六味地黄丸调控肝癌CBRH7919细胞Cx43表达的体外研究

【目的】探讨六味地黄丸对大鼠肝癌CBRH7919细胞缝隙连接蛋白(Cx)43表达的影响。【方法】应用血清药理学方法制备六味地黄丸含药血清,分别采用蛋白免疫印迹(Western blot)法、异硫氰酸荧光素(FITC)标记间接免疫荧光染色—激光共聚焦显微镜技术、流式细胞术检测不同剂量(体积分数0%、2.5%、5%、10%)六味地黄丸含药血清组CBRH7919细胞Cx43蛋白的表达,采用实时定量逆转录—聚合酶链反应(RT-q PCR)检测各组肝癌细胞Cx43 m RNA的表达。【结果】与对照组(0%六味地黄丸含药血清)比较,体积分数为2.5%、5%、10%的六味地黄丸含药血清均能明显提高肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白及m RNA表达水平。【结论】六味地黄丸可能是通过促进肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白及m RNA的表达,改变Cx43膜定位,改善细胞间缝隙连接通讯功能,从而发挥抑制肝癌的作用。     

六味地黄丸通过干预缝隙连接通讯功能调控树突状细胞抗原交叉提呈能力研究

【目的】探讨六味地黄丸是否通过提高缝隙连接通讯功能(GJIC)增强树突状细胞(DC)抗原交叉提呈能力,并对其机制进行相关探索。【方法】采用Western Blot实验、免疫荧光法观察六味地黄丸含药血清对黑色素瘤细胞(B16)缝隙连接蛋白43(Cx43)表达及膜定位的影响;采用钙黄绿素(Ca-AM)/DiI荧光示踪实验观察六味地黄丸含药血清对B16细胞GJIC功能的影响;采用流式细胞术观察GJIC在六味地黄丸含药血清增强DC抗原提呈能力中的作用;采用碘化丙啶(PI)/Hoechst染色实验观察CD8⁺T淋巴细胞的免疫杀伤效果。【结果】Western Blot及免疫荧光实验结果显示,六味地黄丸含药血清上调Cx43表达;荧光示踪实验证明,六味地黄丸含药血清显著增强B16细胞GJIC功能;流式细胞术分析表明,六味地黄丸含药血清增强DC抗原提呈能力;PI/Hoechst染色结果显示,六味地黄丸含药血清干预B16-OVA后CD8⁺T细胞的免疫杀伤效果更加显著。【结论】六味地黄丸通过上调黑色素瘤细胞Cx43表达,改善GJIC功能,进而增强DC的交叉提呈能力...     

自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用

[目的]观察六味地黄丸含药血清协同HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的作用,探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性.[方法]构建HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统,确定丙氧鸟苷(GCV)工作浓度(39.2 μmol/L);选用SD大鼠灌胃制备六味地黄丸含药血清和空白血清,并观察含药血清和空白血清对肿瘤细胞生长的影响.设空白对照组、GCV对照组、自杀基因治疗对照组,以上3组均为无大鼠血清的对照组.空白血清组、GCV加空白血清组、自杀基因系统加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组、自杀基因系统联合含药血清组中,所有大鼠的空白血清和含药血清再分为体积分数5%和7.5%2种浓度,每组设6个复孔.将大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk 和CBRH7919/tk-混合,使tk 细胞的比例分别占0%、5%、10%,按3×103个/孔细胞分别接种到96孔板,用完全培养基培养细胞24 h后,相应加入体积分数5%或7.5%的大鼠空白血清和含药血清,孵育J2 h,加入GCV,培养60 h,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,用Q值(实测药效与理论药效的比值)分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性(0.85≤Q＜1.15为相加作用,Q≥1.15为协同作用).[结果]空白血清和含药血清浓度在体积分数20%以下时未显示明显细胞毒性;血清浓度为体积分数5%和7.5%时,自杀基因系统联合含药血清组与单独含药血清组及自杀基因系统加空白血清组比较,联合组对肿瘤细胞的杀伤作用均强于其他非联合组,细胞存活率均有显著性差异(P＜0.01),而且自杀基因系统联合含药血清的作用具有明显的协同性(Q＞1.15).[结论]HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统联合六味地黄丸对杀伤肿瘤细胞具有协同增效作用.     

六味地黄丸对自杀基因系统杀伤肝癌细胞增效作用的量效关系

[目的]观测六味地黄丸含药血清对自杀基因HSV-tk/GCV系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的增效作用,探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性.[方法]构建HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统,并确定丙氧鸟苷(GCV)的工作浓度(39.2 μmol/L);制备SD大鼠4 d和8 d六味地黄丸(剂量为32g·kg-1·d-1)灌胃含药血清和生理盐水灌 胃空白血清;用大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk-或tk-与tk-1:9比例混合细胞按3×103个/孔铺96孔板,分为空白血清组、GCV加空白血清组、10%tk+/GCV加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组及10%tk+/GCV联合含药血清组;含药血清又再分为低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组6个复孔,用完全培养基培养24 h后,各组分别加入相应空白血清或含药血清,孵育12 h,加入终浓度39.2 μmol/L的GCV,培养60 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性,Q值法分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性.[结果]空白血清组、含药血清组、GCV加空白血清组、GCV加含药血清组细胞均未显示明显的细胞毒性.10%tk+/GCV加空白血清组及10%tk+/GCV联合不同浓度的含药血清组均具有显著杀伤作用(与空白血清组比较,P<0.05),联合组存活率显著低于10%tk+/GCV加空白血清组(P<0.05);含药血清中剂量和高剂量组的联合作用具有协同性(Q>1.15),且有浓度依赖性.给药4 d血清和给药8 d血清结果无显著性差异(P>0.05).[结论]六味地黄丸含药血清对自杀基因系统10%tk+/GCV杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞具有协同增效作用,且有一定的量效关系.     

六味地黄丸对自杀基因系统治疗黑色素瘤的增效作用

【目的】研究六味地黄丸对HSV1-tk/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤的增效作用,以期探讨建立中西医结合肿瘤自杀基因联合治疗方案的可行性。【方法】培养病毒包装细胞PT67/tk,病毒上清感染黑色素瘤细胞株B16,G418筛选2周,获得抗性细胞克隆,命名为B16/tk并进行体外GCV杀伤试验;证明具有杀伤活性后,将B16/tk与野生型B16按1∶4的比例混合后接种于C57BL/6J小鼠右腋下皮下组织内,以复制小鼠移植性黑色素瘤模型。将复制模型的小鼠分为模型对照组、六味地黄丸组、自杀基因tk/GCV治疗组和联合治疗组(N=11),六味地黄丸从接种第2天起治疗25 d,tk/GCV从接种第7天起治疗20 d,另设正常对照组观察疗效。【结果】体外杀伤实验显示,GCV对B16/tk肿瘤细胞具有明显的杀伤效应,而对野生型B16肿瘤细胞无明显的杀伤作用,表明体外病毒感染黑色素瘤细胞成功,病毒携带的外源性自杀基因已表达且具有生物学活性。联合治疗(自杀基因联合六味地黄丸)对小鼠移植性黑色素瘤生长具有明显抑制作用,联合治疗组肿瘤质量与模型对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),其抑瘤率达到87.1%;而单纯自杀基因组和六味地黄丸组肿瘤质量与模型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),抑瘤率分别为62.8%和54.4%。病理检查结果显示,肉眼见治疗组肿瘤体积减小,以联合治疗组更明显。光镜下见治疗组肿瘤细胞密度相对较低,肿瘤周围有较多纤维结缔组织增生及炎症细胞浸润,其中联合治疗组更明显。结果表明:自杀基因联合六味地黄丸治疗对小鼠移植性黑色素瘤生长具有抑制作用,其疗效优于单纯自杀基因治疗或单纯六味地黄丸治疗。【结论】六味地黄丸可能通过自杀基因疗法旁杀伤效应的免疫机制或其他机制对肿瘤自杀基因疗法起到增效作用。该研究工作初步证明了建立自杀基因联合中医药疗法的中西医结合肿瘤基因治疗方案具有可行性。     

六味地黄丸增强黑色素瘤自杀基因系统旁观者效应的体外研究

【目的】探讨六味地黄丸含药血清对单纯疱疹病毒核苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞株的增效作用,为提高临床基因治疗肿瘤疗效提供新思路。【方法】构建并鉴定恶性黑色素瘤B16细胞HSV-tk/GCV治疗系统,制备六味地黄丸含药血清及对照血清,将B16、B16/tk细胞按20%(1:4)的比例混合制成细胞悬浮液接种于96孔培养板上,分为对照血清组、含药血清组、对照血清联合GCV组、含药血清联合GCV组,其中含药血清组及含药血清联合GCV组按血清体积分数计又分高(10%)、中(5%)、低(2.5%)3组,GCV的终浓度为25μmol/L,按分组添加相应的含药血清,每孔培养液总体积200μL,37℃、体积分数5%的CO2培养箱培养。48h后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测杀伤效应。采用金正钧Q值法分析六味地黄丸含药血清与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。【结果】MTT实验表明联合用药组对B16细胞的抑制率明显高于其他组,六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统的增效作用存在量效关系:2.5%、5%、10%含药血清联合20%tk/GCV组的实际抑制率(48.75%、59.39%、69.28%)显著高于理论抑制率(38.13%、38.67%、39.92%),金正钧Q值分别为1.28、1.54、1.74,均大于1.15,具有协同增效作用。【结论】六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统旁观者效应有明显的增效作用,且具有一定的量效关系。     

六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗的增效作用

【目的】观察六味地黄丸对小鼠皮下移植性肝细胞癌自杀基因治疗的增效作用,探讨建立中西医结合肿瘤自杀基因联合治疗方案的可行性。【方法】培养病毒包装细胞PT67/tk,病毒上清感染肝细胞癌细胞株H22后用G418筛选2周,获得抗性细胞克隆,命名为H22/tk并进行体外丙氧鸟苷(GCV)杀伤试验;证明杀伤活性后,将H22/tk与野生型H22按1∶4的比例混合后接种于昆明种小鼠皮下组织内造模,分为模型对照组、自杀基因治疗组、六味地黄丸治疗组和联合治疗组(N=20),并设正常对照组(N=10);六味地黄丸治疗从接种第2天起共15 d,GCV治疗从接种第6天起共11 d,观察疗效。【结果】体外实验中GCV对H22/tk肿瘤细胞具有明显的杀伤效应,表明体外病毒感染肝癌细胞成功,病毒携带的外源性自杀基因已表达且具有生物学活性。体内实验中于接种肿瘤细胞后第6天各组能触摸到肿瘤,成瘤率100%。自杀基因联合六味地黄丸治疗对小鼠移植性肝细胞癌生长速度具有明显抑制作用,以瘤块质量计算,其抑瘤率为63.0%(P<0.05);而单纯六味地黄丸治疗和单纯自杀基因治疗抑瘤率分别为46.3%和37.4%,但两者与模型组比较差异均无显著性意义。病理检查:各治疗组肉眼可见肿瘤体积均较模型对照组肿瘤体积小,以联合治疗组更明显。镜下可见各治疗组肿瘤细胞密度相对较低,肿瘤周围有较多纤维结缔组织增生及炎症细胞浸润,联合治疗组更明显,各组间差别以炎症细胞浸润最突出。【结论】六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗具有一定的增效作用,其疗效优于单纯自杀基因疗法或单纯六味地黄丸治疗。     

木犀草素增强Cx32/Cx26组成的细胞缝隙连接功能

【目的】 体外观察木犀草素对转染并稳定表达缝隙连接蛋白32/ 26(Cx32/Cx26)的Hela细胞缝隙连接通讯功能(GJIC)和Cx26蛋白表达水平的影响。【方法】 用SRB法检测不同浓度木犀草素对Hela细胞的毒性;用细胞接种荧光示踪法观察不同浓度木犀草素对GJIC的影响;用western blotting 研究木犀草素在影响GJIC功能浓度范围内对Cx26表达的影响。【结果】 木犀草素在0 ~ 1 μmol/L浓度时对Hela细胞无毒性作用;木犀草素(0.01 ~ 1 μmol/L)能浓度依赖性地增强GJIC及Cx26蛋白表达量。【结论】木犀草素增强转染并稳定表达Cx32/Cx26的Hela细胞GJIC;这种增强作用可能与其增加Cx26蛋白表达水平有关。     

树突状细胞活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞对大鼠原发性肝癌细胞的体外杀伤

目的：研究负载肿瘤抗原的树突状细胞活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞对原发性肝癌细胞的杀伤效应,探讨其用于临床治疗的可行性,并为其应用提供实验依据。方法：联合应用粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子,白细胸介素－4和肿瘤坏死因子－a等,对大鼠骨髓单个核细胞进行体外诱导,同时加入大鼠原发性肝癌细胞株CBRH－7919细胞匀粗提物进行刺激,制备负载肿瘤抗原的树突状细胞后,活化同基因大鼠的 脾脏细胞,制备特异性细胞毒性T淋巴细胞,并采用MTT法检测效应细胞对CBRH－7919的杀伤效果,同时与效应细胞对K562的杀伤率进行比较。结果：大鼠骨髓单个核细胞诱导的负载肿瘤抗原的树突状细胞活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞对CBRH－7919具有较高的特异性杀伤作用。结论：负载肿瘤抗原的树突状细胞对原发性肝癌的治疗有潜在的临床应用前景。     

六味地黄丸含药血清调控黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用

[目的] 观察六味地黄丸含药血清调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白(Cx)表达的作用.[方法]采用SD大鼠灌胃8 d制备六味地黄丸含药血清(药物荆量为32 g·kg-1·d-1)和对照血清(灌胃等容积生理盐水);选择对B16细胞生长和形态影响不大的血清浓度 (体积分数为10%) 作为大鼠血清的工作浓度;采用Western blot技术和间接免疫荧光法及流式荧光法检测六味地黄丸含药血清对黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白(Cx26/30/32)表达的影响.[结果]Westem blot检测显示空白组 (无鼠血清) 3种Cx几乎不表达,而对照血清和六味地黄丸各浓度含药血清均能提高Cx蛋白的表达,但含药血清的作用更为明显且有显著的量效关系;间接免疫荧光法和流式荧光法检测显示类似的结果:对照血清组和中、高剂量含药血清组的Cx蛋白荧光强度均较空白组显著增加(P<0.01),但与对照血清组比较,只有高剂量含药血清组荧光强度显著增加(P<0.05),低剂量舍药血清组Cx蛋白表达反而下降(P<0.01).[结论]六味地黄丸含药血清具有调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用.     

六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗增效作用的病理学研究

【目的】探讨六味地黄丸对小鼠移植性肝癌HSVt-k/GCV自杀基因治疗增效作用的病理学机制。【方法】昆明种小鼠90只,随机分为5组:正常对照组、模型对照组、六味地黄丸治疗组(剂量为10 g.kg-1.d-1)、自杀基因治疗组(腹腔注射丙氧鸟苷100 mg.kg-1.d-1)、联合治疗组;选用H22与H22/tk细胞株皮下接种建立小鼠荷肝癌模型,以自杀基因疗法联合六味地黄丸进行治疗并观察疗效;对肿瘤组织进行病理学观察和半定量分析;采用免疫组化技术及原位末端标记(TUNEL)技术观察肿瘤细胞增殖核抗原(PCNA)的表达及凋亡情况。【结果】HSVt-k/GCV自杀基因系统联合六味地黄丸治疗较单独应用HSVt-k/GCV系统或六味地黄丸能更显著地抑制肿瘤生长;免疫组化及凋亡TUNEL染色结果表明联合治疗组对肿瘤细胞增殖的抑制及对肿瘤细胞凋亡的诱导作用与模型对照组比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。【结论】六味地黄丸对实验性肝癌的自杀基因治疗具有增效作用,其机制可能与六味地黄丸抑制了自杀基因治疗过程中肿瘤细胞的加速增殖有关,也与协同促进自杀基因治疗诱导的肿瘤细胞凋亡有关。     

丹参酮ⅡA对HUVEC细胞间缝隙连接的作用

【目的】探讨丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)对人胎脐静脉上皮细胞(HUVEC)缝隙连接细胞通讯(GJIC)的影响及其机制。【方法】采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测丹参酮ⅡA对HUVEC细胞生长的影响,荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析GJIC功能变化,并与阳性对照药全反式维甲酸(ATRA)比较,采用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)法分析Cx37、Cx40 m RNA的表达。【结果】丹参酮ⅡA作用HUVEC 24、48 h的半数致死量(IC50)分别为15、8.5μmol/L,32、64μmol/L丹参酮ⅡA作用HUVEC 48 h有明显细胞毒性,抑制率大于70%;选用0、4、8、16、32μmol/L丹参酮ⅡA作用HUVEC48 h,流式细胞仪检测结果显示:各组接受绿色荧光Calcein-AM的细胞数量与总细胞数比值明显升高,其中8、16、32μmol/L组可显著提高GJIC功能(P0.01)。q RT-PCR分析结果显示:与空白对照组比较,8、16、32μmol/L丹参酮ⅡA组可显著提高Cx37、Cx40 m RNA表达(P0.05或P0.01),并有一定的浓度依赖关系。【结论】丹参酮ⅡA能够提高Cx37、Cx40 m RNA表达,这可能是丹参酮ⅡA增强上皮细胞GJIC功能的机制之一。     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应

目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／更昔洛韦(herpes simplex virus thymidine kinase／ganeyclov—ir,HSV—tk／GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用脂质体将pCMV／hytk-IRES-hrGFP质粒导入HXO-Rb44细胞株。用潮霉素筛选出阳性细胞克隆并命名为HXO-Rb44／tk。RT—PCR鉴定hytk基因在HXO-Rb44／tk细胞中的转录结果。比较HXO-Rb44和HXO-Rb44／tk细胞的形态特征及生长特性。通过MTT法检测GCV对不同比例HXO-Rb44／tk和HXO-Rb44混合细胞的杀伤作用(“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果HXO-Rb44／tk细胞经RT—PCR可检测出530bp的hytk基因片段。HXO-Rb44／tk和HXO-Rb44细胞的形态特征及生长特性无明显差异。HXO-Rb44／tk细胞仅占很低比例时即可观察到明显的旁观者效应,而GCV作用的HXO-Rb44／tk细胞上清对HXO-Rb44细胞无杀伤作用。结论 HSV—tk基因转移联合GCV治疗可作为Rb基因治疗的一种有效方法,旁观者效应可能是GCV代谢产物通过缝隙连接进行细胞间转运来实现的。     

六味地黄丸含药血清对Eahy926细胞ERK/Nrf2-HO-1信号通路的影响

目的 观察六味地黄丸含药血清对人血管内皮细胞Eahy926增殖及其ERK/Nrf2-HO-1信号通路的影响.方法 CCK-8检测大鼠5％、10％、20％空白血清与5％、10％、20％含药血清对Eahy926细胞增殖的影响,并用Western-blotting方法检测10％含药血清对Eahy926细胞ERK/Nrf2-HO-1信号通路分子蛋白表达的影响.结果 六味地黄丸含药血清可以促进Eahy926细胞的增殖;在Eahy926细胞中,10％六味地黄丸含药血清能够促进ERK的磷酸化、Nrf2核转位和HO-1蛋白的表达,明显高于无大鼠血清组和10％空白血清组.结论 10％六味地黄丸含药血清诱导ERK磷酸化介导Nrf2入核和HO-1蛋白的表达.     

绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建及活性检测

【目的】构建绿色荧光蛋白(GFP)示踪的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组慢病毒载体,并检测该系统对人皮肤黑色素瘤细胞株A375的感染活性。【方法】构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒表达载体p LV-tk-GFP,并使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定;用该重组质粒与辅助质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染A375,以嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株;使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,更昔洛韦(GCV)杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。【结果】重组质粒p LV-tk-GFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,tk基因已连接到载体正确位置,序列无突变;包装病毒并感染细胞后,荧光显微镜下观察显示tk-GFP基因在A375中表达;筛选得到稳定表达细胞株A375/tk-GFP,GCV能显著杀伤A375/tk-GFP细胞,表明tk基因活性正常。【结论】成功构建了重组p LV-tk-GFP慢病毒载体,该载体能包装产生活病毒且在感染的人黑色素瘤细胞株A375中tk-GFP具有生物活性。     

补肾法对肾虚大鼠空间学习记忆能力的影响

【目的】探讨补肾法对房室不节肾虚大鼠空间学习记忆能力及海马DG区细胞超微结构的影响。【方法】将连续配种6个月经鉴定生殖功能下降的SD大鼠随机分为肾虚模型组,六味地黄丸低、高剂量组(剂量分别为4.8、9.6 g·kg-1·d-1)和金匮肾气丸低、高剂量组(剂量分别为5.2、10.4 g·kg-1·d-1),并以2月龄大鼠作为正常对照组。连续给药30 d后,进行Morris水迷宫实验,采用透射电镜观察海马DG区细胞超微结构。【结果】Morris水迷宫定位航行实验结果显示:与正常对照组比较,肾虚模型组逃避潜伏期显著延长(P<0.01);与肾虚模型组比较,各给药组潜伏期显著缩短(P<0.05或P<0.01)。空间探索实验结果显示:与正常对照组比较,肾虚模型组原平台所在象限停留时间和平台周边区域一停留时间均显著减少(P<0.01);与肾虚模型比较,金匮肾气丸高剂量组2项停留时间均显著增加(P<0.05或P<0.01),六味地黄丸低剂量组平台周边区域一停留时间显著增加(P<0.05)。电镜观察结果显示:与肾虚模型组比较,六味地黄丸高剂量组和金匮肾气丸高剂量组可减轻大鼠海马DG区细胞超微结构病变。【结论】(1)长期房室不节可引起海马DG区细胞超微结构病变,导致空间学习记忆障碍。(2)补肾法可减轻房室不节对大鼠空间学习记忆能力的损伤及海马DG区细胞超微结构病变。(3)补肾方药在改善肾虚大鼠空间学习能力及细胞超微结构病变方面无显著性差异,金匮肾气丸改善房室不节肾虚大鼠的空间记忆能力的作用优于六味地黄丸。     

慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞杀伤作用的实验研究

目的:探讨慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞的杀伤作用。方法:在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMVΔ8.2、包膜基因pCMV.VSVG、目的基因pHR'CS.GFP或pHR'CS.CDglytk导入病毒包装细胞293T,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩后转染T淋巴细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测基因的整合及表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或无环鸟苷(GCV)后,MTT法测定细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞。对照组荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光,透射电镜下观察可见许多病毒颗粒。慢病毒介导的双自杀基因在T淋巴细胞中高效、稳定表达,单独使用GCV或5-FC对T细胞/CD+tk的存活率与未转染T细胞比较明显降低(P<0.01),与单独使用5-FC或GCV比较,联合使用5-FC和GCV时T细胞的存活率明显降低(P<0.01)。结论:慢病毒介导的双自杀基因可高效稳定转染T淋巴细胞,双自杀基因系统较单一自杀基因系统(CD/5-FC或HSV-tk/GCV)对T淋巴细胞的杀伤具有明显增强作用。     

不同剂量补锌对老龄大鼠T淋巴细胞和自然杀伤细胞活性的影响

【目的】观察膳食补充不同剂量锌对老龄大鼠T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞活性的影响。【方法】通过喂饲锌含量不同的饲料，构建老龄期大鼠补锌模型；6W后测定血清锌、脾脏T淋巴细胞转化率和NK细胞活性。【结果】实验组老龄大鼠脾脏T淋巴细胞转化率、NK细胞活性和血清锌含量明显高于正常组（P〈0．05）。NK细胞活性随着血清锌含量的增加活性增强并呈正相关（r=0．764，P〈0．01）。【结论】膳食补锌一定程度上可以延缓老龄引起的细胞免疫功能下降。     

逆转录病毒载体介导HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建

【目的】 探讨自杀基因抗肿瘤系统构建的方法。【方法】 用DNA重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-tk)定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN,并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定;用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人胃癌细胞,检测HSV1-tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应。【结果】 经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1-tk基因成功定向插入到pLXSN载体中;重组病毒DNA转染包装细胞,筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67/tk,扩大培养,获取病毒滴度为4×10~4 cfu/mL的重组逆转录病毒培养液;感染胃癌细胞SGC-7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC-7901/tk。丙氧鸟苷(GCV)对SGC-7901/tk有明显杀伤作用,对SGC-7901无明显毒性,证明该病毒表达HSV1-tk基因,表达产物具有生物活性。【结论】 将HSV1-tk定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取表达HSV1-tk(基因的逆转录病毒,成功建立了肿瘤自杀基因治疗系统,这将为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础。     

川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖和分化的影响

【目的】观察川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞(ES细胞)增殖及分化的影响。【方法】川芎含药血清与ES细胞共培养,采用CCK-8法检测细胞活性,逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌细胞特异基因肌球蛋白重链(β-MHC)m RNA的表达水平。【结果】与大鼠血清组和胎牛血清组比较,川芎含药血清组的ES细胞活性差异无统计学意义(P0.05),川芎含药血清组心肌细胞特异基因β-MHC表达水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。【结论】川芎含药血清对ES细胞向心肌细胞分化有促进作用。