瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库构建和质量分析对筛选和克隆瘢痕疙瘩相关基因的意义

目的:构建瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆瘢痕疙瘩特异表达的基因奠定基础。方法:实验于2003-09/2004-08在南方医科大学基因工程研究所完成。从同一标本的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织分离poly(A)+RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交方法,通过两轮杂交和两次抑制聚合酶链反应构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果:挑取了84个克隆进行聚合酶链反应扩增检测是否有插入片段,结果显示71个克隆有插入片段,其中45个克隆片段大小范围为200～750bp,符合预期的文库构建要求。结论:应用消减杂交的方法,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的瘢痕疙瘩cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选瘢痕疙瘩发生相关基因群和克隆瘢痕疙瘩特异表达基因奠定了基础,为创伤临床康复治疗提供理论依据。     

狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

目的:采用抑制性消减杂交技术构建汉族人狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库。方法:选择2005-08/10南方医科大学南方医院中医科收治的狼疮性肾炎肾阳虚证患者5例,另选择与上述年龄相匹配的健康正常人5名作为正常对照组。狼疮性肾炎肾阳虚证患者组和正常对照组进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART(Switch Mechanism At 5 end of RNATemplate)技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建狼疮性肾炎肾阳虚证消减文库。结果:TRIzol一步法抽提的总RNA纯度高(A260/A280nmnm>1.90),用SMART技术扩增微量RNA,扩增产物双链cDNA主要分布在0.5～10kb,基因组cDNA经RsaI内切酶酶切后片段主要集中在200～2000bp。用抑制性消减杂交方法筛选出了狼疮性肾炎肾阳虚证的差异cDNA片段,得到了480个白色克隆,再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了狼疮性肾炎肾阳虚证的cDNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆狼疮性肾炎肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的：构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法：采用新近建立的抑制消减杂交方法，哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料，分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T／A连接构建文库，将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选。随机挑取100个白色克隆用茵落PCR进行鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色阳性克隆，随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增，90％的克隆中均有200～600bp的插入片段，这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论：用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库，该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

构建中国汉族人亚健康状态肾阴虚证的DNA消减文库

目的:采用抑制性消减杂交技术构建汉族人亚健康状态肾阴虚证DNA消减文库。方法:实验于2004-02在南方医科大学南方医院糖尿病分子实验室完成。样本来源于南方医科大学南方医院汉族亚健康且中医辨证为肾阴虚证的患者1例及健康自愿者1名作为其对照组。用硅胶法抽提血白细胞DNA,用RsaI酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建亚健康肾阴虚证DNA消减文库。结果:用抑制性消减杂交方法筛选出了亚健康肾阴虚证的差异DNA片段,得到680个白色克隆,随机调取96个白色克隆,再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒91个,从而成功地构建了亚健康肾阴虚证的DNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建亚健康肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆亚健康肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

构建中国汉族人亚健康状态肾阴虚证的DNA消减文库

目的：采用抑制性消减杂交技术构建汉族人亚健康状态肾阴虚证DNA消减文库。方法：实验于2004—02在南方医科大学南方医院糖尿病分子实验室完成。样本来源于南方医科大学南方医院汉族亚健康且中医辨证为肾阴虚证的患者1例及健康自愿者1名作为其对照组。用硅胶法抽提血白细胞DNA，用RsaⅠ酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将聚合酶链反应产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建亚健康肾阴虚证DNA消减文库。结果：用抑制性消减杂交方法筛选出了亚健康肾阴虚证的差异DNA片段，得到680个白色克隆，随机调取96个白色克隆，再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒91个，从而成功地构建了亚健康肾阴虚证的DNA消减文库。结论：抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建亚健康肾阴虚证DNA消减文库，为进一步筛选和克隆亚健康肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证的相关基因文库

目的:运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证DNA消减文库,为制定2型糖尿病的一、二级康复预防提供理论参考。方法:选择2004-08南方医科大学南方医院内分泌科就诊的汉族2型糖尿病患者1例,符合中医肾虚证诊断标准中关于典型肾阴虚证的诊断,肝肾功能正常,无急慢性感染。以同时期、同性别、年龄相当的自愿者1名作为正常人对照。参照Maxim方法采用硅胶法抽提2例观察对象血白细胞DNA,用RsaI酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U/A载体连接,经蓝白斑筛选及菌液聚合酶链反应筛选出阳性重组质粒,构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库。测定抽提基因组DNA的纯度及含量;基因组DNARsaI酶切产物;消减杂交产物扩增结果;蓝白斑筛选阳性克隆;聚合酶链反应方法筛选重组质粒。结果:用抑制性消减杂交技术筛选出了糖尿病肾阴虚证的差异DNA片段,基因组DNA经过RasI酶切消化后,所得DNA片段主要集中在200～2000bp;消减杂交产物经两次聚合酶链反应扩增后,产物明显增多,内含数条隐约可见的条带,主要集中在0.2～1.5kb;蓝白斑α互补筛选出含有外源插入片段的阳性克隆,结果正向消减杂交产物得到286个克隆,反向消减杂交产物得到262个克隆;随机挑取92个阳性克隆,经聚合酶链反应分析证实86个克隆的质粒内均载有差异性DNA片段,大小为200～1000bp,从而成功构建了糖尿病肾阴虚证特异的DNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆糖尿病肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交技术构建汉族人狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库。方法：选择2005—08／10南方医科大学南方医院中医科收治的狼疮性肾炎肾阳虚证患者5例，另选择与上述年龄相匹配的健康正常人5名作为正常对照组。狼疮性肾炎肾阳虚证患者组和正常对照组进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA，用SMART（Switch Mechanism At 5 end of RNA Template）技术逆转录并扩增总cDNA，用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将聚合酶链反应产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建狼疮性肾炎肾阳虚证消减文库。结果：TRIzol一步法抽提的总RNA纯度高（A260nm/A280nm。〉1．90），用SMART技术扩增微量RNA，扩增产物双链cDNA主要分布在0．5～10kb，基因组cDNA经RsaI内切酶酶切后片段主要集中在200～2000bp。用抑制性消减杂交方法筛选出了狼疮性肾炎肾阳虚证的差异cDNA片段，得到了480个白色克隆，再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了狼疮性肾炎肾阳虚证的cDNA消减文库。结论：抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆狼疮性肾炎肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

胎儿间充质干细胞cDNA扣除文库的构建

为了获得胎儿和成人间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC)的差异表达基因，尤其是在胎儿MSC中特异表达的基因，应用抑制扣除杂交技术构建了胎儿和成人MSC cDNA扣除库。首先，分别从胎儿和成人MSC中提取总RNA，按照SMART PCR方法依次合成单链和双链cDNA，经Rsa I酶切后，胎儿MSC cDNA分别与两种不同的接头连接，再与成人MSC cDNA经过两次扣除杂交及两轮抑制性PCR扩增后，将产物与T载体连接构建成cDNA扣除库，并转染大肠杆菌进行库扩增。结果：库扩增后共取得890个克隆，对所获得的克隆进行PCR扩增鉴定，获得768个阳性克隆，阳性率为86．3％。插入片段大小分布在0.2-1kb，平均为400－600bp。结论：抑制扣除杂交技术是一种简便、有效的筛选差异表达基因的方法。胎儿MSC cDNA扣除库的构建为进一步筛选、克隆胎儿MSC中特异性表达的功能相关基因奠定了基础。     

运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证的相关基因文库

目的：运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证DNA消减文库，为制定2型糖尿病的一、二级康复预防提供理论参考。方法：选择2004—08南方医科大学南方医院内分泌科就诊的汉族2型糖尿病患者1例．符合中医肾虚证诊断标准中关于典型肾阴虚证的诊断，肝肾功能正常，无急慢性感染。以同时期、同性别、年龄相当的自愿者1名作为正常人对照。参照Maxim方法采用硅胶法抽提2例观察对象血白细胞DNA，用RsaⅠ酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将聚合酶链反应产物与U／A载体连接，经蓝白斑筛选及菌液聚合酶链反应筛选出阳性重组质粒，构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库。测定抽提基因组DNA的纯度及含量；基因组DNARsaⅠ酶切产物；消减杂交产物扩增结果；蓝白斑筛选阳性克隆；聚合酶链反应方法筛选重组质粒。结果：用抑制性消减杂交技术筛选出了糖尿病肾阴虚证的差异DNA片段．基因组DNA经过RasⅠ酶切消化后．所得DNA片段主要集中在200～2000bp；消减杂交产物经两次聚合酶链反应扩增后，产物明显增多，内含数条隐约可见的条带．主要集中在0．2～1．5kb；蓝白斑q互补筛选出含有外源插入片段的阳性克隆，结果正向消减杂交产物得到286个克隆．反向消减杂交产物得到262个克隆；随机挑取92个阳性克隆，经聚合酶链反应分析证实86个克隆的质粒内均载有差异性DNA片段，大小为200～1000bp，从而成功构建了糖尿病肾阴虚证特异的DNA消减文库。结论：抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库，为进一步筛选和克隆糖尿病肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因文库的构建和筛选

目的克隆和分离儿童急性淋巴细胞白血病（ ALL）差异表达基因，探讨小儿白血病的发病机制。方法 Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，抽取mRNA，逆转录成cDNA；经RsaⅠ酶切，实验组cD-NA被分成两组，分别与两种不同的接头连接后，与对照组cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链反应（ PCR），提取、纯化PCR产物，与PT-Adv载体连接构建cDNA消减文库，利用PCR扩增、测序和同源性分析差异表达的序列。结果选取文库中60个克隆进行菌落PCR分析，可以检出大小为200～600 bp的插入片段。从中随机挑选20个克隆进行测序、生物信息学分析，其中18个克隆与已知基因有高度序列同源性，符合率为98％～100％，共编码17种基因。这些基因大多涉及基因表达调控、DNA损伤修复、细胞周期、物质代谢等，均与细胞增殖、分化有关。此外发现2个新基因。结论本实验表明我们已成功构建小儿ALL相关消减cDNA文库，为小儿ALL发病机制的研究奠定了基础。     

人瘢痕疙瘩成纤维细胞IKKβ特异性siRNA的筛选和载体构建

背景:近年来的研究表明核转录因子k B通过调控多种基因的表达,参与细胞生长、发育、凋亡等多种生理功能,并在细胞恶性转化、纤维化等方面起重要作用.核转录因子k B抑制蛋白激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)β是核转录因子k B 激活通路中的关键激酶,被抑制后可以阻断核转录因子k B的活化过程,通过siRNA干扰沉默IKKβ基因,下调核转录因子k B.目的:体外合成并筛选人瘢痕疙瘩成纤维细胞特异性IKK β-siRNA,并构建其表达载体.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2008-04/2008-10在解放军广州军区总医院中心实验室完成.材料:细胞来源为珠江医院整形外科25～40岁患者切除的瘢痕疙瘩标本,患者知情同意.方法:化学合成3条IKKβ.siRNA,分别转染体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,采用反转录-聚合酶链反应技术检测所合成的SiRNA对IKKβ表达的抑制,筛选出特异性IKKβ-siRNA,并采用PU6质粒构建载体.主要观察指标:①RT-Q-PCR检测结果.②载体基因连接产物酶切鉴定.③重组质粒测序鉴定.结果:经实时定量反转录-聚合酶链反应检测,合成的3条IKKβ-siRNA链中,IKKβ-siRNA-2有明显抑制IKKβmRNA表达的作用,IKKβ-siRNA-1、IKKβ-siRNA-3干扰效果不明显.并通过酶切鉴定和测序结果证明成功构建IKKβ-siRNA载体.结论:应用反转录-聚合酶链反应可筛选出针对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的特异性IKK β-siRNA=可构建具有干扰效果的IKKβ-siRNA表达载体.     

Lin-CD34-与Lin-CD34+细胞差异表达基因的鉴定

目的 克隆并鉴定Lin^-CD34^-细胞区别于Lin^-CD34^ 细胞的可能与其性状相关的基因。方法 以uLin^-CD34^-细胞作为检测对象，Lin^-CD34 细胞作为驱动细胞，应用抑制消减杂交技术构建Lin^-CD34^-细胞的cDNA消减库。选取部分克隆测序，测序结果与GenBank进行同源性比较和功能分析。结果 共获得593个含有插入片段的克隆，片段的长度为300～500bp。随机选取53条EST进行测序，其中37条EST代表了10个已知基因，其余16条EST。代表了4个未知序列。结论 利用抑制消减杂交技术鉴定出部分Lin^-CD34^-细胞特异表达的基因，可能与Lin^-CD34^-细胞的特性相关。     

人直肠腺癌消减杂交差异片段的生物信息学分析

目的 探测人真肠腺癌发生和发展过程中差异表达的基因片段，了解人直肠腺癌的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术，获得人直肠癌差异表达的基因，用生物信息学cDNA库筛选的方法，对人直肠腺癌cDNA消减库中的差异基因片段的序列作预测和分析。结果 用抑制性消减杂交技术随机挑取获得的阳性克隆，提取质粒，双本科切分析，进行序列测定，得到与直肠腺癌发病相关的差异基因片段-9cDNA（Genbank登录号为BM360862），用cDNA库筛选得到一个全长cDNA序列。基因表达系列分析（SAGE）显示除了直肠腺癌外、9cDNA还分布于前列腺腺癌、脑干成神经管细胞瘤、胰腺腺癌、胚胎正常血管内皮细胞、脑室管细胞瘤。结论 直肠腺癌的发病是多环节和多一步研究，将为了解直肠腺癌发病的特异相关基因奠定基础。     

人T-bet基因的体外扩增及克隆和鉴定

目的:克隆人T-bet基因,构建其真核表达载体pEGFP-C1-T-bet。方法:实验于2005-07/2006-07在北京大学深圳医院中心实验室完成。①根据Genebank的人T-bet基因的全长cDNA序列,设计合成一对附加BglⅡ和SalⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②分离人外周血单个核细胞,提取RNA,用反转录-聚合酶链反应方法将T-bet的编码序列cDNA扩增,装入pMD18-T载体并送去测序。③BglⅡ SalⅠ双酶切质粒pMD18-T-bet,经琼脂糖电泳切胶回收T-bet片段,将T-bet插入载体pEGFP-C1构建成重组真核表达载体pEGFP-C1-T-bet。④用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果:①反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为1608bp的特异性扩增带。②测序结果证实,T-bet的编码序列和Genbank中T-bet mRNA序列相同。③双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论:实验成功扩增出人T-bet基因,构建了基因重组真核表达载体pEGFP-C1-T-bet,为探索T-bet基因对免疫细胞的调节作用和肿瘤基因治疗奠定了基础。     

MicroRNAs在瘢痕疙瘩中的差异表达

背景:瘢痕疙瘩的形成受多种基因、细胞因子的调控,然而目前对这些基因、细胞因子的调控表达机制的研究尚不明确。目的:通过检测人正常皮肤组织和人瘢痕疙瘩组织中microRNAs的表达情况,初步筛选人瘢痕疙瘩microRNAs表达谱。方法:根据瘢痕疙瘩临床诊断标准及实验要求制定瘢痕疙瘩、正常皮肤病例纳入标准和排除标准,收集瘢痕疙瘩标本(6例)和正常皮肤标本(5例);TRIZOL法提取标本的总RNAs并进行质检,再采用Ambion’s miRNA Isolation Kit从总RNAs中分离microRNAs;荧光标记后与微阵列芯片杂交,扫描检测后数据经SAM和Cluster分析处理,筛选瘢痕疙瘩组织中microRNA差异表达谱。采用实时荧光定量RT-PCR技术验证在瘢痕疙瘩组织中均存在显著差异表达的microRNAs。结果与结论:通过microRNA微阵列芯片筛选得到人瘢痕疙microRNAs差异表达谱(筛选出显著差异表达microRNAs12个),与正常皮肤组织比较,microRNAs在瘢痕疙瘩组织中表达下调。提示瘢痕疙瘩microRNAs差异表达可能参与瘢痕疙瘩的发生发展过程,部分microRNAs有可能成为用于瘢痕疙瘩诊治的专有分子标志物。     

内皮差异表达基因消减文库的构建及在创伤修复中的应用

目的：建立人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因的消减cDNA文库。方法：提取培养人脐静脉内皮细胞内毒素刺激6h后mRNAs，反转录合成cDNA，与对照组间进行抑制消减杂交富集差异表达基因，亚克隆入T／A质粒并转化感受态大肠杆菌。结果：成功构建了人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后上调和下调差异表达基因两个消减cDNA文库，为进一步筛选新的内皮细胞活化相关基因打下基础。结论：经抑制消减杂交建立的消减cDNA文库富集并均一化了内毒素刺激后不同丰度的差异表达基因，对深入理解内皮细胞活化机制及参与组织修复的过程具有重要意义。     

内皮差异表达基因消减文库的构建及在创伤修复中的应用

目的建立人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因的消减cDNA文库.方法提取培养人脐静脉内皮细胞内毒素刺激6 h后mRNAs,反转录合成cDNA,与对照组间进行抑制消减杂交富集差异表达基因,亚克隆入T/A质粒并转化感受态大肠杆菌.结果成功构建了人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后上调和下调差异表达基因两个消减cDNA文库,为进一步筛选新的内皮细胞活化相关基因打下基础.结论经抑制消减杂交建立的消减cDNA文库富集并均一化了内毒素刺激后不同丰度的差异表达基因,对深入理解内皮细胞活化机制及参与组织修复的过程具有重要意义.     

无瘢痕愈合中核糖体蛋白s29基因表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用

目的探讨核糖体蛋白s29基因(RPs29gene)表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用。方法采用抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)方法筛选并克隆鼠胚皮肤特异表达的RPs29基因cDNA片段。应用PCR技术扩增RPs29基因ORF全长,构建真核重组表达载体pcDNA3.1/RPs29,体外转染成鼠皮肤成纤维细胞,观察细胞形态结构改变,免疫组织化学方法、RT-PCR分析外源基因表达情况。结果RPs29基因在成纤维细胞中表达,细胞增生能力降低,凋亡加剧。结论核糖体蛋白s29基因表达产物能抑制成纤维细胞增生,促进细胞凋亡,为无瘢痕愈合的研究提供实验材料及实验依据。     

人直肠腺癌消减杂交差异片段的生物信息学分析

目的探测人直肠腺癌发生和发展过程中差异表达的基因片段,了解人直肠腺癌的分子生物学机制。方法应用抑制性消减杂交技术,获得人直肠腺癌差异表达的基因,用生物信息学cDNA文库筛选的方法,对人直肠腺癌cDNA消减文库中的差异基因片段的序列作预测和分析。结果用抑制性消减杂交技术随机挑取获得的阳性克隆,提取质粒,双酶切分析,进行序列测定,得到与直肠腺癌发病相关的差异基因片段-9cDNA(Genbank登录号为BM360862),用cDNA文库筛选得到一个全长cDNA序列。基因表达系列分析(SAGE)显示除了直肠腺癌外、9cDNA还分布于前列腺腺癌、脑干成神经管细胞瘤、胰腺腺癌、胚胎正常血管内皮细胞、脑室管细胞瘤。结论直肠腺癌的发病是多环节和多步骤的过程,9cDNA与直肠腺癌发病相关,对9cDNA基因差异片段进一步研究,将为了解直肠腺癌发病的特异相关基因奠定基础。     

胎兔皮肤创伤消减文库构建与瘢痕愈合基因的初步筛选

目的:许多哺乳动物的胎儿在妊娠期前2/3内皮肤创伤为无瘢痕愈合,其发生机制至今尚不完全清楚。应用抑制性消减杂交获得差异表达的片段并构建消减文库,为差异基因的筛选及可能出现的未知基因的功能研究提供前期铺垫。方法:选择孕20d的胎兔及孕兔分别在腰部做全层皮肤切口,12h后取材作为胎兔创伤(fetaltrauma,FT)、胎兔对照(fetalcontrol,FC)和成兔创伤(adulttrauma,AT)。提取总RNA,合成dscDNA,经RsaⅠ酶切、Adaptor连接,两次杂交及两次抑制性PCR可获得差异性表达的片段。将扩增产物插入T载体并转染工程菌,培养后挑选阳性克隆。结果:经逐步验证获得61个较为可靠的阳性克隆。结论:设计并应用改良的SSH(2Drivers)替代传统的SSH,经实验证实在理论及实际操作上均可行且合理。消减文库的构建对无瘢痕愈合相关基因及其功能的后续研究提供了可靠的材料。