小鼠肝细胞的简易高效高纯培养及鉴定

目的改进一种简易、高效的乳小鼠肝细胞培养法,并对所培养的细胞进行鉴定。方法原代培养采用改进的组织块贴壁方法,以少量培养基孵育1~2h。传代培养采用0·25%胰蛋白酶消化随后以小牛血清培养为单层细胞。整个过程无需离心。结果成功地用这种简便的方法获得了纯度较高的肝细胞并进行了传代和鉴定。结论使用此方法培养肝细胞简单、高效、快捷,适合大多数实验室培养非大规模肝细胞。     

新生小鼠大脑皮质神经细胞体外培养方法及鉴定

目的 探索用24 h内新生C57BL/6小鼠大脑皮质进行神经细胞体外培养的方法.方法 取出生24 h内新生C57BL/6小鼠大脑皮质,胰蛋白酶消化,等体积的基础培养基终止消化,机械性吹打通过细胞过滤器获得单细胞悬液,接种细胞,24 h后更换无血清培养基,每3～4 d半量换液.神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)抗体免疫组化方法鉴定神经细胞的纯度.结果 细胞在培养12 h后开始贴壁,24 h开始分化生长成梭形.大部分神经细胞于第2天长出突起,第3天神经细胞间形成复杂的联系,第7天神经细胞发育基本成熟.经NSE鉴定,培养细胞中神经细胞纯度可达90%以上.结论 无血清体外原代神经细胞培养法简便易行,相对于有血清培养法具有较大的优越性.     

人牙周膜成纤维细胞的细胞培养技术

目的人牙周膜成纤维细胞的细胞培养技术两种方法的比较。方法采用组织块法和酶消化法进行人牙周膜成纤维细胞的原代培养,绘制PDLFs的生长曲线。用Envision免疫组化方法进行细胞来源的鉴定。结论组织块培养方法更适合PDLFs的原代培养。     

不同原代培养方法培养人牙髓细胞的研究

目的：比较并建立一种操作简单方便的人牙髓细胞原代培养方法。方法：选择因正畸拔除的完整无龋双尖牙,无菌条件下取出牙髓,分别采用组织块法、酶消化法和改良组织块法进行人牙髓细胞的体外原代培养,比较观察三种不同培养方法的成活率、细胞形态和数量,测定生长曲线并进行细胞来源鉴定。结果：三种方法均可从人牙髓组织分离培养获得外胚间充质来源的牙髓细胞,呈成纤维细胞样,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性。组织块法耗时较长,培养成功率26.7%;酶消化法培养成活率较低,且细胞数量较少,培养成功率仅为13.3%;在改良组织块法中未发现有漂浮的组织块,培养成活率较高为80%。结论：改良组织块法解决了传统组织块法中组织块难以贴壁的问题,简化了操作步骤并具有较高的成功率,是一种科学可行的人牙髓细胞原代培养方法。     

视神经星状胶质细胞的培养

目的：探索建立视神经星状胶质细胞培养的最佳方法,观察该细胞体外水解酶表达情况。方法：分别取不同年龄WISTAR大鼠（出生4d、7d、成年）的视神经,利用胰蛋白酶加EDTA、胶原酶、木瓜酶、胰蛋白酶加胶原酶等不同方法消化。分别接种在0．2％明胶、鼠尾胶、多聚赖氨酸包被的培养瓶中,进行原代培养,观察细胞生长状况。利用免疫组化鉴定分离培养的细胞。连续传代观察其衰老情况。利用水解空斑法观察其水解酶表达。结果：几种方法均可见细胞生长,年龄4、7d大鼠视神经要比成年大鼠视神经胶质细胞培养成功率高,利用胰蛋白酶与胶原酶混合消化要比其他消化方法细胞损失小。速度快,细胞成活率高。培养细胞呈典型星状胶质细胞形态,GAFP呈阳性。常规3d传代一次,可传代40次。胶质细胞在蛋白膜上可形成明显的水解空斑。结论：利用胰蛋白酶与胶原酶混合消化法,从新生鼠取材,可成功培养视神经星状胶质细胞,体外可传代40代。该细胞在体外可分泌蛋白水解酶。     

人脐静脉内皮细胞的培养观察与鉴定

目的探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养、观察及鉴定方法,建立人血管内皮细胞的培养模型,为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法采用终浓度为0．125%胰蛋白酶+0．01% EDTA或0．1%Ⅱ型胶原酶消化、分离脐静脉内皮细胞进行培养,以0．25%胰蛋白酶进行消化传代,并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果原代培养的内皮细胞在接种后约1h开始贴壁生长,5～7d融合成单层。光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列；免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应；电镜下可见胞浆巾有W-P小体,证实培养的细胞为内皮细胞。结论用酶灌注消化法消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

人胚半月板细胞的优化获取及生物学特性研究

目的 研究作为半月板组织工程应用的纤维软骨细胞的改良酶消化培养法及原代细胞与传代细胞的生物学差异。方法 在胰酶消化的基础上,采用胶原酶阶段消化法消化解离8个月人胚半月板中的纤维软骨细胞,并与胶原酶一次消化法所得的细胞进行对比,同时进行原代培养和传代培养,观察细胞存活率、生长曲线、形态学改变、细胞周期并进行酸性糖胺多糖染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定。结果 胶原酶阶段消化法所得细胞的存活率高于一次消化法;原代细胞贴壁时间和潜伏期较传代细胞长;细胞于第4代即呈现老化趋势。结论 半月板采用胶原酶阶段消化法可减少酶对细胞的毒性,得到细胞活力较高的纤维软骨细胞,原代细胞贴壁时间和潜伏期较长,第2、3代细胞适于作为组织工程用种子细胞。     

酶消化联合玻片覆盖组织块法用于牙龈上皮细胞原代培养的研究

目的探讨一种快速、便捷、成功率高的牙龈上皮细胞原代培养的方法。方法通过细胞形态观察、免疫组化等方法对比单纯dispase酶消化、玻片覆盖组织块法、dispase酶消化联合玻片覆盖组织块法进行牙龈上皮细胞原代培养的成功率。结果酶消化联合玻片覆盖组织块法原代培养成功率高，细胞成铺路石样生长；单纯酶消化法原代培养成功率低，仅见少量散在细胞；单纯玻片覆盖组织块法成纤维污染严重，成功率仅为30％。结论dispase酶消化联合玻片覆盖组织块法可显著提高牙龈上皮细胞原代培养的成功率。     

大鼠脑皮质星形胶质细胞的原代培养、纯化及采用HCA技术进行GFAP鉴定

目的探索大鼠脑皮质星形胶质细胞(astrocyte,AS)的分离、原代培养及纯化方法,采用高内涵细胞成像分析技术(high content analysis,HCA)对其进行胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定。方法取2、3 d的新生SD大鼠,体视显微镜下获取大脑皮质,机械分离成1 mm3组织碎块,采用质量分数为0.25%的胰蛋白酶和0.2%的胶原酶(体积比为1∶1)消化后进行体外培养,分别观察接种1 h、3 d、5 d后原代AS基本形态结构,酶消化3 min后,接种30 min,5 d后传代AS基本形态结构;采用多次、多阶段的差速贴壁和震荡相结合的方法纯化细胞;采用HCA技术对AS进行GFAP免疫细胞化学鉴定。结果采用本法培养的大鼠脑皮质星形胶质细胞,数量多、活性佳、纯度高,胞突丰富且细长,并相互交织成网,呈现典型而良好的生长状态;经本法纯化后的星形胶质细胞,细胞纯度明显提高;经HCA技术进行GFAP鉴定,AS纯度质量分数达98%以上,且图片质量佳。结论建立了一种大鼠脑皮质星形胶质细胞原代培养及纯化方法,采用高内涵细胞成像分析技术进行GFAP鉴定的图片质量明显优于传统方法,该技术值得推广和应用。     

胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养软骨细胞的分析

目的 通过原代软骨细胞的体外培养和鉴定,探讨胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养软骨细胞的可行性.方法 分离出兔鼻中隔软骨组织,用胰酶联合Ⅱ型胶原酶的方法进行消化,获取原代软骨细胞.使用倒置显微镜观察软骨细胞的形态及生长情况,并用甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化及免疫荧光染色进行表型鉴定.结果 软骨细胞原代培养形成单层细胞需要7～8d,传代培养时间约2～3 d,细胞以圆形或类上皮细胞形态为主,甲苯胺蓝染色证实细胞可特异性合成糖胺聚糖,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及免疫荧光染色可证实细胞可特异性分泌Ⅱ型胶原.结论 本研究成功建立了简单易行的胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养大量纯净的软骨细胞,提高了消化速率,加大了细胞释放率,为组织工程气管软骨种子细胞的获取提供重要的技术支撑.     

脑膜瘤恶性程度与活化的信号转导转录活化因子3蛋白质抑制剂表达的关系

目的探讨脑膜瘤恶性程度与活化的信号转导转录活化因子3蛋白质抑制剂（PIAS3）表达的关系。方法72例不同恶性程度脑膜瘤组织标本及13例正常脑组织手术标本,提取总RNA,应用实时荧光定量PCR技术检测PIAS3在不同恶性程度脑膜瘤组织和正常脑组织中的表达,并进行比较。结果PIAS3在正常脑组织中表达很低,在脑膜瘤组织中表达均明显升高,两者之间差异有统计学意义（P〈0．01）。PIAS3在脑膜瘤Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级组织中表达水平差异有统计学意义（P〈0．05）,但Ⅱ级和Ⅲ级之间差异无统计学意义（P〉0．05）;在侵袭性脑膜瘤组织中PIAS3的表达与浸润程度之间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论PIAS3在脑膜瘤组织中高表达,可能与脑膜瘤的发生、发展密切相关。     

脑膜瘤雄激素受体表达与细胞增殖和临床病理的关系

目的　探讨脑膜瘤雄激素受体 (AR)表达与肿瘤细胞增殖和临床病理的关系。方法　采用SABC免疫组织化学方法检测 5 0例脑膜瘤组织中AR和增殖细胞核抗原 (PCNA)的表达 ,分析其与临床病理的关系。结果　良性、非典型性、恶性脑膜瘤组织中AR阳性表达率分别为 2 9 2 % (8/ 2 4 )、5 6 3% (9/ 16 )、80 0 % (8/ 10 )。恶性脑膜瘤AR阳性表达率显著高于非典型性和良性脑膜瘤 (P <0 0 5 )。AR阳性脑膜瘤PCNA标记指数 (LI)显著高于AR阴性脑膜瘤 (P <0 0 1) ,脑膜瘤AR表达与PCNA表达呈正相关。结论　AR过度表达与脑膜瘤细胞的异常增殖和病理级别有关 ,在脑膜瘤的发生发展过程中起重要作用     

脑膜瘤孕激素受体检测与米非司酮的抗肿瘤作用及相关性初探

目的 寻找和开发治疗脑膜瘤的有效药物。方法 应用裸鼠肾包膜下法建立人脑膜瘤动物模型。采用三种不同剂量的米非司酮在动物模型建立后皮下注射用药，28天后将各组间肿瘤生长率作统计学分析。原始标本用免疫组化SP法检测孕激素受体（PR）。结果 中剂量组和高剂量组与对照组之间有显著性差异（P＜0．01），低剂量组与对照组之间无显著性差异（P＞0．05）。7例标本经免疫组化检测，4例PR阳性，但米非司酮对PR阴性组与PR阳性组的作用差异不显著（P＞0．05）。结论 米非司酮对人脑膜瘤有明显的生长抑制作用，可能是通过阻断PR或其他受体而抑制了脑膜瘤细胞的增殖。     

脑膜瘤中survivin表达和微血管密度关系的研究

目的探讨survivin在脑膜瘤中的表达及与肿瘤血管生成的关系。方法采用免疫组织化学方法检测在不同级别脑膜瘤中survivin蛋白的表达与微血管密度的表达情况。结果在脑膜瘤中,survivin蛋白表达阳性率56.6%(30/53),并随分级增高表现为逐级增高的趋势,脑膜瘤Ⅱ级与脑膜瘤Ⅰ级相比,χ2=8.873,P<0.01,脑膜瘤Ⅲ级与脑膜瘤Ⅰ级相比,χ2=11.793,P<0.01,但脑膜瘤Ⅲ级与Ⅱ级相比,χ2=2.365,P>0.05,差异不具有显著性。MVD在脑膜瘤Ⅰ级中计数为(18.98±8.34),Ⅱ级中计数为(26.48±10.35),Ⅲ级中计数为(38.91±12.95),呈逐级增高趋势,MVD在不同级别脑膜瘤中的表达值具有显著差异。survivin蛋白表达阴性组的MVD(16.34±6.72)值明显低于survivin表达阳性组(30.07±11.55),经检验具有显著性差异(P<0.01)。结论 survivin的高表达可能参与脑膜瘤的发生、发展及微血管的新生,故可作为评价脑膜瘤生物学行为的指标之一。     

人子宫内膜间质细胞的分离培养方法

目的改进正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位和异位内膜间质细胞原代和传代培养的方法 ,以使其可作为的体外实验模型之一。方法在原代分离细胞、传代培养条件和细胞纯化等方面对子宫内膜间质细胞原代培养的方法作了改进。结果 43例标本培养成功37例,仅1例污染,角蛋白、波形蛋白染色证实细胞纯度达95%以上符合实验要求。结论改进后的子宫内膜间质细胞原代培养法克服了污染问题,增加了可获得的细胞数,子宫内膜间质细胞的分离、培养可作为子宫内膜异位症的体外实验模型之一。     

鞍结节脑膜瘤的显微手术治疗探讨

目的探讨鞍结节脑膜瘤的显微手术治疗。方法 2008年3月至2010年12月采用显微手术治疗鞍结节脑膜瘤患者38例进行总结。结果 38例鞍结节脑膜瘤,获全切除35例(92.10%),次全切除3例(7.90%)。术后恢复良好者31例,优良率为81.57%;中度残废5例;重度残废2例。结论鞍结节脑膜瘤的显微手术治疗正确选择手术入路,充分囊内切除肿瘤,小心分离肿瘤与周围组织,术中注意视神经及重要血管的保护,能达到良好的临床效果。     

Meningiomas: clinical correlates, skull x-ray, CT and pathological evaluations

OBJECTIVE: To assess the frequency and the diagnostic performance of plain skull x-ray and and CT of meningiomas. METHODS: All pathologically diagnosed intracranial meningiomas in patients seen at Tikur Anbessa Hospitals were reviewed. RESULTS: Between December 1999 and July 2004 there were 25 histologically diagnosed cases of meningioma at the Tikur Anbessa Hospital (TAH). The duration of symptoms was ranging from 0.5-10 yrs. (mean 2.4 +/- 2.1 yrs) and age ranging from 21-57 yrs (mean age of 49.3 +/- 10 yrs.) with M:F ratio of 1.2:1. Blurring of vision was the commonest clinical presentation. Clinical correlates, skull x-rays, computerized tomographic results and pathology are evaluated. Plain skull x-ray findings were normal in 12/23 (52%); 10/23(43%) of the cases had non-specific sellar changes of raised intra-cranial pressure. Twenty-three of the 25 meningiomas had CT scanning done, and CT diagnosed 17/23 (74%) meningiomas correctly. Two meningiomas were unusual in location: one was intranasal and the other was intra-ventricular. Parasellar tumors were frequent sites of misdiagnosis. The commonest locations were parasellar and cerebral convexity, each accounting for 6/25 (24%) of the cases. The commonest CT observation was intense and homogeneous enhancement 15/23 (65%). Meningothelial meningioma was the commonest cellular type accounting for 11/25 (46%) of the pathologies followed by the transitional 4/25 (16%) and the atypical and psammomatous types, each with equalfrequency, 3/25 (12%). CONCLUSION: CT scan had a diagnostic accuracy of 83%, sensitivity of 74%, specificity of 95%, positive predictive value (PPV) of 95%, and negative predictive value (NPV) of 75%. Statistical analysis verifies the pre-operative reliability for diagnosing meningiomas by CT scanning.     

The impact of progesterone receptor expression on relapse in the long-term clinical course of 93 benign meningiomas

BACKGROUND: Previous clinicopathological observations have pointed towards an impact of progesterone receptor (PgR) expression on the clinical course of meningiomas. MATERIALS AND METHODS: EXpression of PgR and the proliferation marker MIB-1 was assessed by immunohistochemistry in the primary tumours of 30 cases of benign, completely resected, recurrent meningiomas and compared with 63 cases of meningioma without recurrence for 14 or more years. RESULTS: Univariate analysis showed a significantly higher risk for recurrence (odds ratio 3.533) for tumours with a low expression of PgR. A tendency for a higher risk for tumours with higher proliferation rate (odds ratio 6.889) was not significant. In 20 cases in which the primary tumour could be compared with its recurrence, no consistent changes of PgR expression were observed. CONCLUSION: Our findings support previous studies that found an association of low or absent expression of PgR with a higher risk of recurrence. This encourages attempts at a hormonal therapy for patients with PgR-positive meningioma.     

Primary cultures of human urothelial cells for genotoxicity testing

A cell culture system with human-derived urothelial cells was established based upon previous experience with cultures of porcine urinary bladder epithelial cells. Human tissue specimens used were derived from urinary bladders (n = 17) or ureters (n = 50) of patients undergoing urological operations. The epithelial origin and differentiation status was evaluated by an immunohistochemical staining for cytokeratins 7, 8, 18, 19, and 20 for isolated and cultured cells. Specimens from human ureters were better suited for primary cell cultures of the urothelium than specimens from human urinary bladders. Successful attachment and proliferation were reached by 98% of the ureter specimens (urinary bladder: 71%) and confluency was reached by 78% of the ureter cultures (urinary bladder: 18%). In the first 14 d of culture the cytokeratin patterns of cultured cells were comparable to those of native mucosa cells. During prolonged cell culture the cytokeratin patterns of the human urothelial cells (HUC) changed into a beginning dedifferentiation: Cytokeratin (CK) 18 was only detectable in cell cultures cultured for more than 29 d, whereas CK 19 was not detectable at d 29. Cell cultures of primary human urothelial cells may be used for in vitro testing of cytotoxic or genotoxic effects.