重组腺相关病毒经不同途径转染鼠眼球组织

目的　研究重组腺相关病毒 (rAAV)介导的报告基因 (LacZ)能否转染到鼠的眼球组织 ;以及rAAV LacZ在眼内转染的最佳途径。方法　 2 0只SD大鼠随机分成 4组 ;第 1组 ,用rAAV LacZ(10 9个病毒颗粒·mL-1)溶液滴眼 ;第 2组 ,结膜囊注射 2 0 μLrAAV LacZ ;第 3组 ,前房注射 10 μLrAAV LacZ ;第 4组 ,玻璃体腔注射 10 μLrAAV LacZ。LacZ基因转染 30d后 ,分别取各组大鼠的眼球行 5 溴 4 氯 3 吲哚 β D 半乳糖苷 (X gal)组织化学染色 ,评价报告基因在眼球的表达情况。结果　X gal组织化学染色证实 ,用rAAV LacZ溶液滴眼 ,仅少量报告基因可以在角膜上皮层表达 ;结膜囊注射rAAV LacZ ,报告基因仅表达于结膜下组织 ;前房注射rAAV LacZ ,报告基因可表达于角膜和虹膜组织 ;玻璃体腔注射rAAV LacZ后 ,报告基因可表达于视网膜组织。结论　rAAV载体能定向携载报告基因到眼内组织 ,rAAV可以用于眼病的基因治疗     

腺相关病毒载体（AAV）在视网膜色素变性基因治疗中的应用

随着分子生物学的发展，应用基因转移技术治疗视网膜色素变性疾病成为可能，目前研究认为相关病毒载体（AAV）能使外源基因有效地导入感光细胞而且在细胞中稳定长期表达。而且对细胞无毒性，将有可能成为最有效的基因转染工具，本对AAV病毒的形态，生长和分子生物学特征，AAV介导的视网膜细胞基因转移，AAV病毒载体在视网膜色素变性基因治疗中的应用，以及作为基因治疗载体的优缺点进行了综述。     

腺相关病毒载体在眼病基因治疗中的应用及研究进展

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)属微小病毒科,目前有11种血清型。AAV作为基因转移载体具有安全性好、宿主范围广、免疫原性低和携带的治疗基因长期表达等优势而成为眼病基因治疗研究的热点。影响AAV载体在眼部基因转移的因素包括AAV载体的血清型、基因转移途径、组织特异性启动子等。以AAV为载体的基因转移在视网膜疾病、青光眼、角膜病的基因治疗研究中取得了新的进展。     

rAAV载体介导基因对糖尿病大鼠视网膜转染的实验研究

目的以重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus,rAAV)携带色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因转染入糖尿病大鼠视网膜,观察其定位及表达情况。方法Wistar大鼠分为正常组(CON)及实验组。实验组以链脲佐菌素诱导形成糖尿病模型后,随机分为1个月组(DM1)、3个月组(DM3)和6个月组(DM6)。右眼玻璃体腔内注射2μLrAAV2-CMV-hPEDF,左眼注射等量rAAV2-CMV-GFP。CON组右眼注射2μL生理盐水。用荧光显微镜观察GFP表达部位,用RT-PCR测定PEDF的表达情况。结果荧光显微镜显示,DM1组视网膜全层,主要是节细胞层表达强荧光。DM3组全层视网膜和部分巩膜表达强荧光。DM6组视网膜及巩膜全层表达强荧光,荧光强度、范围与DM3组相比明显增加。RT-PCR显示,人PEDF mRNA在CON、GFP注射眼组大鼠视网膜均无表达。在右眼实验组1个月时可见hPEDF mRNA表达,并随时间延长,表达不断增强,持续到6个月。结论AAV载体可将PEDF及GFP基因有效地转染入糖尿病大鼠视网膜内并长期表达超过6个月。     

正常兔眼玻璃体微泡注射联合超声辐照干预中最适超声参数的筛选

背景 微泡可作为药物和基因的转染载体,经超声照射后转染效率提高,从而在多种眼科疾病的治疗方面发挥重要作用.然而,不同超声辐照强度发挥的生物学效应有所不同. 目的 筛选适用于正常兔视网膜组织的超声辐照强度和时间,为超声联合微泡治疗眼底疾病的研究提供实验依据.方法 选取18只清洁级新西兰大白兔,按照随机数字表法分为空白对照组、单纯超声辐照组、单纯玻璃体腔注射组及玻璃体腔注射+低、中、高强超声辐照组.空白对照组未给予任何处理,单纯超声辐照组和单纯玻璃体腔注射组分别给予2.0 W/cm2的超声强度照射实验眼60 s或单纯玻璃体腔注射0.1ml微泡,玻璃体腔注射+低、中、高强超声辐照组兔眼在玻璃体腔注射0.1ml微泡后分别用0.5、1.0和2.0 W/cm2超声强度照射实验眼60 s.各组于术前、术后即刻、术后第1天、第7天分别行眼前节照相、直接检眼镜检查和彩色眼底照相观察眼前节和眼底情况,于术后第7天处死实验兔并分离视网膜,行苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察实验眼视网膜形态学改变,透射电子显微镜观察兔视网膜超微结构变化.结果 空白对照组、单纯超声辐照组、单纯玻璃体腔注射组及玻璃体腔注射+低、中、高强超声辐照组兔手术前后不同时间点眼前后节均未见明显异常.术后7d,光学显微镜下可见空白对照组、单纯超声辐照组、单纯玻璃体腔注射组和玻璃体腔注射+低超声辐照组兔10层视网膜组织结构清晰,未见炎症、变性及细胞坏死等改变,而玻璃体腔注射+中强超声辐照组和玻璃体腔注射+高强超声辐照组兔眼视网膜各层组织结构疏松,视细胞层排列紊乱,内核层和外核层不同程度变薄,视网膜神经节细胞(RGCs)数量减少,可见细胞的空泡样变性.透射电子显微镜下可见空白对照组、单纯超声辐照组、单纯玻璃体腔注射组及玻璃体腔注射+低强超声辐照组兔视网膜超微结构未见明显异常改变,而玻璃体腔注射+中强超声辐照组和玻璃体腔注射+高强超声辐照组兔眼视细胞排列紊乱,内核层和外核层细胞数目减少,细胞排列紊乱,细胞核染色质不均匀,RGCs数目减少.结论 适用于正常兔视网膜组织的理想超声参数为超声强度0.5 W/era2辐照60 s,这一结果为超声联合微泡治疗眼底疾病的研究提供了实验依据.     

腺相关病毒载体(AAV)在视网膜色素变性基因治疗中的应用

随着分子生物学的发展 ,应用基因转移技术治疗视网膜色素变性疾病成为可能。目前研究认为腺相关病毒载体 (AAV)能使外源基因有效地导入感光细胞而且在细胞中稳定长期表达 ,而且对细胞无毒性 ,将有可能成为最有效的基因转染工具。本文对AAV病毒的形态、生长和分子生物学特征、AAV介导的视网膜细胞基因转移、AAV病毒载体在视网膜色素变性基因治疗中的应用、以及作为基因治疗载体的优缺点进行了综述     

巩膜扣带术联合玻璃体腔注射C3F8治疗上方球形视网膜脱离

目的探讨应用外放液、玻璃体腔注射平衡液、冷凝、巩膜外加压联合玻璃体腔注射C3F8治疗上方球形视网膜脱离的疗效。方法30例（30只眼）上方球形视网膜脱离先经巩膜切开排放视网膜下液，玻璃体腔注射平衡液恢复眼内压，再行视网膜裂孔定位，巩膜外冷凝、外加压。对此时视网膜下液仍较多者，或者经放视网膜下液并玻璃体腔注射平衡液后视网膜下液迅速积聚者，或者形成放射状邹褶较重者，玻璃体腔注射C3F80．4～0．6ml。结果30只眼上方球形视网膜脱离经巩膜扣带术联合玻璃体腔注射C，F。治疗，随访3～50个月，平均24个月，一次手术视网膜复位27只眼（90％），3只眼术后7～10d下方视网膜形成新裂孔（10％），2只眼经玻璃体切割联合注气术视网膜复位，1只眼放弃手术。最终视网膜复位29只眼（96．7％）。结论应用外放液，玻璃体腔注射平衡液后，行巩膜扣带术联合玻璃体腔注射C3F8是治疗上方球形视网膜脱离的一种实用且有效的手术方法。     

腺相关病毒介导的角膜疾病基因治疗基础研究进展

腺相关病毒(adeno associated virus, AAV)介导的基因治疗通过基因增强、基因删除和/或基因编辑将遗传物质靶向角膜疾病, 靶向给药的易可及性和高转导效率使得AAV介导的基因治疗可有效治疗角膜疾病, 包括抑制角膜新生血管形成、改善与粘多糖沉积症相关的角膜混浊、促进角膜机械损伤和化学损伤的愈合、治疗感染性角膜炎、有效地转染角膜内皮细胞治疗先天性遗传性角膜内皮营养不良, 为治疗角膜疾病提供了新的途径。(国际眼科纵览, 2022, 46:565-571)     

重组腺相关病毒介导的报告基因在角膜内皮细胞中的表达

目的研究重组腺相关病毒(rAAV)能否介导报告基因(Lacz)转移至大鼠的角膜内皮细胞;以及眼内炎症反应能否增强报告基因在大鼠角膜内皮细胞的表达。方法20只SD大鼠前房注射rAAV-Lacz(109Pfu),28d后,随机抽取10只SD大鼠为实验组,玻璃体腔注射脂多糖溶液(LPS)诱发眼内炎症;对照组(10只)玻璃体腔注射PBS溶液。2d后,分别取两组大鼠的角膜行5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)组织化学染色,评价报告基因的表达情况。结果X-gal组织化学染色证实,经前房注射,报告基因可以在角膜内皮细胞表达,对照组表达效率为5.12%±0.03%;玻璃体腔注射LPS溶液2d后,眼内出现明显的炎症反应,此时报告基因在角膜内皮细胞的表达效率为46.03%±2.12%,较对照组明显增强,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论rAAV载体能有效携载目的基因至角膜内皮细胞,炎症可增强rAAV载体介导的报告基因在角膜内皮的表达。     

腺相关病毒载体介导视网膜疾病的基因治疗研究进展

视网膜疾病分子机制研究的不断深入,促进了视网膜疾病基因治疗的进展.腺相关病毒(AAV)的毒性和免疫原性均较低,外源基因表达稳定,可以转染多种分裂期和静止期细胞,因此成为治疗视网膜疾病的有效载体.在不同的动物模型和临床试验中,已有多项研究结果证实AAV作为载体治疗视网膜疾病的安全性和有效性.目前AAV在动物疾病模型中已经进行了介导抗血管生成蛋白、神经营养因子、抗凋亡因子的表达和基因替代治疗的研究,取得了令人满意的效果.但是,AAV也存在携带外源基因能力偏小的问题,需要进一步研究并解决之.     

外源基因在角膜中表达及基因治疗

外源基因向角膜的转移是角膜基因表达和基因治疗的基础。基因枪、电脉冲和微量注射都可用于角膜基因转移。脂质体的脂组成、日本凝血病毒衣壳蛋白包囊、与腺病毒的结合物及DNA核靶向序列影响其基因转移的效果。另外,腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒和lenti病毒可做为基因转移的载体。基因治疗在角膜遗传病、病毒感染、雾状混浊和角膜移植排斥中发挥作用。     

山梨醇脱氢酶基因多态性与2型糖尿病视网膜病变相关性的研究

背景国外研究表明,多元醇通路在2型糖尿病血管并发症中具有重要的作用,山梨醇脱氢酶（SDH）基因作为该通路的限速酶之一参与糖尿病视网膜病变（DR）的发生,但国内尚未见相关的研究。目的探讨SDHG-888C基因多态性同2型DR的关系。方法运用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性技术检测187例2型糖尿病患者的基因型,其中DR患者118例,无明显DR组69例、健康对照组123例,比较各组的基因型和等位基因的频率。结果DR组与无DR组间的临床特征比较显示,DR组糖尿病病程明显长于无DR组,差异有统计学意义（t=2．070,P=0．042）,2组间其他基线特征的差异无统计学意义（P〉0．05）。DR组、无DR组和对照组GG基因型频率分别为24．6％、8．7％和8．1％,G等位基因频率分别为42．4％、25．4％和29．7％,DR组GG基因型和G等位基因频率显著高于无DR组和对照组,差异均有统计学意义（GG：P=0．007,P=0．001;G：P=0．001,P=0．004）,无DR组与对照组的各基因型和等位基因频率比较差异均无统计学意义（P〉0．05）;增生型DR与无DR组间各基因型和等位基因频率比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论SDHG-888C基因多态性可能与中国南方人群2型DR的发生具有一定的相关性。     

常染色体显性视网膜色素变性家系基因定位的研究与视紫红质基因突变的检测分析

对一常染色体显性视网膜色素变性 (autosomaldominantretinitispigmentosa ,ADRP)大家系进行基因定位 ,并检测该家系12名患者的视紫红质基因是否存在突变。方法 :采用多个已知位点的遗传标记对该ADRP家系进行连锁分析 ,确定致病基因的大致染色体位置 ;在所定位的染色体区域将RHO基因作为侯选基因进行直接测序检测突变。结果 :连锁分析结果发现遗传标记D3S12 92 ,当θ =0 1时有最大Lod值 =2 732 85 2 ,因此考虑该家系致病基因位于D3S12 92附近。直接测序结果发现该家系中大部分患者在RHO基因的第 3外显子序列 ,第 182密码子的第 2个碱基发生G→A置换突变 ,导致甘氨酸 (Gly)变为天冬氨酸 (Asp) ,命名为Gly -182 -Asp突变 ,而在 2例患者中则未发现突变 ;同时 ,在该家系正常成员以及正常对照者中均未发现此突变。结论 :ADRP存在分子水平的遗传异质性 ,某些ADRP是由于RHO基因突变所致。但是由于本研究所涉及的ADRP家系中尚有2名患者未找到RHO基因突变 ,故不能将Gly -182 -Asp突变认为是该家系的致病原因。在D3S12 92与RHO基因之间可能存在新的基因 ,还需进一步研究证明。     

RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤血管内皮生长因子基因的表达

目的利用RNA干扰技术在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)细胞内诱导RNA干扰(RNAi),抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达,在体外细胞水平探讨RNAi对视网膜母细胞瘤治疗的可行性。方法构建靶向VEGF基因的siRNA(VEGF-siRNA),转导入RB细胞,在瘤细胞内诱导RNAi,采用RT-PCR、细胞增殖抑制实验、Northern杂交等技术检测siRNA处理前后RB细胞增殖及VEGF基因表达变化。结果成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR发现VEGF-siRNA在RB细胞系中,能明显抑制VEGF基因的表达,抑制率为72%;对RB细胞生长抑制率达47%;VEGF基因的mRNA表达降低了78%。结论VEGF-siRNA在体外能明显抑制了视网膜母细胞瘤细胞增殖和VEGF基因的表达。     

Direct visual resolution of gene copy number in the human photopigment gene array.

PURPOSE: To visualize by direct fluorescent in situ hybridization the entire human visual pigment gene array on single X-chromosome fibers and to compare the results with values obtained by other molecular techniques. METHODS. The size of the opsin gene array on the X-chromosome in eight male subjects was investigated by (i) direct visual in situ hybridization (DIRVISH) on elongated DNA fibers: (ii) quantitation of genomic restriction fragments after Southern blot hybridization; (iii) quantitation of restriction fragment length polymorphism after PCR amplification (PCR/RFLP), and (iv) sizing of NotI fragments by pulsed field gel electrophoresis and Southern blot detection. Each male subject's color vision was assessed by Rayleigh matches on a Nagel Type 1 anomaloscope. RESULTS. The number of genes resolved by the DIRVISH protocol, which ranges from 1 to 6, agrees exactly with the gene array sizes obtained in the same male subjects from pulsed field gel electrophoresis, but differs from the estimates derived from the commonly used indirect Southern blot hybridization and PCR/RFLP quantitation methods. In particular, the PCR/RFLP method overestimates the copy number in all but the smallest arrays. CONCLUSIONS. Visualization of the X-chromosome opsin gene array by DIRVISH provides a new, direct method for obtaining exact copy numbers and helps to resolve the controversy about the range and the average visual pigment gene number in the human population in favor of smaller average array sizes.     

Retinoblastoma and tumor-suppressor gene therapy

Retinoblastoma as a genetic disease is a paradigm for tumor-suppressor gene theory. The RB gene is one of the best-studied tumor-suppressor genes with known key functions in controlling cell proliferation and differentiation. Reconstitution of RB function in RB-deficient tumor cells induces irreversible growth arrest (senescence) and inhibits telomerase activity, simultaneously correcting two of the four defined carcinogenic events in human cells. RB gene therapy has the advantage of selectively killing tumor cells without adverse side effects to normal somatic cells, and efficacy of the therapy has now been demonstrated in vitro and in immunocompetent mouse models. Most preclinical studies of RB gene therapy reported to date have used RB fragments with enhanced cell growth-suppressing function. The clinical success of RB gene therapy of retinoblastoma, however, requires more innovation in vector development.     

先天性无脉络膜症及其与CHM基因的相关研究

先天性无脉络膜症是一种X链锁的以夜盲和进展性视野缩小为主要特征的严重眼病,致盲率较高,到目前已确定的致病基因为CHM基因.先天性无脉络膜从视网膜色素变性中分离出来已经有半个世纪,但在中国的研究还是空白.受累的男性初期表现为夜盲,进展性周边视野缺失,视野进行性变小.目前对于无脉络膜症尚无有效的治疗方法,总的治疗建议是尽量减少紫外线照射,保持健康的生活方式,也有部分有关营养和基于细胞的治疗研究.视网膜下腔移植自体虹膜色素上皮细胞有一定的治疗作用.