原位肝移植,分别于术后1、3个月处死大鼠取材,冰冻切片荧光显微镜下观察不同组织GFP的表达情况及转染效率.结果 rAAV-HO-1重组子经酶切电泳检测表明插入片段大小正确,测序结果与Genbank一致.rAAV-GFP靶向转染供肝1、3个月冰冻切片荧光显微镜下观察,移植肝GFP表达效率均＞80%,且在心、肺、脾、肾、肠等组织中未见报告基因的表达.结论 成功构建并提纯了携带HO-1、GFP基因的高滴度的腺相关病毒,验证了腺相关病毒介导的GFP在肝移植大鼠肝脏中稳定高效的表达.     

光敏剂m-THPC在原位移植性肝癌大鼠体内的组织分布和药代动力学研究

目的 探讨光敏剂m-THPC在原位移植性肝癌大鼠体内的分布和消除情况,为m-THPC光动力治疗肝癌提供参考和依据.方法 大鼠尾静脉注射m-THPC 0.3 mg/kg后,采用荧光分光光度计法测定组织和血浆中的原形药物浓度,用PK-GRAPH程序拟合并计算药代动力学参数.结果 m-THPC血药浓度-时间曲线符合二室模型,血浆分布半衰期(T1/2α)为1.18 h,血浆消除半衰期(T1/2β)为22.57 h.药物在大鼠体内分布广泛,各组织药物浓度均在40 ng/g以上;其中肝脏组织浓度最高,肝癌次之,肌肉、皮肤组织相对较低,给药6 h后多数组织药物浓度达到最高,24 h后多数组织药物浓度有所下降,而肝癌药物浓度在24 h达到最高,肝癌和正常组织药物分配比也达到最高.结论 m-THPC在大鼠组织中分布广泛,血浆药物清除相对较快;给药后24 h是肝癌光动力治疗的最佳时间窗.

Abstract：

Objective To study the pharmacokinetics, distribution and excretion of m-THPC in rat models of liver cancer via orthotropic implantation using Walker-256. Methods After an intravenous injection of m-THPC with 0.3 mg/kg, the concentrations of m-THPC in biological specimens were determined by a fluorescence method. The data obtained were processed with PK-GRAPH pharmacokinetic procedure. Results The disposion of m-THPC in rat models of liver cancer Walker-256 was conformed to a two compartment model with T1/2α = 1.18 h, T1/2β =22. 57 h at the dose of 0. 3 mg/kg. m-THPC was shown to be widely distributed to the various tissues. There was a highest drug accumulation in liver and liver cancer, and lowest in skin and muscle. Ratio of m-THPC concentration in the Walker-256 tumor compared to normal tissue reach the peak 24 h after m-THPC administration. Conclusions m-THPC is distributed widely and eliminated at a rapid rate in Walker-256 rats. Twentyfour hours after m-THPC administration may be the best time for photodynamic therapy of liver cancer.     

经诱导的绿色荧光蛋白转基因C57BL雄鼠脾细胞移植重建雌鼠造血功能研究

目的探讨雄性C57BL绿色荧光蛋白（GFP）鼠诱导的脾细胞移植对造血衰竭小鼠造血重建的作用。方法建立小鼠造血衰竭模型,移植鱼卵提取物诱导的雄性C57BL荧光鼠脾细胞,检测诱导后细胞的干细胞标志抗原表达;观察受体存活时间,检测外周血白细胞计数、外周血GFP阳性细胞,进行荧光原位杂交检测Y染色体;各组受体脾和肺切片观察GFP细胞分布。结果鱼卵提取物诱导的雄性C57BL荧光鼠脾细胞比未诱导的脾细胞表达更多的干细胞标志抗原。1×106个脾细胞经尾静脉回输经致死剂量照射的雌性小鼠,明显延长小鼠存活时问,提高小鼠外周血白细胞计数。诱导组受体外周血中检测到GFP阳性细胞,骨髓中检测出60％的细胞含Y染色体。诱导组受体脾和肺切片观察到GFP阳性细胞分布。结论鱼卵提取物诱导的小鼠脾细胞中含较多的多能干细胞,回输给造血衰竭小鼠能重建其造血功能。     

罗哌卡因股神经导管不同给药方式对术后镇痛的影响

目的 探讨罗哌卡因股神经导管不同给药方式用于全膝关节置换术后镇痛的效果.方法 拟行全膝关节置换术患者40例,随机均分为持续给药组(A组,0.20％罗哌卡因)和间断给药组(B组,0.33％罗哌卡因).观察患者术后48 h内VAS评分及拔管后24 h股神经感觉功能和改良Bromage评分.结果 术后24hB组静息和运动时VAS评分均明显低于A组(P＜0.05或P＜0.01).术后48 hB组运动时VAS评分明显低于A组(P＜0.05).B组罗哌卡因用量明显低于A组(P＜0.01).B组芬太尼用量明显低于A组(P＜0.05).所有患者神经功能恢复均未出现延迟.结论 经股神经导管持续或间断给予罗哌卡因均能提供较好的镇痛效果,对股神经功能均没有明显影响;0.33％罗哌卡因间断给药可减少镇痛药用量.     

红细胞分布宽度、淋巴细胞与C反应蛋白比值和诺丁汉评分对老年髋部骨折术后30天内死亡的预测价值

目的探讨淋巴细胞与C反应蛋白比值(LCR)、红细胞分布宽度(RDW)、诺丁汉髋部骨折评分(NHFS)及三者联用对老年髋部骨折关节置换术后30 d死亡率的预测价值。方法收集2020年1月至2022年4月于郑州大学第一附属医院收治诊断为髋部骨折并实施关节置换手术的225例患者的病例资料及随访资料, 其中女性患者169例, 男性患者57例, 年龄(78.0±7.9)岁, 术后对患者进行随访, 记录患者术后30 d内的生存情况。通过生存结局分为生存组(214例)和死亡组(11例), 对死亡的相关因素先进行单因素分析, 再将差异有统计学意义的指标进行二分类多因素回归分析独立危险因素, 而后绘制受试者工作特征(ROC)曲线检验其对术后30 d死亡率的预测价值。结果生存组中性别、年龄、血红蛋白值、LCR、RDW、NHFS、美国麻醉医师学会(ASA)分级在单因素分析中较死亡组差异有统计学意义(P<0.05);在多因素回归分析中, NHFS的升高、RDW≥13.6%、LCR<13 664.5为老年髋部骨折关节置换术后30 d死亡的独立危险因素。LCR、RDW、NHFS及三者联合应用预测老年髋...     

Systematic evaluation of distribution of transgene expression after adenovirus-mediated gene transfer to the transplanted heart

In the transplantation setting, the study and potential treatment of acute and chronic rejection by means of gene therapy will require widespread transgene expression in the donor organ. The distribution of transgene expression after adenovirus-mediated gene transfer via the coronary vasculature in a model of abdominal heterotopic heart transplantation in syngeneic rats (n = 6) was evaluated at 1 week. Reporter gene expression was evenly distributed in the base, the midventricle, and the apex of the transplanted hearts. This study demonstrates that intracoronary administration of the adenoviral vector to the donor heart results in widespread transgene expres- sion. Received: 9 December 1997 Received after revision: 24 March 1998 Accepted: 15 April 1998     

凋亡素基因重组腺病毒的构建

目的构建携凋亡素基因的腺病毒载体,为进一步研究凋亡素基因功能及其作用机制建立基础。方法Pmel酶切线性化已经构建好的含凋亡素基因的穿梭质粒pAdTrack-CMV-VP3,然后电转化到BJ5183-AD-1细胞中进行同源重组。PacⅠ酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA,然后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒,运用RT-PCR鉴定重组腺病毒。用氯化铯梯度离心纯化病毒。用物理和生物方法确定病毒的滴度。结果PacⅠ酶切证实同源重组成功。绿色荧光观察证实病毒包装成功并且具有感染力,RT-PCR证实了重组腺病毒具有凋亡素蛋白的编码。重组腺病毒的浓度为84.52×109VP/ml,滴度为6.561×109PFU/ml。结论成功构建含凋亡素基因的重组腺病毒,它的滴度足以满足体内外实验。     

泡球蚴感染小鼠所致肝损伤基因表达谱的变化

目的 观察泡球蚴感染小鼠肝脏基因表达谱的变化.方法 采用开腹直视下肝左叶注射泡球蚴混悬液构建小鼠肝泡型包虫病动物模型.运用包含25000个小鼠基因的36 K小鼠全基因组寡核苷酸芯片,检测感染8周后小鼠肝脏的基因表达.荧光定量逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)法验证芯片结果 .结果 小鼠肝脏受泡球蚴侵染8周后,共有108条基因表达发生改变,功能聚类分为新陈代谢、信号转导、细胞生长、转录调节、细胞骨架、凋亡、免疫应答及运输等11类.荧光定量RT-PCR验证正确.结论 泡球蚴感染可以导致小鼠肝脏基因表达谱发生的改变,涉及多个基因表达调控途径.     

Genetic Heterogeneity and Efficiency of Two Different Methods of Adenovirus-Mediated Gene Transfer in a Rat Liver Transplantation Model

PURPOSE: We used recombinant adenoviral vectors for gene therapy in liver transplantation, and investigated the efficacy of gene transfer and expression on the grafts and genetic heterogeneity, with two exogenous gene transfer methods in three different syngeneic rat strains. METHODS: We transferred adenoviral vector encoding Escherichia coli beta-galactosidase via a donor tail vein 3 days before transplantation; via a recipient tail vein immediately after grafting; and ex vivo by perfusion and clamping during transplantation. RESULTS: The high efficacy of beta-galactosidase gene transfer and expression was seen in both delivery systems, with 70% positivity for hepatocytes on day 3, which persisted for at least 3 weeks after transplantation. The efficacy of gene transfer and expression was similar in the three strains (DA, Lewis, and PVG). CONCLUSIONS: These data suggest that adenovirus-mediated gene transfer delivers effective gene therapy by tail vein injection of a donor or a recipient, or by ex vivo graft perfusion in rat liver transplantation. It is not necessary to consider the differences in the strains. Furthermore, ex vivo graft perfusion is probably more suitable not only for rat liver transplantation but also possibly for future clinical application.     

增殖型腺病毒介导的人内皮抑素基因治疗胰腺癌

目的 观察携带人内皮抑素基因的双重调控增殖型腺病毒(AdTPHre-hEndo)对胰腺癌的治疗作用.方法 通过病毒重组技术将人内皮抑素基因克隆入双重调控增殖型腺病毒基因组中,获得腺病毒滴度为3.25×1010pfu/ml;通过建立SW-1990胰腺癌细胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,分析基因转导后胰腺癌组织中内皮抑素的表达情况及对肿瘤血管的抑制作用.结果 构建了AdTPHre-hEndo;AdTPHre-hEndo组荷瘤裸鼠肿瘤体积显著低于携带人内皮抑素基因的重组腺病毒(Ad-hEndo)组(P＜0.01)和选择性增殖型腺病毒(ONYX-015)组(P＜0.05);AdTPHre-hEndo组内皮抑素表达量明显高于Ad-hEndo组和对照组(P＜0.01).AdTPHre-hEndo组肿瘤微血管密度(MVD)为6.8±2.5,Ad-hEndo组和对照组MVD分别为16.0±4.6(P＜0.01)、47.2±10.0(P＜0.01).结论 所构建的AdTPHre-hEndo可有效表达具有生物学活性的内皮抑素,使肿瘤内微血管生成减少,肿瘤细胞增殖减慢,具备应用于胰腺癌临床治疗的潜力.     

CD/5-FC系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的抗血管形成作用的初步探讨

目的　探讨自杀基因系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的微血管形成的抑制作用。方法　构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)基因的腺病毒穿梭载体 pAdTrack CMV CD ,与骨架载体pAdEasy 1在细菌内重组为 pAd CD ,经 2 93细胞包装、扩增 ,氯化铯密度梯度离心制备纯化高效的CD腺病毒液 ,建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型 ,观察CD基因的原位治疗及微血管形成抑制情况。结果　含CD基因腺病毒载体经酶切鉴定正确 ,包装纯化后 ,检测病毒滴度为 2× 10 11pfu/ml,体内实验显示CD基因原位转导对裸鼠胰腺癌移植瘤的微血管形成具有较明显的抑制效应。结论　腺病毒介导CD/ 5 FC自杀基因系统 ,不仅可以直接杀灭癌细胞 ,而且还可通过抑制移植瘤微血管的形成来抑制胰腺癌细胞的生长 ,可作为胰腺癌基因治疗的有效方法。     

人骨保护素基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建人骨保护素(hOPG)基因的重组腺病毒载体并检测其转染能力。方法采用基因工程技术,将hOPG基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带hOPG基因的重组腺病毒AdEasy-PAdtrack-CMV-hOPG,将重组腺病毒AdhOPG对大鼠骨髓基质细胞(rMSCs) 进行感染。采用PCR方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度。结果酶切鉴定及PCR结果证明hOPG基因重组腺病毒载体成功, 病毒滴度可达2．5×108pfu／ml,具有很强感染能力,结论应用细菌内同源重组法,成功构建了含 hOPG重组腺病毒载体。     

人端粒酶逆转录酶启动子调控的重组腺病毒的构建及其在膀胱癌细胞中的表达

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的腺病毒系统，观察其在膀胱癌细胞中的表达。方法构建带有hTERT启动子的腺病毒穿梭载体pDC315-Tp—EGFP，细胞重组技术获得腺病毒Ad-hTERT-EGFP，按感染复数（MOI）100体外转染膀胱癌细胞株253J及人胚肺成纤维细胞株MRC-5，通过倒置荧光显微镜和Rt—PCR分别检测EGFP的表达。带有小鼠巨细胞病毒（mCMV）启动子的腺病毒Ad-EGFP作为阳性对照。结果成功构建出重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP，滴度为3．8×10^10空斑形成单位（pfu）／ml，Ad—hTERT-EG-FP感染的253J细胞中，（85．2±3．3）％发出明亮的绿色荧光；而其感染的MRC-5细胞未产生绿色荧光（P〈0．01）；对照病毒Ad-EGFP在253J和MRC-5中分别有（87．1±2．2）％及（92．5±3．1）％的细胞可见到绿色荧光。RT-PCR检测显示：253J细胞转染Ad-hTERT-EGFP、Ad-EGFP后及MRC-5细胞转染Ad-EGFP后均有EGFP基因表达；而MRC-5细胞转染Ad-hTERT-EGFP后未见EGFP基因表达。结论该腺病毒系统中hTERT启动子调控下游基因可选择性地在膀胱肿瘤细胞中表达，在正常细胞中不表达，具有明显的靶向性。