低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响

目的 研究低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响。方法 采用组织块法分离培养兔脂肪间充质干细胞。用倒置显微镜观察原代细胞的细胞形态,流式细胞仪检测兔脂肪间充质干细胞的免疫表型。取第3代兔脂肪间充质干细胞置于-196℃液氮保存半年,37℃复苏并传至第7代。实验分为两组,实验组为冻存复苏后传至第7代的兔脂肪间充质干细胞,对照组为未冻存的第7代兔脂肪间充质干细胞,用MTT绘制其生长曲线;添加成脂、成骨诱导液进行诱导,油红O、茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测分别进行鉴定。结果 体外培养的兔脂肪间充质干细胞呈梭形纤维样细胞形态,生长力旺盛。流式细胞仪检测显示,第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD44、CD90,阴性表达造血细胞相关的表面标志CD45。两组细胞生长曲线呈典型的“S”形,无统计学差异（P>0.05）;成脂诱导14 d后,油红O染色呈阳性;成骨诱导2周时茜素红染色阳性,ALP表达活性随成骨诱导时间延长不断增加且无统计学差异（P>0.05）。结论 冻存后的兔脂肪间充质干细胞体外生长及多向分化潜能未发生显著变化。     

人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。方法收集健康足月新生儿脐带组织,采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原,将细胞冻存3个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高;细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105,不表达造血干细胞表型CD34、CD45等;冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞,为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。     

大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的研究

目的研究大鼠脂肪干细胞的基本生物学特性及其向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化潜能。方法取6周龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,胶原酶消化法分离出脂肪干细胞,体外培养。取第3代细胞,免疫细胞化学测定其CD44、CD34抗原表达,分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞及成骨细胞分化。油红染色、碱性磷酸酶染色和vonKossa染色鉴定其分化能力。结果大鼠脂肪干细胞生长能力旺盛,表达CD44,而不表达CD34;定向诱导后,油红染色、碱性磷酸酶染色和vonKossa染色阳性。结论大鼠脂肪组织可分离培养出脂肪干细胞,能向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化,有可能成为组织工程理想的种子细胞来源之一。     

成人脂肪间充质干细胞冻存的实验研究

目的 探寻成人脂肪间充质干细胞冻存和复苏的条件,观察冻存前后脂肪间充质干细胞的形态学特征以及向心肌细胞诱导分化的潜能.方法 自成人脂肪组织分离培养脂肪间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子.将脂肪间充质干细胞于液氮中低温冻存,经3个月后复苏,倒置相差显微镜及透射电子显微镜下观察细胞形态.5-氮杂胞苷进行诱导,免疫荧光技术检测心肌特异性肌钙蛋白-Ⅰ.比较冻存前后脂肪间充质干细胞的形态学特征及诱导转化率.结果 脂肪间充质干细胞较幼稚,冻存前后光镜下的形态及电镜下的超微结构无明显差别,脂肪间充质干细胞呈CD29阳性表达,HLA-DR阴性表达.冻存前后脂肪间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导后第28天均可表达心肌特异性肌钙蛋白-Ⅰ,诱导转化率无差异.结论 脂肪间充质干细胞可耐受低温冻存,复苏后细胞的形态学特征以及诱导分化潜能无明显变化.     

大鼠脂肪干细胞的培养及向神经细胞的定向分化

目的 从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞(Adsc),并通过体外培养观察其在形态、生长方式以及贴壁率、生长曲线等方面的生物学特征,以及其向神经细胞方向分化的能力.方法 取SD大鼠的腹股沟和腹膜后脂肪.分离体外培养ADSC,观察形态并进行传代.取第3代细胞测定其贴壁率、MTT比色法描绘生长曲线.免疫荧光法鉴定干细胞标志物CD44.通过两步诱导法诱导ADSC向神经细胞方向分化,免疫荧光法检测分化后细胞NSE、GFAP的表达情况.在分化过程中,用免疫组化检测Nestin的动态变化,验证ADSC分化与神经干细胞的关系.结果 从大鼠的脂肪组织中可成功提取ADSC,在含血清培养中能够连续传代并稳定增殖.而且ADSCs强烈表达CD44.经诱导剂诱导后,大部分ADSC分化表达NSE,而未见GFAP的表达.分化过程中,Nestin 表达水平经统计学分析后呈逐渐下降趋势.结论 ADSC具有强大的扩增能力和定向分化为神经元的生物学特性,分化后在形态、表型同时体现出了显著变化,可以成为治疗神经系统损伤、退行性疾病的较为理想的成体干细胞.     

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏

目的：探讨从人脐带华通氏胶（Wharton’s jelly,WJ）中分离、培养、鉴定间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）及其冻存、复苏的方法。方法：采用植块法分离、培养间充质干细胞,流式细胞仪检测P3代细胞免疫表型,鉴定其向成骨、成脂方向诱导分化的能力;将P1细胞冻存6个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果：植块法容易从人脐带华通氏胶中获得间充质干细胞;组织块贴壁后6 d可见组织块周围细胞爬出,原代培养14~18 d细胞融合70%~80%;P3代细胞强烈表达CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR;成骨诱导分化后10 d,可见明显钙结节;成脂诱导14 d,有明显的脂滴出现,油红O染色阳性。冻存再复苏细胞活力达80%,细胞免疫表型及成骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充质干细胞,冻存、复苏不改变其特性。     

低温冻存对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的比较人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)冻存前与复苏后的生物学特性,为规模化储备UC-MSCs提供试验支持。方法采用胶原酶消化法从脐带中分离UC-MSCs,贴壁培养传代,将第3代UC-MSCs利用程控降温仪冷冻,置于-196℃液氮中冻存6个月后复苏,比较冻存前和复苏后UC-MSCs的细胞形态、生长曲线、免疫表型及多向分化潜能等生物学特性。结果复苏后UC-MSCs仍呈成纤维样形态生长,生长曲线与冻存前相似;免疫表型仍高表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45、CD40、CD80、CD86、CD154、HLA-DR;在特定的体外诱导条件下,仍可以向骨、脂肪、软骨分化。结论冻存复苏后UC-MSCs的生物学特性仍保持稳定。     

人脐带源间充质干细胞的培养及生物学性状

目的 建立从脐带分离培养间充质干细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 脐带经剪碎置于?MEM培养基中培养至细胞爬出,细胞生长达80%培养皿底后传代,整个过程用倒置显微镜观察细胞形态,绘制生长曲线,用免疫荧光方法测定细胞免疫表型并研究其冻存及复苏.结果 脐带组织经直接贴壁培养法可培养出成纤维样细胞,免疫表型分析CD44和CD20阳性,冻存复苏后细胞存活率在90%以上,增殖能力强,和未冻存过的传代细胞具有同样的生长特性.结论 脐带组织培养可获得大量间充质干细胞,为间充质干细胞应用于科学研究和临床治疗提供了新的细胞来源.     

人脂肪源性基质细胞体外培养的实验研究

目的:探索人脂肪源性基质细胞(hADSCs)原代培养方法.方法:取成人脂肪,采用原代消化细胞培养法培养,对培养细胞进行形态学研究,测定生长曲线,对第2代细胞进行免疫细胞化学染色,鉴定其表面分子CD44.结果:成人脂肪组织中含有大量间充质干细胞,约70%～80%的细胞表达CD44.结论:建立了一种人体脂肪组织分离、培养hADSCs的简便方法.     

低温冻存对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

目的: 比较人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)冻存前和复苏后的生物学特性,为今后建立低温干细胞库提供实验支持。方法： 采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化法从腹部大网膜脂肪组织中分离hADSCs,体外培养扩增,将处于均一稳定生长状态的第3代hADSCs置于液氮中分别冻存1、3和6个月,复苏后台盼蓝染色检测细胞存活率,采用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面抗原,成脂成骨诱导后鉴定多向分化能力,RT PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和成骨特异性基因骨钙素(osteocalcin,OC)的表达情况。结果： 随冻存时间的延长细胞存活率略有下降,但差异无统计学意义(P＞0.05)。MTT结果显示冻存前后细胞增殖能力均很强。流式细胞检测结果显示冻存前后细胞均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166,低表达CD45和HLA-DR。冻存前后hADSCs均具有向脂肪细胞和骨细胞分化潜能,且RT-PCR结果显示,PPARγ-2和骨钙素mRNA的表达冻存前后差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论： 经液氮冻存后的hADSCs具有高存活率,生物学特性保持稳定且仍具有多向分化潜能。     

脂肪组织来源干细胞的细胞生物学研究

目的 探索从脂肪抽吸物中脂质部分分离、培养脂肪组织来源干细胞(ASCs)的方法,并通过其生长动力学、形态学、分化能力、细胞衰老和表面标记物轮廓5个方面的特征进行鉴定.方法 酶消化法处理脂类抽吸物,分离培养ASCs,观察细胞形态;MTT比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,丫啶橙染色检测细胞的衰老;流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定其表面分子表达;成脂定向诱导分化后油红"O"染色定性.结果 原代培养的ASCs呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力;MTT比色法活性测定均证实ASCs具有很强的增殖活性,细胞周期研究发现ASCs具有干细胞的特性.丫啶橙染色3、4、6、8代无明显衰老.流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CD44、CD34的表达均成阳性;HLA-DR、CD133表达为阴性;免疫化学染色发现Ⅷ因子、CD31、CD34、CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红"0"染色可见胞浆内有大量红染颗粒.结论 自人体脂类抽吸物中通过酶消化法能分离和培养出具有干细胞特性的成纤维细胞样细胞群,该细胞具有很强的增殖活性且不易衰老,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂分化.     

5-氮胞苷对大鼠脂肪间充质干细胞的诱导分化作用及相关蛋白的表达

目的 探讨5-氮胞苷(5-Aza)对大鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)的诱导分化作用及相关蛋白的表达。 方法 采取酶消化法和贴壁法分离培养Sprague-Dawley(SD)大鼠腹部皮下脂肪组织，采用抗单核细胞人类白细胞抗原DR(HLA-DR)、兔抗CD13、CD44、CD105、血管性血友病因子(vWF)多克隆抗体对培养细胞进行鉴定，排除造血干细胞及成纤维细胞，取第3代ADMSCs细胞，以每孔1×104个细胞接种于24孔培养板中，并将其随机分为正常组和诱导组，正常组细胞于常规培养基中加入无菌生理盐水培养，诱导组细胞于常规培养基中加入浓度为10 μmol/L的5-Aza进行诱导培养。比较2组细胞的形态结构、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)及缝隙连接蛋白43(Connexin43)基因表达量及cTnT、cTnI、Connexin43蛋白的表达情况。 结果 诱导组ADMSCs细胞增殖缓慢，体积增大并逐渐变为棒状或宽梭形，形态呈心肌细胞特征；RT-qPCR结果显示，诱导组细胞cTnT、cTnI及Connexin43基因表达量增强；免疫组化结果显示，诱导组细胞细胞质明显可见棕黄色或棕褐色颗粒物质，而正常组细胞细胞质中棕黄色或棕褐色颗粒物质较少，且诱导组细胞cTnT、cTnI及Connexin43蛋白阳性表达评分明显高于正常组(P<0.05)。 结论 大鼠脂肪组织中含有多向分化潜能的间充质干细胞(MSCs)，5-Aza可以诱导大鼠ADMSCs向心肌细胞分化，ADMSCs有望成为治疗心肌梗死的种子细胞。      

成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人脂肪间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血,肝素抗凝,Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13,CD44,CD71,CD166）,但不表达造血细胞抗原（CD34,CD45）,这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

Effect of Cytokines Secreted by Human Adipose Stromal Cells on Endothelial Cells

Recently, several observations have pointed to the presence of a population named adipose-derived adult stem cells (ADAS) or adipose stromal cells (ASCs) in human adipose tissue. Subsequent studies revealed that ASCs were multipotent, differentiating along the cardiac myocyte, endothelial, neuronal, and other cells lineages[1, 2], and could secrete cytokines such as HGF and VEGF[3]. Since adipose tissue is an abundant, accessible, and re- plenishable source of adult stem cells that can b…     

组织工程化皮瓣的构建

目的应用脂肪组织来源干细胞(ASCs)在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法(1)构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。(2)构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞(Kc)和成纤维细胞(Fb)。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。(3)构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果(1)ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。(2)经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。(3)组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

Irradiation Response of Adipose-derived Stem Cells under Three-dimensional Culture Condition

Objective Adipose tissue distributes widely in human body. The irradiation response of the adipose cells in vivo remains to be investigated. In this study we investigated irradiation response of adipose-derived stem cells (ASCs) under three-dimensional culture condition.
Methods ASCs were isolated and cultured in low attachment dishes to form three-dimensional (3D) spheres in vitro. The neuronal differentiation potential and stem-liked characteristics was monitored by using immunofluoresence staining and flow cytometry in monolayer and 3D culture. To investigate the irradiation sensitivity of 3D sphere culture, the fraction of colony survival and micronucleus were detected in monolayer and 3D culture. Soft agar assays were performed for measuring malignant transformation for the irradiated monolayer and 3D culture.
Results The 3D cultured ASCs had higher differentiation potential and an higher stem-like cell percentage. The 3D cultures were more radioresistant after either high linear energy transfer (LET) carbon ion beam or low LET X-ray irradiation compared with the monolayer cell. The ASCs’ potential of cellular transformation was lower after irradiation by soft agar assay.
Conclusion These findings suggest that adipose tissue cell are relatively genomic stable and resistant to genotoxic stress.     

骨髓和脂肪源多潜能间充质干细胞的比较研究

①目的比较骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞的生物学特性。②方法分离人的骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞进行体外培养，通过绘制生长曲线，比较细胞的增殖能力；利用流式细胞仪分析细胞表型，并与诱导培养比较细胞的分化潜能进行比较。③结果脂肪源间充质干细胞与骨髓源间充质干细胞具有相当的生物学特性，且在增殖能力方面优于骨髓源间充质干细胞。④结论人脂肪组织可能成为一种新的间充质干细胞来源。     

不同类型血清对大鼠脂肪干细胞分离培养的影响

目的研究不同血清培养基对脂肪干细胞分离培养的影响.方法用4种不同类型的血清培养基分离培养大鼠脂肪干细胞,免疫荧光法检测培养细胞CD34、CD90、CD133、Flk-1表面标志;成骨诱导液诱导分化,于14 d进行碱性磷酸酶和钙染色检验各细胞成骨分化特性.结果（1）新生牛血清组可见贴壁单个核细胞形态单一,呈梭形生长,无重叠现象;胎牛血清组均可见大量多角细胞呈巢状生长,形成铺路石样形态,间或有梭形细胞存在;（2）新生牛血清组梭形贴壁细胞免疫荧光检测可见CD90为阳性,CD34、CD133、Flk-1染色均为阴性;胎牛血清组多角形细胞CD34、Flk-1均为阳性,CD133组部分为阳性,CD90为阴性;（3）新生牛血清组贴壁细胞多数呈碱性磷酸酶阳性;胎牛血清组细胞多角状细胞死亡,形成空白区,梭形细胞呈碱性磷酸酶阳性;（4）新生牛血清组均可见大量红色钙结节影;胎牛血清组细胞多角状细胞死亡,形成空白区,梭形细胞红色钙结节影.结论（1）新生牛血清培养脂肪干细胞可以得到较纯的细胞;（2）胎牛血清组培养含有大量的血管内皮细胞.     

小鼠脂肪源间充质干细胞的培养鉴定及增强绿色荧光蛋白-慢病毒载体转染

目的探索脂肪源间充质干细胞（ADMSCs）的分离培养方法、生长特性及筛选出慢病毒载体感染间充质干细胞的最佳感染指数（MOI）,并鉴定其感染后的增殖能力,为ADMSCs移植治疗急性肾小管损伤提供实验依据。方法取4周龄昆明小鼠腹股沟脂肪组织,差速贴壁法培养分离昆明小鼠脂肪源间充质干细胞。经细胞培养液洗涤、离心后接种于细胞培养瓶,放置体积分数5％CO2孵箱中培养,24h后换液,以后每3d更换培养基,待细胞融合达到约90％时,传代培养。取第3代ADMSCs用流式细胞术（FCM）检测其表型、茜素红染色及油红O染色鉴定其多向分化潜能;用携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒载体（LV）感染ADMSCs,FCM检测病毒感染效率,四甲基偶氮唑蓝（MTY）比色法检测感染后的细胞活力。结果（1）差速贴壁法培养分离7-11d时细胞融合达80％以上。原代细胞融合达80％～90％进行1：4传代,细胞贴壁和生长速度快于原代细胞培养。第3代及再传代细胞形体趋于一致,细胞呈梭形。细胞连续传代10次,生长速度未见明显减缓;（2）FCM检测第3代细胞CD29阳性表达98．93％,CD34阳性表达0．17％;（3）第3代细胞成脂诱导14d油红O染色阳性,成骨诱导14d茜红染色阳性;（4）当MOI=25感染第3代细胞72h后,共聚焦荧光显微镜观察细胞EGFP阳性表达60％～70％,细胞活力不受影响;（5）MrIT法显示重组慢病毒转染细胞与未转染慢病毒细胞比较,细胞增殖能力无差异。结论从昆明小鼠腹股沟脂肪组织中分离的ADMSCs可在体外稳定传代;差速贴壁法可以简便、高效地提取ADMSCs;携带EGFP的LV可有效感染ADMSCs,并且感染后其增殖能力不受影响。