PSMAe/p驱动shRNA靶向干扰核干因子治疗前列腺癌的研究

目的 探讨前列腺特异性膜抗原增强子、启动子(PSMAe/p)驱动shRNA靶向干扰核干因子(NS)治疗前列腺癌的有效性和应用前景.方法 免疫组织化学染色观察NS基因在前列腺癌LNCaP细胞和PC-3细胞中的表达 ;利用构建的以poly(A)为终止信号的NS特异性shRNA表达载体pPSMAe/p-shNS-poly(A)转染LNCaP细胞和PC-3细胞 ;观察RNA干扰后细胞体外增殖的变化,检测NS基因水平、细胞周期、细胞凋亡的变化.结果 NS在LNCaP和PC-3细胞中高表达 ;pPSMA-shNS-poly (A)在转染高表达PSMA的LNCaP细胞后NS表达受到抑制,细胞周期受到阻滞,并抑制了细胞的增殖,同时导致细胞发生凋亡 ;而在不表达PSMA的PC-3细胞中NS表达无明显抑制,细胞周期未受到阻滞,细胞凋亡无明显变化.结论 PSMAe/p驱动shRNA靶向干扰NS基因具有细胞特异性 ;NS基因在LNCaP细胞恶性增殖中发挥重要作用,NS可能是前列腺癌基因治疗的理想靶基因之一.     

NuclesteminsiRNA对人肺腺癌紫杉醇耐药株A549／Taxol的耐药性逆转的研究

目的：探讨Nuclestemin基因（NS）特异性RNA干扰对人肺腺癌紫杉醇耐药株A549／Taxol细胞耐药性的逆转作用。方法：NS特异性RNAi表达载体转染A549／Taxol细胞。提取肿瘤细胞总RNA,用RT—PCR方法检测NS的表达;利用M1Tr法检测紫杉醇的半数抑制浓度（IC50）。结果：NS特异性RNAi表达载体转染A549／Taxol细胞后,Ns的表达量明显降低,并且对紫杉醇敏感性的相对逆转率达65．3％。结论：．Nuclestemin基因siRNA能有效逆转A549／Taxol细胞的耐药性,明显提高耐药细胞对紫杉醇的敏感性。     

siRNA抑制RASSF1A表达对Hela细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨RASSF1A基因的特异性小干扰RNA(siRNA)对宫颈癌Hela细胞系生长增殖及凋亡的影响。方法采用LipofectamineTM2000介导的脂质体法将特异性siRNA瞬时转染进Hela细胞,半定量RT-PCR检测转染前后RASSF1A mR-NA表达变化,免疫细胞化学法检测RASSF1A蛋白表达水平变化,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 RT-PCR与免疫细胞化学检测结果显示,转染siRNA后RASSF1A基因的表达下降,细胞增殖加快,而细胞凋亡率则显著降低。结论靶向RASSF1A基因的siRNA可有效降低宫颈癌Hela细胞中该基因的表达,用于RASSF1A基因功能研究;RASSF1A基因表达下调促进细胞增殖,同时导致细胞凋亡减少。     

Nucleostemin基因特异性RNA干扰对HeLa细胞体外增殖能力的影响

目的:研究nucleostemin (简称NS)基因特异性RNA干扰对HeLa细胞的增殖和细胞周期的影响.方法:①将NS特异性siRNA真核表达质粒经脂质体转染导入HeLa细胞,筛选NS阳性转染HeLa细胞克隆,作为silencer组用于实验,对照组为HeLa细胞组,②检测silencer组和对照组细胞生长曲线、细胞增殖率和细胞周期.结果:与对照组相比,Silencer组HeLa细胞增殖速率明显降低,细胞处于G0/G1期明显增多,S期则明显减少,DNA异倍体数量明显降低.结论:NS特异性siRNA真核表达质粒转染的HeLa细胞,其细胞增殖速率受到明显抑制.     

Nucleostemin特异性RNA干扰联合化疗药物对肿瘤细胞增殖抑制作用的体外实验研究

目的：研究Nucleostemin特异性RNA干扰（RNAi）联合4种化疗药物对人食管癌细胞株Eca-109体外增殖的影响。方法：1.用NS特异性RNAi表达载体转染Eca-109细胞。2.实验分组：分为silencer组（S组）、normal组（N组）、单纯用药组和联合用药组。S组为转染NS特异性siRNA表达载体的Eca-109细胞;N组为正常Eca-109细胞;单纯用药组为单纯应用4种化疗药物作用于Eca-109细胞;联合用药组为转染NS特异性RNAi表达载体分别联合4种化疗药物作用于Eca-109细胞。3.利用细胞计数法、镜下细胞形态学观察和MTT法检测各组细胞的增殖情况。结果：联合用药各组增殖速率明显低于单纯用药各组,而增殖抑制率明显高于单纯用药各组,差异具有显著性（p〈0.05）。结论：4种化疗药物与NS特异性RNAi联合对Eca-109细胞都具有一定的协同抑制作用。     

人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定

目的：构建人Smad3的shRNA表达载体，运用RNAi下调Smad3基因在肿瘤细胞系中的表达，观察对肿瘤细胞生长的影响．方法：化学合成针对人smad3基因的dsRNA，瞬时转染入Hela细胞，检测RNA干扰效果，筛选有效干扰靶位点；设计并合成针对人smad3基因的siRNA寡核苷酸链，经退火形成双链后克隆入质粒载体pSilencer^TM3．1-H1hygro，转染入Hela细胞，用hygromycinB筛选稳定单克隆细胞株，对细胞株行RT-PCR和Western Blot检测，观察siRNA对靶基因的抑制效果，进一步研究下调目的分子表达水平以后肿瘤细胞生长的变化．结果：瞬时转染筛选到了有效的RNA干扰靶位点，构建载体后，建立稳定转染的单克隆细胞株，smad3mRNA和蛋白质水平均显著下调，导致肿瘤细胞生长抑制．结论：成功构建了针对人Smad3高效、特异、作用持久的shRNA表达载体，转染细胞后可下调Smad3的表达，为进一步研究smad3的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础．     

胃癌组织和SGC-7901细胞中nucleostemin基因表达的实验研究

目的检测nucleostemin(NS)基因在胃癌组织和胃癌SGC-7901细胞中的表达情况。方法21例胃癌手术标本,提取胃癌组织和胃癌SGC-7901细胞株总RNA,用半定量RT-PCR方法检测胃癌组织和SGC-7901中NS基因的表达情况。用脂质体法将PCDNA4/C-NS-silencer质粒及空载体PCDNA4/C-vector质粒分别转染SGC-7901细胞,分别命名为silencer组和vector组,未转染的SGC-7901细胞记为normal组,RT-PCR方法检测NS基因表达量。用MTT法检测3组细胞的生长增殖情况。结果胃癌组织和SGC-7901细胞中皆有NS基因表达。定性分析显示,与vector组和normal组比较,silencer组细胞趋于分化,NS基因表达量下降。细胞培养24 h、48 h、72 h后,si-lencer组和vector组细胞增殖抑制率间差别均有统计学意义(P<0.01)。结论胃癌组织和SGC-7901细胞中有NS基因表达;NS基因特异性RNA干扰使NS基因表达量下降,抑制SGC-7901细胞株体外增殖。     

RNA干扰HPV E6下调eIF4E转录表达抑制宫颈癌Hela细胞增殖并影响细胞周期进程研究

目的探讨宫颈癌Hella细胞中干扰HPV E6对eIF4E表达的调控,探寻HPV E6促癌的新途径,为宫颈癌诊断和治疗提供新靶点。方法构建高效的靶向HPV18 E6的shRNA质粒(shE6)并测序,而后转染人宫颈癌Hela细胞,荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率。而后以Real-time PCR检测E6及eIF4E的mRNA水平,采用CCK-8法检测Hela细胞增殖能力的改变,流式细胞术检测细胞周期。结果测序结果显示成功构建shE6质粒。shE6-3转染人宫颈癌Hela细胞后48 h,E6及eIF4E mRNA表达的抑制率分别约为80%,76%。shE6-3对Hela细胞的增殖活性在48 h的抑制效果最明显,增殖抑制率约为21%;相对于NC组,shE6组G0/G1期细胞比例显著增高,而S期比例减少,G2/M期未见明显变化。结论 RNA干扰HPV E6能够下调eIF4E转录表达,抑制宫颈癌Hela细胞增殖,并阻滞细胞周期于G0/G1期。eIF4E有望成为宫颈癌防治的潜在靶点。     

核干细胞因子在肿瘤细胞中的差异表达及意义

目的: 通过检测核干细胞因子(Nucleostemin,NS)基因在多种肿瘤细胞中的差异表达情况,探讨NS基因与肿瘤细胞增殖调控的相关性。方法: 体外培养子宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、乳腺导管癌细胞、肝癌细胞(SMCC-7721)、肝癌细胞(HpeG2)与正常肝细胞,提取对数生长期肿瘤细胞总RNA,以RT-PCR方法检测NS在mRNA水平的差异表达;提取肿瘤细胞的总蛋白,以Western blot方法检测NS在翻译水平的差异表达。结果: 肿瘤细胞中NS基因均有较高水平的表达,尤其以乳腺癌细胞、乳腺导管癌细胞、肝癌细胞(SMCC-7721)与肝癌细胞(HepG2)中NS基因表达量为最高,而正常肝细胞未检测到NS的表达。结论: NS在肿瘤细胞中的高表达具有普遍性,而在终末分化的细胞中不表达,判断NS基因参与了肿瘤细胞的增殖调控,其为肿瘤的基因治疗和基因诊断提供了一个新的途径和指标。     

In vitro study of Nucleostemin gene as a potential therapeutic target for human lung carcinoma

Objective Nucleostemin (NS) is a GTP-conjugated protein located in the nucleoli of stem cells and some cancer cells,and maintains cell self-renewal.We aimed to evaluate NS as a potential target for lung carcinoma gene therapy by investigating NS gene expression and its effect on A549 cell proliferation.Methods NS mRNA and protein expression in A549,HepG2,SMMC-7721,HeLa,and U251 cells was analyzed by RT-PCR and western blotting following transfection of NS siRNAs and negative control siRNA (NC).The effect on cell proliferation was also analyzed by MTT assays.Results NS mRNA and protein were both expressed in A549 cells and four other tumor cell lines; the relative expression levels were similar in all five cell lines.The three pairs of NS siRNA,either transfected alone or cotransfected into A549 cells,could effectively inhibit the expression of NS mRNA and protein.Moreover,the interference ratio showed an obvious concentration-dependent relationship.NS siRNA treatment resulted in significant inhibition of A549 cell proliferation by 35.7％.Conclusion NS gene was not only highly expressed but also played an important role in A549 cell proliferation.Thus,targeting of NS may be a promising novel strategy for the treatment of lung carcinoma.     

Bmi-1 siRNA对宫颈癌Hela细胞体外增殖能力的影响

[目的]观察siRNA沉默Bmi-1表达对Hela细胞增殖能力的影响。[方法]构建了表达Bmi-1 siRNA的重组真核表达载体,将其转染入Hela细胞,利用荧光法观察转染效率。用RT-PCR及Western blot方法检测转染后细胞Bmi-1 mRNA及Bmi-1蛋白的表达情况;用MTT比色法、台盼蓝拒染法检测Bmi-1 siRNA对Hela细胞增殖的抑制作用;用流式细胞仪分析各组细胞的细胞周期;用平板克隆形成实验检测Bmi-1 siRNA对Hela细胞的单细胞增殖能力的影响;应用免疫细胞化学(SP法)及Western blot法检测各组细胞Ki-67及CyclinD1的表达。[结果]将构建好的重组质粒成功转染进入了Hela细胞中且转染效率在90%左右;Bmi-1 siRNA转染Hela细胞Bmi-1 mRNA及Bmi-1蛋白表达沉默,Bmi-1表达沉默后抑制Hela细胞增殖并使细胞周期阻滞于G0-G1期,能明显抑制Hela细胞的单细胞增殖能力;同时Ki-67及CyclinD1的表达均明显下降。[结论]siRNA介导的Bmi-1基因的表达沉默能抑制Hela细胞的增殖能力,Bmi-1表达可能与宫颈癌的发生发展相关。     

体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响。方法应用实时定量PCR方法检测七株胃癌细胞株中REG4基因的mRNA表达。针对REG4基因设计三条小干扰RNA片段(siRNA1、siRNA2、siRNA3),瞬时转染高表达胃癌细胞株。用RT-PCR方法检测转染后REG4基因的mRNA表达水平、MTT法检测细胞增殖能力、AnnexinV-PI法检测细胞凋亡水平。结果以永生化正常胃粘膜细胞株GES-1作为参照。MKN-45和AGS胃癌细胞株中REG4表达水平升高200倍以上,遂选用AGS细胞进行RNA干扰。RT-PCR结果证实siRNA2、siRNA3均有干扰效果,尤以siRNA3效果明显。选用siRNA3干扰AGS细胞株,MTT实验结果证实干扰AGS后,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。AnnexinV-PI实验结果显示细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论干扰REG4基因具有抑制胃癌细胞增殖、促进凋亡的作用,REG4基因可能成为胃癌基因靶向治疗的新靶点。     

下调MCT1表达抑制宫颈癌Hela细胞增殖并促进其凋亡

［摘要］ 目的探讨下调单羧酸转运蛋白1(monocarboxylate transporter 1,MCT1)表达对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响及其机制。 方法将体外培养的Hela细胞分为未转染组、阴性对照组和MCT1-siRNA组,Western blot检测Hela细胞中MCT1、Bcl-2和Bax蛋白表达水平,MTT法检测Hela细胞增殖活力,流式细胞仪检测Hela细胞周期分布和凋亡率。 结果与未转染组比较,阴性对照组Hela细胞中MCT1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平和细胞增殖、周期分布以及细胞凋亡率差异均无统计学意义（P＞0.05）,MCT1-siRNA组细胞中MCT1和Bcl-2蛋白表达水平、细胞增殖活力和细胞在S期所占百分比均明显降低,Bax蛋白表达水平、细胞在G0/G1期所占百分比和细胞凋亡率均明显升高（P＜0.05）。 结论下调MCT1表达可通过诱导细胞周期阻滞抑制Hela细胞增殖,并通过上调Bax和下调Bcl-2蛋白表达促进Hela细胞凋亡。     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体,感染HPV16阳性宫颈癌细胞,筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体,脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,收集病毒上清,感染靶细胞SiHa,G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达,细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,病毒感染靶细胞SiHa后,筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆,RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达,HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

NS基因克隆及人成骨肉瘤细胞和人胚胎肾细胞NS基因的表达

目的：研究nucleostemin(核干细胞因子，NS)基因在人成骨肉瘤细胞(0S-732)和人胚胎肾细胞(HEK-293)的表达情况，井克隆该基因的部分片段。方法：以0S-732细胞和HEK-293细胞为实验材料，进行细胞总RNA的提取、反转录反应、PCR反应、NS基因片段的克隆及测序等。结果：(1)提取的总RNA质量很高，基本上无降解；(2)0S-732细胞和HEK-293细胞中均有NS基因的表达，并且在相同量底物的情况下，0S-732细胞NS基因的表达量明显高于HEK-293细胞；(3)将PCR产物成功地与pGEM-T克隆载体连接，构建为FGEM-T-NS质粒，测序结果表明NS基因片段序列与基因库中登陆的序列完全一致。结论：本成功地从0S-732细胞和HEK-293细胞克隆到NS基因片段，0S-732细胞NS基因的表达量明显高于HEK-293细胞。     

siRNA沉默MACC1基因表达对宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨siRNA沉默结肠癌转移相关基因1(MACC1)表达对Hela宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响。方法通过脂质体将siRNA MACC1及siRNA NC转入Hela细胞中,RT-PCR及western blot检测转染效果,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,Transwell法检测细胞侵袭能力,western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、cyclin E,基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9蛋白表达及细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平。结果与siRNA NC组比较,siRNA MACC1组中MACC1蛋白及mRNA表达量降低(P0.01),细胞活力及侵袭能力下降(P0.01),细胞周期阻滞在G1期,cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9及p-ERK表达量下调(P0.01)。结论siRNA MACC1能显著的抑制宫颈癌Hela细胞增殖与侵袭,可能与下调ERK磷酸化水平有关。