临床难鉴定细菌和真菌核糖体基因扩增及序列分析

目的建立核糖体测序方法鉴定临床难鉴定的细菌和真菌。方法分别利用通用引物扩增细菌16S rRNA基因和真菌核糖体转录间隔区2（ITS2）,对PCR产物进行测序,在GenBank中对测序结果进行Blastn等分析。结果21株临床常见细菌和8株真菌测序结果与表型鉴定符合,检测出6株临床难鉴定细菌和真菌。结论核糖体测序可以作为临床难鉴定细菌和真菌的分子生物学诊断方法。     

基于16S rRNA序列鉴定临床不常见细菌

目的以16S rRNA基因为靶序列,建立核糖体测序方法鉴定临床不常见细菌。方法利用通用引物聚合酶链反应(PCR)扩增细菌16S rRNA基因,对PCR产物进行测序,在GenBank中对测序结果进行Blastn分析。结果10株临床常见细菌测序结果与表型鉴定符合,检测出4株临床不常见细菌。结论 16S rRNA基因测序可以作为鉴定临床不常见细菌的重要方法之一。     

细菌性眼内炎的病原分子诊断研究

目的 以16S rRNA部分基因直接测序为基础分析细菌性眼内炎中的病原菌,建立眼内标本病原菌非培养检测方法.方法 收集50例患者房水或玻璃体液标本,提取细菌DNA,16SrRNA基因通用引物PCR,扩增产物直接测序,通过核酸序列比对微生物种属鉴定,同时与传统方法进行比较.结果 50例标本中,直接涂片阳性22例(44%),细菌培养阳性13例(26%),PCR检测阳性28例(56%),成功测序22例,序列鉴定率为44%.16S rRNA基因序列鉴定与培养鉴定结果不完全吻合.结论 分子诊断对明确细菌性眼内炎感染有指导意义.     

泉州市6例布鲁菌病的微生物生化鉴定及分子生物学确认

目的 验证布鲁菌的微生物鉴定和PCR检测结果的一致性. 方法 利用全自动细菌鉴定仪对血（骨髓）培养阳性的标本进行微生物鉴定,提取细菌DNA,应用布鲁菌通用引物BCSP31进行PCR扩增,产物进行测序. 结果 6例培养阳性的病原菌经鉴定为布鲁菌.经荧光PCR检测、测序结果在线blast分析确认为布鲁菌. 结论 细菌的分离培养结合PCR方法可以提高布鲁菌的检测.     

焦磷酸测序法鉴定临床常见病原菌

目的 建立高效的焦磷酸测序鉴定临床常见病原菌的方法.方法 在细菌16S rRNA的V1及V3可变区两端保守序列设计PCR扩增通用引物及焦磷酸测序引物,PCR扩增后焦磷酸测序测定V1及V3可变区序列,测序结果与数据库比对判断细菌种属.结果 在4 h内完成96株细菌的鉴定,所有菌株鉴定结果与常规鉴定结果一致.结论 焦磷酸测序技术可以用于临床分离菌株的鉴定,且具有费用相对低廉、高通量、鉴定能力强等优点.     

16SrRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的：运用16SrRNA基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法：提取细菌DNA,采用通用引物PcR扩增16SrRNA基因片段并测序。将测序结果用Blastn在线软件在Nucleotide数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果：12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。结论：16SrRNA基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

PCR-变性梯度凝胶电泳技术分析肺炎儿童下呼吸道菌群多样性

目的：初步探讨PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)检测肺炎儿童下呼吸道菌群多样性的作用。方法收集10份培养阳性的患儿肺泡灌洗液2~5 mL,经细菌DNA提取、16S rDNA-PCR后进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析,对优势条带进行测序。结果经培养10份标本中7份鉴定为一种菌感染,3份培养出两种病原菌;经PCR-DGGE分析8份标本出现多条明显条带,2份得到一条条带,共筛选出12个优势条带;DGGE法得到的细菌种类多于培养法。结论 PCR-DGGE可较好地鉴定混合细菌感染性肺炎病原菌并能检测到培养法没有检出的细菌;儿童肺炎主要以肺炎链球菌、大肠埃希菌、草绿色链球菌等病原菌为主。     

16S rRNA基因序列分析鉴定非典型细菌的实验研究

目的建立以16S rRNA基因序列分析为基础的细菌鉴定方法,并初步将其应用于临床常规细菌的鉴定。方法选择临床微生物实验室不能准确鉴定的细菌,以16S rRNA为靶序列,在两端保守区设计引物,PCR反应扩增目的片段,测序后与数据库中已知细菌的16S rRNA序列进行序列比对。结果 13株菌中,有11株与数据库中的已知16S rRNA序列相似性达99.0%以上,成功鉴定到种的水平。结论 16S rRNA基因序列分析的方法可快速、准确地鉴定不典型菌株,可作为细菌常规鉴定的补充方法。     

16S rRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的: 运用16S rRNA 基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法: 提取细菌DNA,采用通用引物PCR扩增16S rRNA 基因片段并测序。将测序结果用Blastn 在线软件在Nucleotide 数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果: 12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。 结论: 16S rRNA 基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。     

不同16S rDNA通用引物对DGGE进行牙周微生物群落分析的影响

目的初步评价不同的16S rDNA片段对变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行牙周微生物群落分析结果的影响。方法选取3种牙周主要可疑致病菌的标准菌株,通过构建质粒DNA分别获得16S rDNA V3区、V3～V5区和V6～V8区片段,测序鉴定并进行BLAST验证;将测序正确的质粒DNA经DGGE分离和硝酸银染色后获得条带图谱。结果由3对通用引物扩增得到的DGGE图谱并不相同。V3区引物获得的并非单一条带,且不同菌株间没有识别度;V3～V5区和V6～V8区的图谱显示:3种菌株的DNA片段均得到了单一条带,且区分性较好。结论 16S rDNA V3～V5区和V6～V8区的两对引物可用于龈下菌群多样性的研究。     

幽门螺杆菌感染对小鼠食道下端菌群的影响

目的通过小鼠动物模型,检测幽门螺杆菌感染后食道下端菌群的变化,探讨其与食道下端疾病发生的关系。方法将30
只BALB/C小鼠随机均分为阴性对照组和感染组。感染组通过灌喂幽门螺杆菌菌液建立动物感染模型,两组小鼠均在末次灌
喂菌液4周后同时处死,取食道下端组织提取细菌的DNA,以原核生物16S rDNA V6区通用引物采用聚合酶链反应-变性梯度
凝胶技术（PCR-DGGE）对V6区进行扩增,用Quantity-One 1-D Analysis software.对DGGE图谱进行菌群分析,并将DGGE图
谱上的组间差异条带用16S rDNA V6区引物分别扩增后,DNA测序,BLAST比对分析。结果DGGE指纹图谱分析显示,实验
组DNA条带数量极显著高于对照组（P<0.01）,多样性指数、丰富度指数均显著高于对照组（0.01好地在相似性系统树中分开,主成分分析不同组的菌群分别聚集在不同的位置,BLAST比对分析感染组出现特有细菌。结论
食道下端定植着以乳杆菌、拟杆菌为优势菌的稳定菌群,幽门螺杆菌感染后菌群结构变化为以葡萄球菌、不动杆菌、无芽胞杆菌
为优势菌的菌群。
     

猖獗龋患者的病因和口腔微生物种类分析：1例报告

目的分析患者口腔全微生物种类,对猖獗龋患者提出细菌学预防与治疗手段。方法抽血查免疫全套和血常规,获取全 菌斑（A）、龋损（Q）、唾液（T）、黏膜（N）样本经原代涂片镜检,并传代分离培养后采用形态学、梅里埃鉴定仪、16S rDNA序列进化 分析鉴定微生物种类;进一步采用Q-PCR分析变异链球菌的含量,DGGE分析微生物组成和结构。结果血液免疫全套基本正 常,但IgE、中性分叶核细胞增高。原代样本涂片发现唾液中有大量极长链的细菌,经培养发现唾液中总菌含量最高,龋损样本 中溶血菌含量最高,变异链球菌在全菌斑中最多。梅里埃和测序鉴定出33株细菌,全菌斑中分离出多种链球菌和韦德纤毛菌、 龋损菌斑中多次分离到变异链球菌、具核梭杆菌和苏黎世链球菌,唾液样本中分离出多种乳杆菌。qPCR发现变异链球菌含量 明显增高;变性梯度凝胶电泳（DGGE）显示该患者细菌多样性明显降低,但丰度明显增强;条带切胶测序检出多种纤毛菌。结 论患者免疫功能基本正常,血液检测呈现感染血象,病因疑与细菌感染有关。可能由于唾液减少导致变异链球菌、多种纤毛菌 等致病微生物过度繁殖、细菌多样性减少而引起生态失衡。     

16SrDNA测序在儿童血流感染细菌性病原菌分布中的应用

目的：探讨PCR方法在分析血流感染病原菌分布中的作用,为儿童细菌性血流感染的流行病学调查提供新的思路。方法从儿科重症监护病房（PICU）收集100份疑似血流感染患儿的外周静脉血进行血培养,同时扩增并测序细菌16S rDNA,比较培养结果与PCR结果。结果100份血液标本中11份细菌培养阳性,阳性率为11%;PCR法23份阳性,阳性率为23%,二者比较差异具有统计学意义（χ2=10.08,P〈0.05）;在23例PCR阳性标本中,革兰氏阳性球菌占65.2%,其中表皮葡萄球菌最多（6例,26.1%）,革兰氏阴性菌占34.8%,以大肠埃希菌为主（4例,17.4%）。结论16S rDNA-PCR结合测序的方法可以很好地鉴定血流感染病原菌,与血培养相比能更客观地反映病原菌分布,可作为一种新的流行病学方法在临床应用;儿科重症监护病房血流感染病原菌以革兰氏阳性球     

变性梯度胶电泳分析不同喂养方式对早产新生儿肠道菌群的影响

目的采用变性梯度胶电泳方法(DGGE)研究喂养方式对早产新生儿肠道茵群的影响.方法收集同期6对新生儿1～21 d粪便,直接提取细菌总DNA,扩增16S rDNA V6～V8区后DGGE分离,测序并与EMBL核苷序列数据库进行比较.结果喂养前肠道菌群类似,以梭状芽孢杆菌、链球菌、克雷伯氏茵为主,开奶后母乳喂养儿以双歧杆茵为主,奶粉喂养儿肠道茵群显示其明显的多态性,有双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、链球菌、大肠杆茵、克雷伯氏菌、韦荣氏茵、沙雷氏茵以及不经培养细菌.结论喂养方式对早产新生儿茵群的形成及演替有明显影响,PCR-DGGE在多态性,动力性,茵群的演进变化方面提供了更加准确的数据和补充资料.     

Surgical strategy for mild ischemic mitral insufficiency

Background Accurate identification of bacterial isolates is an essential task in clinical microbiology. This study compared culturing to analyzing 16S rRNA gene sequences as methods to identify bacteria in clinical samples. We developed a key technique to directly identify bacteria in clinical samples via nucleic acid sequences, thus improving the ability to confirm pathogens.Methods We obtained 225 samples from Beijing Tongran Hospital and examined them by conventional culture and 16S rDNA sequencing to identify pathogens. This study made use of a modified sample pre-treatment technique which came from our laboratory to extract DNA. 16S rDNA was amplified by PCR. The amplified product was sequenced on a CEQ8000 capillary sequencer. Sequences were uploaded to the GenBank BLAST database for comparison.Results Among the positively cultivated bacterial strains, seven strains were identified differently by Vitek32 and by 16S rDNA sequencing. Twelve samples that were negative by standard culturing were determined to have pathogens by sequence analysis.Conclusion The use of 16S rRNA gene sequencing can improve clinical microbiology by providing better identification of unidentified bacteria or providing reference identification of unusual strains.     

利用DNA指纹图谱技术对健康女性阴道菌群多样性的分析

目的:利用DNA指纹图谱技术——变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)分析我国育龄期及绝经期健康女性阴道菌群多样性,为了解各种下生殖道感染疾病状态下的微生态环境奠定基础,为研制适合恢复中国女性正常阴道微生态环境的微生态制剂提供依据。方法:选取2009年10月至2010年1月在北京大学第一医院妇产科门诊常规体检的健康女性(其中育龄期30例、绝经后30例)为研究对象。采集阴道分泌物,提取细菌总DNA,采用通用引物对细菌16S rDNA基因的V3区进行扩增,将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳,通过对DGGE特征条带切胶回收并进行克隆测序,利用GenBank中的Blast与已知序列比对,鉴定细菌菌种,分析不同生理状态下阴道菌群的多样性。结果:(1)我国育龄期健康女性阴道常见菌种为:卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)和加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri),其中惰性乳杆菌是以往通过传统培养方法尚未认识到的阴道优势菌种。(2)绝经期健康女性阴道菌种与育龄期不同且复杂,常见菌种有:惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、解没食子酸链球菌(Streptococcusgallolyticus)、韦荣球菌属(Veillonella sp.)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、咽颊炎链球菌(Streptococcus angi-nosus)、普雷沃氏菌属(Prevotella sp.)、气球菌(Anaerococcus lactolyticus)和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)。结论:通过DGGE分析发现我国育龄期健康女性阴道常见优势菌种为:卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、加氏乳杆菌;绝经期健康女性阴道常见优势菌种为:惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、大肠杆菌、链球菌属、普雷沃菌属、脆弱拟杆菌以及产乳酸的韦荣球菌、气球菌属,并首次发现在不同生理状态下惰性乳杆菌均是阴道优势菌种之一。     

PCR-DGGE法检测DNA碱基突变及多态性的方法学评价

目的 了解聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)法检测DNA碱基突变和分辨单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的能力.方法 分别用DNA序列分析法及PCR-DGGE法检测白血病患者治疗前及缓解期的白细胞线粒体DNA D-loop区,以缓解期为对照,了解两种方法检测治疗前白细胞线粒体DNA D-loop区突变的能力并作比较.同时将野生型和突变型DNA以不同比例混合模拟DNA多态性存在,以了解PCR-DGGE检测SNP的灵敏度.结果 以DNA序列分析作为对照,PCR-DGGE法检测碱基突变的特异度达到100%,灵敏度为97.1%;PCR-DGGE可检出单碱基突变;PCR-DGGE可检测出约0.5%的多态性存在.结论 PCR-DGGE是一个检测DNA碱基突变和多态性存在的较好的方法.