基因组DNA高通量提取技术及其在骨髓库捐献者样本HLA基因分型中的应用

本研究旨在建立从全血EDTA抗凝样本中高通量提取基因组DNA的有效方法,以常规应用于Luminex rSSO HLA流式磁珠基因分型。使用2ml深孔板和TECAN DNA全自动工作站,从288份骨髓捐献者样本中提取基因组DNA提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性;DNA样本用One lambda rSSO HLA—A、B和DRB1基因分型试剂盒进行PCR扩增、分子杂交和Luminex流式磁珠分析仪检测,统计分析每一DNA样本HLA—A、B和DRB1基因扩增产物经DNA探针分子杂交后的阳性磁珠和阴性磁珠的荧光信号强度。结果表明：从400μl全血中提取了基因组DNA,288份样本的DNA产量平均为3．217±0．715μg,A260／A280值平均为1．710±0．103,A260-A320／A280-A320值平均为1．761±0．151;用琼脂糖凝胶电泳法测得DNA的分子量均大于15kb;每一样本mA—A、-B和-DRB1杂交后的阳性磁珠的荧光信号强度均〉600RFU,而阴性磁珠的荧光信号强度〈50RFU。结论：本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得的基因组DNA适用于高通量中华骨髓捐献者样本的HLA流式磁珠基因分型等下游的移植免疫学与分子生物学实验。     

全自动提取大量全血样本基因组DNA方法的建立及其在HLA基因分型中的应用

目的研究和建立从大量全血样本中提取基因组DNA的有效方法,以应用于Luminex HLA流式磁珠基因分型。方法使用自动工作站(瑞士TECAN公司)提取基因组DNA,提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,DNA的完整性用琼脂糖电泳检测,并统计分析每一DNA样本流式磁珠HLA-A、B和DRB1基因扩增产物经探针分子杂交后的荧光信号强度。结果从60μl全血中提取基因组DNA,产量平均为(1.584±0.824)μg,样本的A260/A280值平均为1.741±0.229。琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb。结论本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得基因组DNA适用于高通量HLA流式磁珠基因分型等下游的分子生物学实验。     

全自动提取大量全血样本基因组DNA方法的建立及其在HLA基因分型中的应用

目的 研究和建立从大量全血样本中提取基因组DNA的有效方法,以应用于Luminex HLA 流式磁珠基因分型.方法 使用自动工作站(瑞士TECAN公司)提取基因组DNA,提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,DNA的完整性用琼脂糖电泳检测,并统计分析每一DNA样本流式磁珠HLA-A、B和DRB1基因扩增产物经探针分子杂交后的荧光信号强度.结果 从60μl全血中提取基因组DNA,产量平均为(1.584±0.824)μg,样本的A260/A280值平均为1.741±0.229.琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb.结论 本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得基因组DNA适用于高通量HLA流式磁珠基因分型等下游的分子生物学实验.     

自动工作站提取基因组DNA方法的建立及其在HLA基因分型中的应用

目的研究和建立从大量全血标本中提取基因组DNA的有效方法,以应用于Luminex HLA流式磁珠基因分型。方法使用自动工作站(瑞士TECAN公司)从600μl全血中提取基因组DNA,提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,DNA的完整性用琼脂糖凝胶电泳检测,并统计分析每一DNA样本流式磁珠HLA-A,B和DRB1基因扩增产物经探针分子杂交后的荧光信号强度。结果从600μl全血中提取基因组DNA,含量平均为10.052±0.824μg,样本的A260nm/A280nm值平均为1.821±0.201。琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb,HLA-A,B和DRB1位点PCR产物杂交后的平均荧光信号强度分别为2 183.84±478.12(exon2),2 168.28±338.59(exon3);2 057.27±397.41(exon2),1959.78±283.24(exon3);3 643.38±327.85。结论此方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得基因组DNA适用于高通量HLA流式磁珠基因分型等下游的分子生物学实验。     

HLA基因分型方法进展

人类主要组织相容性系统又称人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）系统，位于6号染色体（6p21.31）短臂上，长约4000kb，由一系列紧密连锁的基因座组成，是迄今为止所知的人类最复杂的遗传系统。现已在此遗传系统中确定了224个基因位点，等位基因数目达1500个，主要包括参与T细胞抗原提呈和与HLA相关的非功能性基因，     

改良盐酸胍法提取脐血DNA 用于HLA基因分型

为了比较经典的盐酸胍(Gu·HCl)抽提DNA法和改良盐酸胍抽提DNA法在提取脐血DNA的效果,探讨这两种方法在脐血组织相溶性抗原(HLA)基因分型中的应用,使用盐酸胍抽提DNA法和改良盐酸胍抽提DNA法提取72例脐血标本的DNA,并分别测定其DNA的浓度和纯度,采用序列特异性引物聚合酶反应方法(PCRSSP)比较这两种方法所提取的DNA.结果表明两种方法提取脐血DNA均获成功;根据对DNA的质量监测发现,用改良盐酸胍抽提DNA在质量上较盐酸胍法好;用于HLA基因分型时,改良盐酸胍抽提DNA法可减少非特异性条带的出现.结论改良盐酸胍抽提DNA法不但操作简便,成本下降,而且在最少血量中能提取出高纯度的DNA,减少非特异性条带的出现.该法完全可以满足脐血库的日常脐血样品DNA的提取以及脐血HLA基因分型的要求.     

PCR-SSP在HLA基因分型中的常见问题

目的通过对序列特异引物引导的聚合酶链反应(PCR-SSP)在人类白细胞抗原(HLA)基因分型中常见问题的分析和总结,提出解决措施,以提高HLA基因的分型质量和效率。方法对武警总医院院内2007~2009年1 298例标本的HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQ基因分型中出现的问题进行总结分析。结果 1 298例标本中,1 236例可以直接判读结果,一次检出成功率为95.22%;62例标本无法直接判读出结果,在这62例出现问题的标本中无反应条带标本8例(12.90%)、阳性条带弱反应标本21例(33.87%)、漏检标本9例(14.52%)、假阳性及非特异性条带标本24例(38.71%)。结论 HLA基因分型中的常见问题的主要原因:抗凝剂使用不当、蛋白质污染、DNA的浓度过高、Taq酶的含量、加样后扩增板的放置时间等。这些主要是人为因素造成的,是可以找到原因并且避免的。     

HLA基因分型在亲子鉴定中的应用1例分析

笔者在1例二联体亲子鉴定案件中,应用常规的短串联重复序列（short tandem repeat,STR）方法无法确定亲子关系,但在加做了人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）基因分型后可以得出排除的确切结论,现报告如下。     

DNA工作站在HLA测序分型中的应用

目的 建立从全血样本中高通量提取基因组DNA的方法,以应用于HLA常规测序分型.方法 采用DNA工作站及2 ml深孔板,从400份全血样本中提取基因组DNA.用紫外分光光度仪测定其浓度和A<,260>/A<,280>值,并采用琼脂糖电泳检测DNA的完整性.扩增产物经纯化后作为测序模板,产物经酒精/EDTA/NaOAc法纯化,用ABI Prism<'TM>3730测序仪电泳检测.相关的分析软件分析HLA基因型.结果 使用400μL全血中400份样本的DNA产量平均为(3.217±0.715)μg,A<,260>/A<,280>值平均为1.710±0.103;琼脂糖电泳表明DNA的分子量均大于15×10<'3>;HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1座位序列碱基峰高均在2000以上,测序评分在75分以上.48份HLA-A、B和DRB1基因型已知的室内质控样本,经本文的方法提取DNA并进行HLA基因分型,经盲检质控检测,所得到的结果与已知的HLA基因型相一致.结论 采用本方法所提取的DNA能稳定、可靠地应用于骨髓捐献者样本的HLA-A、B和DRB1座位测序分型,具有快速、高通量化的特点和广泛的应用前景.     

骨髓移植HLA基因分型程度探讨

自20世纪90年代末期起,HLA基因分型技术日趋成熟.由于HLA基因分型方法比传统的HLA血清学分型方法准确,故已取代后者并被广泛用于骨髓移植中的HLA分型.根据HLA基因分型的精细程度,一般被分为低分辨分型和高分辨分型两种.低分辨分型是指被鉴定的等位基因相当于HLA抗原分解物(split)水平,即通常所说的HLA亚型(即组基因).在WHO基因命名中,HLA亚型相当于星号后2位数的水平.高分辨分型是指精确到核苷酸顺序水平,即WHO命名的星号后4位数.     

HLA基因测序分型技术的应用

[目的]对在骨髓库HLA基因分型和器官移植配型等工作中，应用PCR—SSP、PCR—SSO等方法不能确定结果的疑难标本进行测序，确认分型结果，寻找、发现新基因。[方法]测序方法采用双脱氧链终止法，引入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链终止剂。[结果]对标本直接进行测序能够得到确切的HLA基因分型结果；对PCR—SSP、PCR—SSO等方法不能确定HLA基因分型结果的疑难标本进行测序，得到可靠的确认分型结果。[结论]HLA测序分型结果精确可靠，是HLA基因分型的金标准，能发现新基因。     

HLA基因分型方法学进展

ＨＬＡ基因分型方法学进展５１８０２０深圳市血站杨春森ＨＬＡ复合体由一组紧密连锁的复等位基因组成，具有高度的多态性。ＨＬＡ－Ａ座位有５９个、Ｂ座位有１２６个、Ｃ座位有３９个、Ｄ座位有约２８０个等位基因，ＨＬＡ－Ⅱ类基因区至少有３６个基因座位，因此总共至...     

HLA命名和Ⅱ类基因分型

<正> 1991年11月在日本横滨召开了第11届国际组织相容性讨论会,会后世界卫生组织HLA系统因子命名委员会重新修改了HLA命名;另一方面,HLAⅡ类的基因分型方法已有重大进展。现就这两方面的内容介绍如下。     

HLA分型基因微阵列的构建

目的建立HLA分型基因微阵列,并与聚合酶联反应-序列特异性引物(PCR-SSP)和聚合酶联反应-序列特异性寡核苷酸(PCR-SSO),及DNA测序(SBT)进行方法学比对。方法基于反向SSO原理设计引物和探针,其依据的原理和主要步骤为:1)PCR扩增;2)DNA杂交;3)酶联染色;4)结果判断。以此构建HLA-B27分型基因微阵列系统,并检测88例标本,将分型结果与PCR-SSO、PCR-SSP及SBT三种方法验证结果进行比对。结果成功构建了HLA-B27分型基因微阵列。与PCR-SSO、PCR-SSP及SBT方法相比总体一致率为98.86%;HLA-B27阳性标本结果的一致率为97.72%(86/88);HLA-B27阴性标本结果的一致率为100%(4/4)。结论与目前常用的PCR-SSO,PCR-SSP及SBT等方法相比,HLA-B27分型基因微阵列具有高效、快速、稳定等特点,为临床检测HLA-B27提供一种新方法。     

HLA区域微卫星DNA及其应用

近年来，ＨＬＡ区域微卫星ＤＮＡ日益受到科学工作者的重视，特别是ＨＬＡ区域微卫星标记在群体遗传学以及骨髓移植中的基因相容性方面的应用前景更是引人注目。本文拟就ＨＬＡ区域微卫星ＤＮＡ的分子和遗传特征，可能的进化机制以及在ＨＬＡ相关领域中的不同应用情况及应用前景作一综述。     

单倍体相同供受者HLA—DNA配型及临床意义

以人类组织相容性抗原（ＨＬＡ）的ＤＱβ片段ｃＤＮＡ作为探针，用４种限制性内切酶（ＭＳＰＩ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｔａｑ Ｉ和Ｐｓｔ Ｉ）对６对单倍体相同的活体肾移植供受者进行ＤＮＡ配型。结果发现ＨＬＡ－ＤＮＡ分型比血清学配型更高频率地表现其特异性，４种酶中ＥｃｏＲＩ的分型尤与肾移植存活率相关。混合淋巴细胞培养结果也与ＥｃｏＲＩ分型相近。     

五种HLA低分辨率基因分型试剂的对比分析

目的：比较五种HLA低分辨率分型试剂的检测效果。方法：用五种HLA分型试剂分别检测7份标准品，分析比较各种试剂的检测结果。结果：五种分型试剂基因检出率均为100％，无漏检。分辨率较好，均能达到低分辨率的要求。但试剂A和D特异性略低于其它试剂。结论：储备两种分型试剂以弥补彼此的不足。     

分子生物学技术在HLA分型中的应用

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA)是人体重要的免疫遗传体系，在免疫反应和造血干细胞与器官移植中发挥着重要的作用，现代医学的发展和器官移植配型要求的提高，促进了分子生物学与HLA分型的结合，提高了分型的准确性及实用性。本综述了限制性处长度多态性，序列特异性寡核苷酸探针，单链构象多态性，序列特异性引物，流式细胞术，基因芯片，以碱基序列为的HLA分型中的应用及虚拟DNA分析的进展。     

人类白细胞抗原基因分型与微珠反应格局

背景:Flow-rSSO结合流式细胞分析技术和PCR-SSO技术的高通量分型方法,是目前国外人类白细胞抗原分型中应用最多的方法.目的:筛选同组不同等位基因之间的微珠反应格局,加强人类白细胞抗原基因分型方法的标准化,使分型向最快最准确的方向发展.方法:使用TECAN DNA全自动工作站从457份中华骨髓库捐献者全血样本中提取基因组DNA,DNA样本用One LambdarSSO HLA-A、B和DRB1基因分型高分试剂盒进行PCR扩增、分子杂交和Luminex流式磁珠分析仪检测.参考0ne Lambda公司提供等位基因微珠格局表(HLA-A,B and DRB1)分析常见等位基因,并对常见等位基因与微珠的相关性进行研究.结果与结论:同一组常见等位基因除相同微珠反应格局外,与某个或某几个有区别的微珠是密切相关的.就临床组织器官移植而言,采用中分辨度DNA分型技术是最佳选择,一方面有利于快速筛选,另一方面能够降低匹配难度.就科研工作而言,一般采用高分辨率分型方法.