白细胞介素6通过抑制自噬促进人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：探讨IL-6对血管内皮细胞自噬和凋亡的影响以及自噬与凋亡的相互作用关系。方法：采用不同浓度IL-6诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖与活性,流式细胞术检测细胞凋亡变化,单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色观察细胞嗜酸性自噬泡情况,透射电镜观察细胞超微结构的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白激活型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase3)以及自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和(sequestosome 1, SQSTM1)/P62表达水平。进一步采用IL-6分别联合自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RP)诱导自噬或3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制自噬,观察自噬对IL-6诱导血管内皮细胞凋亡的影响。结果：1. 与对照组相比,IL-6可以呈浓度依赖性降低血管内皮细胞的活性(P＜0.05),增加血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05);2. IL-6浓度依赖性降低血管内皮细胞内LC3-II/LC3-I的表达(P＜0.05)而增加P62的表达(P＜0.05),在IL-6刺激下,MDC 染色观察可见血管内皮细胞内自噬泡逐渐减少(P＜0.05),荧光强度明显减弱,透射电镜下表现为自噬小体明显减少;3. 采用自噬抑制剂3-MA刺激血管内皮细胞,发现3-MA可以进一步抑制IL-6刺激下的血管内皮细胞的自噬水平而增加凋亡水平,表现为LC3-II/LC3-I的表达进一步下降(P＜0.05)和P62的表达进一步增加(P＜0.05),血管内皮细胞内的自噬泡和自噬小体数量明显减少(P＜0.05),并且3-MA可以进一步增加IL-6刺激下血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05);4. 进一步采用自噬促进剂RP刺激血管内皮细胞,发现RP可以改善IL-6刺激下的血管内皮细胞的自噬水平而降低凋亡水平,表现为LC3-II/LC3-I的表达升高(P＜0.05)和P62的表达下降(P＜0.05),血管内皮细胞内的自噬泡和自噬小体数量的增多(P＜0.05),并且RP可以明显减少IL-6刺激下血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05)。结论：白介素-6可通过抑制自噬而增加血管内皮细胞凋亡。     

自噬相关基因3过表达促进乳腺癌细胞自噬并抑制盐霉素诱导的细胞凋亡

目的研究人自噬相关基因3（ATG3）过表达对乳腺癌细胞自噬及盐霉素诱导细胞凋亡的影响和机制。方法采用慢病毒 的方法,构建了稳定过表达ATG3的乳腺癌MCF-7细胞株;通过Western blotting、免疫荧光和透射电镜等方法分析了ATG3过表 达对乳腺癌MCF-7细胞自噬的影响;并用AKT/mTOR的激动剂（SC79和MHY1485）分析AKT/mTOR信号通路对ATG3过表 达促进细胞自噬的影响;通过Western blotting和流式细胞术,同时结合盐霉素和自噬抑制剂（3-MA）,分析了自噬对ATG3过表 达抑制盐霉素诱导细胞凋亡的影响。结果成功构建稳定高表达ATG3的MCF-7细胞株。ATG3能够促进MCF-7细胞自噬,并 且抑制AKT/mTOR信号通路。ATG3 明显抑制了盐霉素诱导的细胞凋亡（P<0.01）,且ATG3 过表达组中促凋亡分子cleavedcaspase 3（P<0.01）和Bax表达明显减少（P<0.05）,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增多（P<0.05）。自噬的阻滞能够削弱ATG3对盐霉素 诱导细胞凋亡的抑制作用。结论ATG3可能通过抑制AKT/mTOR信号通路诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬,并通过细胞自噬减 少盐霉素诱导的细胞凋亡。综上提示诱发细胞自噬可能是乳腺癌细胞耐药的机制之一。     

TGF-β1通过促进自噬相关基因Beclin 1表达抑制肝癌细胞增殖

目的：探讨TGF-β1对人肝癌细胞增殖的影响及其与Beclin 1表达的关系.方法：常规培养人肝细胞株L-02和人肝癌细胞株Bel7402,MTT法检测TGF-β1对Bel7402细胞增殖的影响,RT-PCR和Western-blot检测TGF-β1对Bel7402细胞Beclin 1表达的作用.结果：TGF-β1明显抑制了Bel7402细胞的增殖,该作用可被TGF-β1受体阻断剂LY364947解除.Bel7402细胞Beclin 1表达低于L-02细胞,给予TGF-β1后,Bel7402细胞Beclin 1表达明显增加,该作用可被LY364947抑制.结论：TGF-β1抑制肝癌细胞增殖,其机制可能与促进Beclin 1表达有关.     

养肺控瘤方通过Beclin-1促进自噬并抑制肺癌细胞A549转移

目的 研究养肺控瘤方（yangfeikongliu formula,YKF）在肺癌A549细胞自噬和转移中的作用。方法 大鼠的YKF的给药剂量将通过对人体临床的剂量换算后得出,给大鼠灌服人体等效剂量的5倍、10倍和15倍的YKF,并收集它们的血液以制备5×、10×和15×的含药血清。使用含有10%YKF含药血清的培养基对A549细胞进行培养。通过电子显微镜、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ的比例和自噬流串联mRFP-GFP-LC3来评估A549细胞自噬情况。通过Transwell测定法评估细胞迁移和侵袭,并使用CCK-8测定细胞活性。结果 3种剂量YKF含药血清均抑制了肿瘤细胞活性,增加了A549细胞的LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值和p62及Beclin-1表达水平,表明YKF可促进A549细胞自噬死亡。支持本结果的指标为,5×YKF含药血清诱导的LC3点状点的增加在3-MA抑制自噬后被消除。此外,研究观察到沉默Beclin-1可以废除YKF诱导的LC3 Ⅱ/Ⅰ比值和p62表达的增加,以及细胞活性、迁移和侵袭的减少。结论 养肺控瘤方具有促进肺癌细胞A549自噬和抑制转移的抗肿瘤活性,且Beclin-1...     

核外p53通过AMPK/mTOR信号抑制自噬并促进热打击诱导的血管内皮细胞损伤

目的 阐明核外p53通过调控蛋白激酶（AMPK）/雷帕霉素靶体（mTOR）信号通路介导自噬抑制在热打击后血管内皮细胞（VECs）损伤的分子机制。方法 实验分为：对照组、热打击组、热打击组+Compound C组、热打击组+rapamycin组、热打击组+PFT组,并分别使用AMPK抑制剂Compound C、mTOR抑制剂（自噬激活剂）rapamycin、p53线粒体转位抑制剂PFT预处理细胞或C57BL/6小鼠,通过CCK8法检测细胞活力,Western blot观察p53线粒体移位、自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62以及AMPK/mTOR信号通路的激活情况,HE染色观察各组小鼠主动内皮血管病理改变,TUNEL染色观察各组小鼠动内皮血管凋亡情况。结果 与对照组相比,热打击后主动脉内皮细胞（MAECs）活力显著下降（P<0.05）,热打击后小鼠主动脉血管内皮细胞肿胀、脱落,内弹力膜断裂,平滑肌排列紊乱,可见大量凋亡细胞;热打击后随着复温时间（0、3、6、9 h）延长,MAECs胞浆中p53表达逐渐减弱,而线粒体p53表达逐渐增强;热打击后（6 h）LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达被抑制,p62蛋白表达增加（P<0.05）;热打击后（6 h）AMPK的磷酸化被抑制,mTOR、4EBP1和p70S6K的磷酸化表达增加（P<0.05）。AMPK抑制剂Compound C明显抑制了热打击后MAECs中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达,促进了p62蛋白表达,并加重了热打击后小鼠主动脉血管的损伤以及促进了凋亡的增加,而mTOR抑制剂rapamycin均呈现相反作用。p53线粒体转位抑制剂PFT促进了AMPK的磷酸化激活,并抑制mTOR、4EBP1和p70S6K的磷酸化（P<0.05）;使用PFT后促进了LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达,抑制了P62的表达（P<0.05）;使 用PFT后明显提高了MAECs的细胞活力（P<0.05）,也减轻了热打击后小鼠主动脉血管的损伤和凋亡的发生。结论 核外p53主要通过抑制AMPK活性,激活mTOR信号,继而介导细胞自噬抑制,参与热打击诱导的MAECs损伤。     

程氏蠲痹汤通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号轴促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的自噬

目的 研究程氏蠲痹汤（JBT）通过PI3K/Akt/mTOR信号轴调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RA-FLS）自噬的影响及相关机制。方法 实验分为4组：FLS组、FLS+JBT组、FLS+RAPA组、FLS+RAPA+JBT组。CCK8检测程氏蠲痹汤抑制RA-FLS的最佳浓度和时间,透射电镜观察细胞自噬小体的变化,自噬双标腺病毒实验观察细胞内自噬体、自噬溶酶体数量,RT-qPCR和Western blot检测相关指标表达水平。结果 CCK8实验筛选结果表明JBT冻干粉浓度在0.5 mg/mL,培养12 h效果最佳。电镜结果与自噬双标腺病毒实验结果趋势相同,FLS组中自噬体少量存在,JBT加入能显著增加自噬体,自噬溶酶体较少。RT-qPCR结果显示,FLS+RAPA+JBT组较FLS组、FLS+JBT组、FLS+RAPA组相比,PI3K、Akt和mTOR的mRNA水平降低更明显（P<0.01）。WB分析显示,FLS+RAPA+JBT组较FLS组、FLS+JBT组、FLS+RAPA组相比,PI3K、Akt、mTOR蛋白的水平无明显差异（P>0.05）,p-PI3K、p-Akt...     

氯喹抑制的自噬对地西他滨促进髓性白血病细胞凋亡的影响

目的：研究氯喹与地西他滨联合应用对白血病K562和KG-1a1Aor1a细胞凋亡的影响,探讨自噬对地西他滨诱导白血病细胞凋亡的作用,阐明其作用机制。方法：体外培养髓性白血病K562和KG-1a1Aor1a细胞,分为空白对照组、地西他滨（10 μmol·L^-1）单用组和氯喹（50 μmol·L^-1）联用地西他滨组（联用组）。联用组细胞使用氯喹孵育6 h后再与其他组细胞同时开始实验。孵育24及48 h后,CCK-8法检测细胞数量并计算增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位。Q-PCR法检测Atg7及Atg12基因表达水平,Western blotting法检测LC3蛋白表达。结果：孵育24及48 h后,与空白对照组比较,地西他滨和联用组K562和KG-1a1Aor1a细胞数量数量明显减少（P < 0.05或P < 0.01）;凋亡率明显升高（P < 0.05或P < 0.01）,线粒体膜电势明显增加（P < 0.05或P < 0.01）;与地西他滨组比较,联用组K562和KG-1a1Aor1a细胞明显减少,细胞数量凋亡率明显升高（P < 0.05）。孵育24 h后,与空白对照组比较,地西他滨组K562和KG-1a1Aor1a细胞Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达水平明显升高（P < 0.05或P < 0.01）;与地西他滨组比较,联用组K562和KG-1a1Aor1a细胞Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达水平明显降低（P < 0.05或P < 0.01）。结论：地西他滨具有促进白血病细胞凋亡的作用,而联用氯喹可以抑制自噬从而增强地西他滨诱导细胞凋亡的作用。     

NF-κB途径介导硫酸吲哚酚抑制THP-1源性巨噬泡沫细胞SR-B1的表达

目的观察尿毒症毒素硫酸吲哚酚(IS)是否促进巨噬泡沫细胞脂滴的蓄积,以及对细胞内B类1型清道夫受体(SR-B1)表达和核因子NF-κB活化的影响。方法体外佛波酯(PMA)诱导人源单核细胞系THP-1分化为巨噬细胞,加入氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)培养促进巨噬细胞泡沫化,随后以不同浓度的IS干预巨噬泡沫细胞,油红O染色观察细胞内脂滴变化,实时PCR和Western blotting检测SR-B1 m RNA和蛋白表达的水平,ELISA法检测NF-κB活化情况;经NF-κB抑制剂四氢化吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)预处理后IS再干预,实时PCR检测巨噬泡沫细胞内SR-B1 m RNA表达的变化。结果与对照组(IS 0μmol/L)比较,IS干预后巨噬泡沫细胞内脂滴明显增加,随着IS浓度的升高,细胞内脂滴逐渐增加;IS干预后巨噬泡沫细胞的NF-κB活化程度增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,细胞在不同浓度的IS(2.5、25、250μmol/L)处理下,SR-B1 m RNA和蛋白的表达下降,随着IS浓度的增加,SR-B1和蛋白逐渐减少,呈现浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。PDTC预处理后SR-B1m RNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IS抑制SR-B1 m RNA和蛋白的表达,增加THP-1源性巨噬泡沫细胞胆固醇的蓄积,促进巨噬细胞泡沫化,从而促进动脉粥样硬化。NF-κB活化可能是IS抑制SR-B1 m RNA表达的可能机制之一。     

NF-κB途径介导Chemerin抑制THP-1源性巨噬泡沫细胞ABCAl表达和降低胆固醇外流

目的观察脂肪因子Chemerin是否调节胆固醇流出和巨噬泡沫细胞脂滴蓄积,以及对巨噬泡沫细胞ATP结合盒转运子A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)和酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(Acyl-CoA:choles-terol acyltransferase-1,ACAT1)表达和NF-κB活化的影响。方法佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞,随后加入胆固醇和ox-LDL培养促进巨噬细胞转化为巨噬泡沫细胞,免疫荧光染色检测巨噬细胞表面抗原CD68的表达,油红O染色后观察泡沫细胞形态,脂肪因子Chemerin干预巨噬泡沫细胞,应用液体闪烁计数仪检测胆固醇流出变化,油红O染色观察细胞内脂滴变化,实时PCR和Western blot检测ABCA1及ACAT1mR-NA和蛋白表达水平。Sandwich ELISA法检测巨噬泡沫细胞NF-κB活化情况。实时PCR检测NF-κB抑制剂四氢化吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)预处理后,Chemerin再干预时ABCA1表达的变化。结果 Chemerin抑制巨噬细胞内胆固醇流出,促进脂滴蓄积,下调ABCA1mRNA和蛋白的表达,增加NF-κB活化,差异有统计学意义(均P<0.05),且ABCA1mRNA表达与Chemerin浓度呈负相关,r=-0.936(P<0.05),NF-κB活化程度与ABCA1mRNA表达呈负相关,r=-0.917(P<0.05),但Chemerin对ACAT1mRNA和蛋白的表达无明显影响,PDTC预处理能够逆转ABCA1mRNA表达抑制。结论 Chemerin下调ABCA1mRNA和蛋白的表达,抑制THP-1巨噬泡沫细胞内胆固醇外流,增加细胞内脂滴蓄积,NF-κB活化可能是Chemerin抑制ABCA1mRNA表达的信号通路之一。     

化浊解毒方对慢性糜烂性胃炎浊毒内蕴证患者蛋白激酶B及肝细胞生长因子受体表达的影响

目的观察化浊解毒方治疗慢性糜烂性胃炎(CEG)浊毒内蕴证患者的临床疗效,并从治疗前后血清和胃黏膜组织中蛋白激酶B(Akt)、肝细胞生长因子受体(c-Met)表达水平的变化方面探讨化浊解毒方的作用机制。方法采用随机单盲对照临床试验设计,将80例患者随机分为2组,治疗组予化浊解毒方治疗,对照组予阿拉坦五味丸治疗,观察2组患者治疗前后血清及胃黏膜组织中Akt、c-Met的表达水平。结果治疗后,治疗组血清和胃黏膜组织Akt表达水平较对照组明显降低(P0.05),治疗组胃黏膜组织c-Met表达水平较对照组明显降低(P0.05),差异有统计学意义。结论化浊解毒方能显著降低血清及胃黏膜组织中Akt、c-Met的表达水平,其作用机制可能是该方通过调控Akt、c-Met的表达水平及其活性而对CEG产生作用。     

清毒活血化痰复方抑制脐静脉内皮细胞株ECV304氧糖剥夺/复糖复氧模型中NF-κB和STAT3的表达

目的探讨清毒活血化痰复方对脐静脉内皮细胞氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤的保护作用及其作用机制。方法 SD大鼠连续5 d每天灌胃清毒活血化痰复方(12 g/kg),正常对照组给予等量生理盐水,制备药物血清和正常血清。OGD/R损伤脐静脉内皮细胞株ECV304,复氧复糖过程中添加清毒活血化痰复方药物血清,并以正常血清为对照。正常对照组、缺氧缺糖后复氧复糖组(模型组)、清毒活血化痰复方药物血清组(中药组)分别于复氧复糖后4、24、48、72 h提取基因和蛋白用于检测。以MTT法检测细胞存活率,用RT-PCR检测NF-κB和STAT3的mRNA水平,Western blot检测NF-κB和STAT3的蛋白表达。结果清毒活血化痰复方药物血清作用24 h即显现出明显的促ECV304增殖的作用,于48 h时作用最明显。在各个时间段对NF-κB和STAT3的mRNA和蛋白表达均有抑制作用。结论清毒活血化痰复方药物血清可以有效改善OGD/R对脐静脉内皮细胞的损伤,促进细胞增殖,其作用机制可能与抑制NF-κB和STAT3的表达相关。     

右美托咪定通过HMGB1/TLR4/NF-κB抑制肠缺血再灌注诱导的自噬性细胞凋亡

目的:探讨右美托咪定通过HMGB1/TLR4/NF-κB抑制肠缺血再灌注诱导的自噬性细胞凋亡的作用机制.方法:按选取40只健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组、肠缺血再灌注组(I/R组)、小剂量右美托咪定+肠缺血再灌注组(D1组)、中剂量右美托咪定+肠缺血再灌注组(D2组)、大剂量右美托咪定+肠缺血再灌注组(D3组...