tTSF基因的酵母表达及其基因治疗研究

目的 选择PF4，TSP1的高活性片段及肿瘤细胞靶向肽，设计合成融合基因—tTSF，进行酵母表达及小鼠基因治疗研究。方法 根据PF4和TSP1的抑制血管生成高活性片段设计合成TSF基因，并在N-端接上肿瘤细胞靶向肽，设计合成了tTSF。将tTSF基因构建到pPIC9质粒，重组质粒pPIC9／tTSF转化GSll5酵母菌株进行表达，并检测表达产物对血管内皮细胞生长的抑制作用。将tTSF基因克隆到pcDNA3．1（＋）载体，重组质粒pcDNA3．1（＋）／tTSF通过皮下注射治疗C57BL／6小鼠移植肿瘤Lewis肺癌。结果 重组质粒pPIC9／tTSF转化GSll5酵母菌株后，获得了tTSF的高效表达，表达产物对血管内皮细胞生长产生明显的抑制作用；皮下注射重组质粒pcDNA3．1（＋）／tTSF后，C57BL／6小鼠移植肿瘤Lewis肺癌的生长受到明显抑制。结论 tTSF基因设计成功，其酵母表达产物对血管内皮细胞生长产生具有明显的抑制作用，tTSF基因的体内基因治疗也具有显著的抗肿瘤效应。     

人β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析

目的：在大肠杆菌系统中表达有活性的人β-防御素3(hBD3)。方法：从pGE-T-hBD3重组质粒PCR获得hBD3成熟肽编码区基因，插入pGEX-4T-1构建pGEX-4T-1-hBD3融合表达载体，转化E．coli DH5α宿主菌，进行IPTG诱导，诱导菌经超声裂解后获得包涵体，包涵体经溶解、变性、复性和纯化处理后获得GST-hBD3融合蛋白，再经凝血酶切割。获得纯化的重组hBD3(rhBD3)。对rhBD3采用最小抑菌浓度测定法测定其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。结果：以与GST融合表达的方式，运用pGEX-4T-1系统在大肠杆菌中表达了hBD3，融合蛋白以包涵体形式存在。融合蛋白经凝血酶处理使删释放出来，其对金黄色葡萄球菌的MIC为4μg/ml；对大肠杆菌的MIC为8μg／ml。结论：采用pGEX-4T-1融合表达系统在大肠杆菌中成功地表达了有活性的rhBD3。     

IgA肾病肾血管纤溶酶原激活物抑制物—1和基质金属蛋白酶—9的表达及意义

为探讨免疫球蛋白A肾病（IgA肾病）患者肾血管壁纤溶酶原激活物抑制物－1（PAI－1）、基质金属蛋白酶－9（MMP－9）、金属蛋白酶组织抑制物－1（TIMP－1）和α－平滑肌肌动蛋白（α－SMA）的表达及意义，采用免疫组织化学技术检测38例IgA肾病肾组织血管壁的PAI－1、MMP－9、α－SMA和TIMP－1的蛋白表达。结果显示，α－SMA主要表达于平滑肌细胞；PAI－1表达与α－SMA类似； MMP－9在平滑肌细胞和内皮细胞均表达，TIMP－1仅在血管壁内膜的内皮细胞微弱表达，在IgA肾病Lee Ⅳ-Ⅴ级组，肾血管壁的PAI－1、MMP－9和α－SMA表达显著高于LeeⅠ-Ⅲ级组（P＜0．01）。直线相关分析显示, 肾血管的PAI－1、MMP－9和α－SMA表达与肾小管间质的纤维化和炎细胞浸润呈正相关（P＜0．01）。提示PAI－1可能参与介导了IgA肾病肾血管壁细胞外基质的积累过程，MMP－9则可能促进血管的平滑肌细胞迁移和内膜增生。     

高糖、晚期糖化终产物对微血管内皮细胞VCAM-1表达的影响

为观察高糖、晚期糖化终产物（AGEs）对体外培养的小鼠心脏微血管内皮细胞血管细胞粘附分子－1（VCAM-1)表达的影响，分离、培养小鼠心脏微血管内皮细胞，以葡萄糖、AGEs单独及联合刺激后流式细胞仪测定内皮细胞VCAM－1的表达，放免法测定培养上清中TNF-α水平。结果发现，高糖、AGEs刺激微血管内皮细胞后VCAM－1表达增加，TNFα水平升高；联合刺激组VCAM－1表达、TNF－α水平更高。提示高糖、AGEs能刺激小鼠心脏微血管内皮细胞VCAM－1表达增加，二者具有协同作用，TNF－α水平的升高与VCAM－1表达增加相一致，可能是VCAM－1表达增加的原因之一。     

哮喘豚鼠模型血淋巴细胞及嗜酸细胞与肺微血管内皮细胞粘附性的研究

观察哮喘豚鼠模型哮酸细胞和淋巴细胞与肺微血管内皮细胞的粘附率，探讨肺微血管内皮细胞在豚鼠模型血清孵育下的功能变化及淡症细胞与其粘附的分子基础，设豚鼠哮喘模型及对照组观察分 离的外周血淋巴细胞和哮酸细胞与内皮细胞的粘附率，RT－PCR法测定内皮细胞VCAM－1及eotaxin mRNA的表达强度，EMSA法测定NF－κB的AP－1的DNA结合活性，与组血清孵育相比，肺微血管内皮细胞在模型组血清刺激下；（1）与两组外周血淋巴细胞及仅与模型组哮酸细胞的粘附率显著升高（P＜0．01）；（2）VCAM－1和eotaxin mRNA表达量显著增多（P＜0．01或P＜0．05），NF－κB和AP－1的DNA结合活性也显著升高（P＜0．01），肺微血管内皮细胞可被哮喘模型血清激活，使粘附分子，趋化因子及核转录因子的合成和分泌显著增多，从而显著提高其与炎症细胞的粘附率，哮酸细胞的粘附需其自身及内皮细胞两者激活，肺微血管内皮细胞活化及NF－κB的和AP－1的DNA结合活性增高在哮喘发病中可能起重要作用。     

人MD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达

构建人髓样分化蛋白－2（human myeloid differentiation proterin-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferase,GST)的融合蛋白（hMD-2/GST)表达载体PGEX－4T－1／hMD-2，在大肠杆菌中融合表达hMD-2/GST。以真核表达载体PEF－BOS／hMD-2为模板，用PCR法在MD－2编码序列上下游引入酶切位点和终止密码子，将hMD-2编码序列克隆入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，用PCR和酶切筛选，鉴定重组质粒PGEX－4T－1/hMD-2，并对插入基因片断测序，重组质粒PGEX－4T－1／hMD-2转化大肠杆菌，经IPTG诱导后用SDS－PAGE分析表达产物。结果PCR，酶切鉴定和序列测实MD－2编码序列正向插入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，片断与PCR扩增产物大小相同，序列无误，阅读框架正确，SDS－PAGE证实hMD-2/GST在大肠杆菌中表达，表达量约占菌体总蛋白的30％，说明成功构建了PEGX－4T－1／hMD-2载体，hMD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌中得到初步表达，为MD－2后续研究作了必要的准备。     

PE38与人源化抗肝癌单链抗体重组免疫毒素的构建及表达

目的：构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体（hscFv)原核表达载体，对其产物作初步鉴定，为肝癌的导向治疗奠定基础。方法：采用分子克隆技术，PCR法扩增PE38基因片段，克隆人GST－融合蛋白表达载体pGEX-4T-1-hscFv中，重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确，受IPTG诱导表达后，SDS－PAGE及Westem blot分析GST融合蛋白结果。结果：成功构建免疫毒素表达载体pGEX-4T-1-hscFv-PE38（以下简称pGEXh-PE38);SDS-PAGE清晰显示Mr为90000的目的蛋白条带，光密度薄层扫描提示表达量为11％，Western blot在相同位置显示蛋白印迹，证实载体构建及表达均正确。结论：利用基因重组技术，在原核细胞中表达重组免疫毒素hscFv-PE38，为尝试肝癌治疗试验的一条有效途径。     

腺病毒介导的VEGF-B基因促血管内皮细胞增殖作用的研究

为观察腺癌毒素介导的血管内皮细胞生长因子B（VEGF－B）基因体外转染对血管内皮细胞的促增殖作用，构建编码人VEGF－B基因的复制缺陷的重组腺病毒载体，体外转染鼠主动脉血管内皮细胞（RAECs），应用RT－PCR和Western blot检测外源VEGF－B的表达，应用四唑盐（MTT）观察转染后RAECs的增殖。结果发现，RAECs可有效地被重组腺病毒载体感染，并能成功转录和表达VEGF－B基因和蛋白，在转染后细胞培养上清中检测到VEGF－B蛋白的表达，对RAECs有显著促增殖作用。提示重组腺病毒载体介导的人VEGF－B基因有血管新生作用，可用于缺血性心脏病的治疗。     

杀菌性/通透性增加蛋白模拟肽对内毒素致血管内皮细胞损伤的保护作用

目的：通过杀菌性／通透性增加蛋白（BPI）模拟肽（BNEP）拮抗内毒素（LPS），观察对血管内皮细胞分泌白细胞介素－6（IL－6），肿瘤坏死因子－α（INF－α）以及表达细胞间黏附分子－1（ICAM－1）的影响，探讨BNEP对LPS致血管内皮细胞损伤的保护作用。方法：采用体外培养的原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为模型，分别观察单纯应用LPS，BNEP以及不同剂量BNEP与LPS作用后各细胞因子的分泌表达，IL－6，TNF－α应用双抗夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定。ICAM－1采用生物素－抗生物素－过氧化物酶复合物（SABC）－cy3免疫荧光染色，激光共聚焦扫描显微镜下观察其表达情况，结果：LPS 10ng/ml可使IL－6分泌量显著增加；BNEP 60ug/ml即可显著降低10ng/ml LPS诱导的IL－6分泌，随BNEP浓度增加IL－6分泌量呈降低趋势，达240ug/ml时，IL－6分泌量与单纯应用BNEP组比较，差异无显著性意义（P＞0．05），BNEP 120ug/ml与LPS10ng/ml作用后，可使TNF－α分泌量降低94％，BNEP 240ug/ml可完全阻断TNF－α的分泌。激光共聚焦扫描显微镜观察结果显示，BNEP与LPS作用后，ICAM－1在细胞膜及细胞浆的表达明显减弱。结论：BNEP在阻断LPS对细胞的激活和损伤，减少炎症介质和细胞因子的过度释放中具有明显的保护作用。     

重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆和表达

目的：克隆人KGF-2基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：通过PCR扩增，从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2的cDNA，并将其分别克隆入pBV220，pLEX和pGEX4T-1质粒中，研究其在不同表达质粒和大肠杆菌中的表达情况。结果：克隆得到的KGF-2cDNA经测序证明与文献报道的序列一致。将其克隆于pBV220质粒中，在E．coli JM109中表达量相对最高，约占茵体总蛋白的4％；克隆于pLEX质粒中，在E．coli G1724中的表达量约占全茵总蛋白的5％；克隆于pGEX4T-1中，在E．coli JM109中的表达量可占到全茵总蛋白的20％。结论：采用GST融合蛋白表达质粒pGEX4T-1对KGF-2进行表达，较pBV220和pLEX具有明显优势，能实现对KGF-2的高效表达，为进一步的功能研究奠定了基础。     

成体干细胞研究进展和临床应用前景

成体干细胞多向分化潜能，极大地冲击了传统有关干细胞分化的理论，成体干细胞的研究对揭示生命的本质和内在规律具有重要的意义，本文就成体干细胞概念的演变、多能分化性以及其他特征，临床应用前景和目前存在的问题做一简要概述。并指出应用成体干细胞治疗人类疾病具有广阔的应用前景。     

胶质瘤干细胞的生存微环境及其示踪研究进展

胶质瘤干细胞在胶质瘤的形成和生长中发挥至关重要的作用。胶质瘤干细胞的生存微环境是维持干细胞特性的关键,在体无创性示踪为研究胶质瘤干细胞的生存、繁殖、自我更新等特性以及促进胶质瘤发展的机制具有重要意义。     

逼尿肌细胞的原代培养和鉴定

目的建立逼尿肌细胞的原代培养及鉴定方法。方法应用Ⅱ型胶原酶消化分离逼尿肌细胞,在含20%胎牛血清DMEM培养液中培养,观察细胞形态和扩增情况,用a-SM-Actin进行免疫组化鉴定细胞类型。结果 逼尿肌细胞在培养18 h后开始贴壁在瓶底,4~5 d后可见细胞融合,8~10 d后可见细胞覆盖瓶底80%以上。a-SM-Actin免疫组化染色鉴定,光镜下观察梭形细胞胞浆内见纵行排列的棕黄色丝状物。结论该方法简单、易于掌握,短期内可获得大量高纯度的逼尿肌细胞。     

类胰蛋白酶对肝星状细胞增殖及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

目的观察类胰蛋白酶对肝星状细胞（HSC）增殖及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响，探讨类胰蛋白酶在肝纤维化中的作用。方法用Percoll密度梯度离心法分离、培养大鼠HSC，经系列浓度类胰蛋白酶作用后，分组进行如下实验：用噻唑兰比色法（MTT）检测HSC的增殖；用RT—PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果肥大细胞（MC）类胰蛋白酶（1-100ng／m1）能够促进HSC增殖及Ⅰ型胶原mRNA的表达，此作用呈剂量依赖性（各实验组与对照组比较，P〈0．05）。结论肥大细胞类胰蛋白酶可直接作用于HSC，参与肝纤维化过程。     

人胚胎胸腺基质细胞的体外分离培养与鉴定

目的：体外分离培养胎儿胸腺基质细胞，即上皮网状细胞，为研究T淋巴细胞的分化增殖及相关药物筛选奠定基础。方法：从水囊引产的胎儿胸腺中分离组织细胞，经筛选培养获得胸腺上皮网状细胞。结果：细胞染色体正常，为46条染色体，包括1对性染色体。倒置显微镜下观察，细胞呈扁平状，多边形，胞体较大，核圆形或椭圆形，核仁明显．胞质内含明显的颗粒和小泡。透射电镜显示细胞间有桥粒相连，并可见张力丝。用免疫组化法检测上皮细胞特异性表达标志(角蛋白)为阳性。结论：本法获得细胞为胸腺网状上皮细胞，为进一步工作打下基础。     

存活素与辐射诱导的凋亡

存活素(survivin)是一种新发现的细胞内蛋白,属于抗细胞凋亡蛋白家族,在胚胎和各类肿瘤中均表达,但在除胸腺和睾丸以外的成人组织中未被发现。阐明存活素在细胞凋亡和增生中的分子机制及其作用,在抗癌治疗和抑制对机体有害的细胞凋亡方面具有重要意义。     

模拟失重和超重刺激对体外培养成骨瘤细胞分裂、增殖影响的研究

为探讨模拟失重对体外培养成骨瘤细胞分裂、增殖的影响，用回转器以３０ｒ／ｍｉｎ水平回转模拟失重效应，对照组采用静置培养，另设一超重组（以１６４ｒ／ｍｉｎ绕竖直轴旋转，达到离心力为３Ｇ），观察到人成骨瘤细胞形态改变，并测定三组细胞生长曲线。发现与正常生长的静置培养组比较，模拟失重组细胞胞体变圆，细胞密度增加不明显，在回转的第三天后反呈下降趋势；而超重组细胞分裂旺盛、增殖迅速，并堆叠生长，很快出现大量生长斑。结果证实成骨瘤细胞的分裂增殖过程对重力敏感，提示失重条件下成骨细胞活性下降可能与失重导致细胞内、外微环境的改变有关。     

异丙酚对胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移及JAK2/STAT3通路的影响

 目的 探讨异丙酚对胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移及Janus激酶2/信号转导子和转录激活子3(JAK2/STAT3)通路的影响。方法 采用MTT法测定不同浓度的异丙酚对胶质瘤U87细胞和人正常星型胶质细胞HEB生长抑制作用,Transwell侵袭实验测定2、5、10 μM异丙酚对胶质瘤U87细胞体外侵袭能力的影响,划痕实验测定2、5、10 μM异丙酚对胶质瘤U87细胞体外迁移能力的影响,蛋白印迹法(WB)测定10 μM异丙酚对胶质瘤U87细胞JAK2/STAT3通路的影响。结果 与对照组相比,5、10、25、50、100 μM异丙酚均能显著抑制胶质瘤U87细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.05),后续选择2、5、10 μM异丙酚进行实验。与对照组相比,胶质瘤U87细胞经2、5、10 μM异丙酚处理后,侵袭能力显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验说明,胶质瘤U87细胞经2、5、10 μM异丙酚处理48 h后,迁移能力分别降低了(19.69±2.67)%、(41.41±3.28)%、(59.75±2.91)%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。且胶质瘤U87细胞中JAK2蛋白磷酸化水平、STAT3蛋白磷酸化水平明显下调,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 异丙酚可能通过下调JAK2/STAT3信号传导通路相关蛋白表达,抑制胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移能力。     

体外血管平滑肌细胞培养方法的应用及改进

动脉粥样硬化(AS)的发生发展与动脉中膜SMC的大量聚集和异常增生密切相关。参照传统的主动脉SMC培养方法并加以改进,采取从内剥离中膜法和组织块反复接种法,培养的细胞呈现典型的“峰与谷”结构,免疫组织化学染色显示细胞内SM-Actin表达阳性。此培养方法可作为研究血管SMC生物学行为和AS内在机制的有效模型。     

模拟失重对MG-63细胞形态、增殖及周期的影响

目的 探讨模拟失重对人骨肉瘤成骨样细胞(MG-63)细胞面积、增殖、周期的影响. 方法 采用回转器模拟失重,用图像处理分析软件( Image J )测量分析模拟失重后细胞面积的改变,用细胞计数法测定细胞的生长曲线,用流式细胞仪测定细胞周期. 结果 回转器模拟失重后,回转组MG-63细胞24 h、36 h和48 h时间段的细胞面积较对照组缩小(P《0.05),回转组24 h、36 h、48 h 3个时间段与12 h时间段比较细胞面积缩小(P《0.05),而对照组各时间段之间无明显差异.细胞生长曲线显示模拟失重后细胞增殖明显受抑制.12 h、36 h、48 h回转组MG-63细胞的细胞周期与对照组相比无明显差异,24 h回转后G0 G1期细胞显著减少 (P《0.05),S期细胞则显著增多 (P《0.05). 结论 回转器模拟失重使MG-63细胞在24 h、36 h和48 h细胞面积缩小,12 h、24 h、36 h和48 h增殖生长受到抑制,24 h时出现细胞周期阻滞.