TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌katG基因突变

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测结核分枝杆菌katG基因突变的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法 根据结核分枝杆菌katG基因主要发生315位点突变的特点,设计一对特异性TaqMan-MGB探针和引物,通过反应条件优化,建立荧光定量PCR方法;用克隆到PMD18-T载体上katG基因阳性标准品及不同菌株来评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果 灵敏度高,检测目的基因的最低检测下限10copies/μl,比常规PCR灵敏高100倍;特异性高,检测16株非结核分枝杆菌标准株和7种常见呼吸道感染细菌的标准株均为阴性;与测序法相比,野生型和突变型探针的敏感性和特异性均为100%。重复性好,批内批间CT值变异系数均小于1%。结论：TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速检测结核杆菌菌株katG 315位点突变。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌TaqMan荧光PCR检测的建立

目的对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别建立荧光PCR快速检测方法。结核分枝杆菌荧光PCR对H37Rv标准菌株、结核分枝杆菌临床分离株的检测结果呈典型阳性反应，牛分枝杆菌荧光PCR对牛分枝杆菌标准菌株、BCG菌株的检测结果呈典型阳性反应，对其它分枝杆菌菌株以及常见微生物样品为阴性反应。两种荧光PCR对对应阳性重组质粒模板的检测灵敏度可达单个基因拷贝，对结核分枝杆菌或BCG标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞。对临床样品的检测结果显示，荧光PCR对模拟感染奶样、血样的检测灵敏度可达单个菌细胞。所建立的方法，全过程包括血样、奶样、痰液等临床样品的前处理、核酸提取和荧光PCR检测，可在5～6h内完成。采用上述荧光PCR方法从临床采集的疑似病人痰液中检出多份结核分枝杆菌阳性样品。     

巢式实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌DNA的临床应用

目的探讨巢式实时荧光定量PCR（QNRT-PCR）检测结核分枝杆菌（MTB）DNA的临床价值。方法应用SYBR Green I建立检测结核分枝杆菌MTP64基因的QNRT—PCR方法,分别检测24份肺结核患者痰液,27份结核性胸膜炎患者胸水,以及对照组75份痰液和胸水的MTBDNA含量。结果以培养为金标准,QNRT—PCR敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）分别为95．83％、61．54％、69．70％和94．12％,结核性胸膜炎的阳性率为70．37％。三种PCR方法阳性率比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR拷贝数配对检验差异没有统计学意义（P〉0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR的Cr值配对检验差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论QNRT—PCR方法可检测痰液和胸水MTB DNA,对含微量MTB DNA样本的高敏感性在结核病的早期诊断中有重要参考价值。     

实时定量PCR技术检测结核分枝杆菌蛋白编码基因表达水平研究

目的运用实时定量PCR(qRT-PCR)检测66株结核分枝杆菌蛋白编码基因(fbpB,psts1,mpt64)的表达水平,探讨结核分枝杆菌耐药菌株与敏感菌株,北京基因型菌株与非北京基因型菌株的蛋白抗原在转录水平的差异。方法根据GenBank提供的序列,设计特异性引物,扩增目的基因片段,克隆入载体,重组质粒经纯化及梯度稀释,应用qRT-PCR检测基因的表达水平。结果北京基因型菌株psts1基因表达水平与非北京基因型菌株比较差异有统计学意义(t=3.721,P<0.01);耐药菌株mpt64基因表达水平与敏感菌株比较差异有统计学意义(t=3.951,P<0.01)。结核分枝杆菌活菌的扩增曲线呈典型的S型,结核分枝杆菌死菌和非结核分枝杆菌呈水平直线,未检测到荧光信号。结论北京基因型结核分枝杆菌psts1基因的表达量低于非北京基因型,结核分枝杆菌耐药菌株mpt64基因的表达量低于敏感株。     

利用荧光定量RT-PCR和PCR方法检测结核分枝杆菌复合群

目的建立一种新的检测结核分枝杆菌复合群的荧光定量试验方法(R/P分析),探讨R/P分析检测临床标本中结核分枝杆菌复合群的应用价值。方法根据结核分枝杆菌复合群基因保守序列设计引物和探针构建质粒标准品。运用R/P分析检测54例确诊结核病人临床样本,检测的结果同时与培养法、荧光定量PCR法进行比较。结果不同临床标本用R/P分析诊断结核病,其敏感性高于荧光定量PCR法和培养法,阳性检出率分别为96.3%、83.3%和55.6%。结论 R/P方法是一种快速、特异的直接检测方法,它可以区分结核分枝杆菌复合群的死菌与活菌,因此可以更好的指导医生进行治疗,更准确地做出公共卫生决策。     

二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测临床标本结核分枝杆菌DNA

目的比较二聚体蝎型探针荧光定量PCR与抗酸染色、L-J培养法、结核分枝杆菌直接试验（MTD）的检出率、检测时间等，探讨二聚体蝎型探针荧光定量PCR检测临床标本中结核分枝杆菌DNA（T＆DNA）的实际应用价值。方法以建立的结核二聚体蝎型探针荧光定量PCR方法为基础，对43例结核确诊患者的标本及11例非肺结核患者的痰标本进行检测，并与抗酸染色、L-J培养法、结核分枝杆菌直接试验（MTD）进行比较。结果二聚体蝎型探针荧光定量PCR能快速准确的检测临床标本中的TB-DNA。其标准品浓度在10^2～10^6copies／μl时，方法能够保持良好的线性关系（相关系数为0．9994），阳性检出率（100％）显著高于抗酸染色法（16．28％）和培养法（37．21％）的检出率，与MTD试验的检出率（100％）一致。MTD试验检测时间约4～5h，而二聚体蝎型探针FQ-PCR检测约需80min即可得到检测结果，检测费用仅为MTD的1／4。结论二聚体蝎型探针荧光定量PCR用于临床标本结核分枝杆菌DNA的检测具有快速价廉、敏感特异的特点，该方法作为定量检测结核分枝杆菌的分子诊断新途径值得临床推广应用。     

中国异烟肼耐药结核分枝杆菌基因突变特征分析

目的: 明确中国异烟肼(INH)耐药结核分枝杆菌基因突变的分子特征。方法: 在PubMed、中国知网、万方、维普数据库中检索有关中国结核分枝杆菌耐INH基因突变的研究文献,对纳入文献的突变基因的突变位点、突变类型,以及氨基酸改变数量等信息进行整合分析。结果: 共纳入69篇中英文文献,共6393株INH耐药结核分枝杆菌。95.71%(6119/6393)检测到基因突变或缺失,其中katG、inhA、aphC突变数量最多,分别占77.57%(4959/6393)、15.20%(972/6393)、3.69%(236/6393)。单基因单位点突变占87.80%(5613/6393),联合突变占12.20%(780/6393)。katG315突变占INH耐药菌株总数的56.22%(3594/6393),katG463突变占10.03%(641/6393),inhA15突变占10.10%(646/6393)。突变形式最常见的是C→T,占10.03%(641/6393)。结论:中国INH耐药结核分枝杆菌突变基因最多的是katG、inhA、ahpC,突变密码子最多的是katG315、katG463、inhA15。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌-DNA对肺结核的诊断价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应法（FQ-PCR）检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中结核分枝杆菌-DNA（TB-DNA）对肺结核的诊断价值。方法肺结核52例（菌阳20例,菌阴32例）,肺炎35例,采用FQ—PCR法检测其支气管肺泡灌洗液中TB—DNA水平。结果52例肺结核组的阳性率为65．4％（菌阳19例,菌阴15例）,35例非肺结核组的阳性率为5．7％,经统计学比较,FQ-PCR法检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和培养法（P均〈0．05）,FQ-PCR法特异性高。结论FQ-PCR法检测BALF中TB-DNA为痰涂片阴性及无痰患者提供良好的诊断依据。     

实时定量PCR检测耐异烟肼结核分枝杆菌Ag85B、38kDa及MPT64 mRNA表达水平

目的运用实时定量PCR（Real-time PCR）检测结核分枝杆菌耐异烟肼菌株和敏感株Ag85B、38kDa及MPT64编码基因（fbpB、psts1、mpt64）的mRNA表达水平,探讨结核分枝杆菌耐异烟肼株和敏感株的蛋白抗原在转录水平的差异性。方法根据GenBank提供的序列,设计目的基因fbpB、psts1、mpt64及内参基因Sigа的特异引物,将fbpB、psts1、mpt64及Sigа扩增片段克隆入载体pMD18-T simple,重组质粒经纯化及倍比稀释,应用SYBR GreenⅠ荧光染料建立检测fbpB、psts1、mpt64的实时定量PCR方法,并应用此方法检测22株耐异烟肼菌株及25株敏感菌株（含H37Rv标准株）中fbpB、psts1、mpt64的mRNA表达水平。结果耐异烟肼菌株的fbpB表达水平为0.65±0.22,敏感菌株的表达水平为0.36±0.13,两者有显著性差异（t=5.683,P〈0.01）。耐异烟肼菌株的psts表达水平为13.63±4.16,敏感菌株的表达水平为9.86±2.79,两者差异有统计学意义（t=3.869,P〈0.01）。耐异烟肼菌株的mpt64表达水平为5.89±3.22,敏感菌株的表达水平为7.67±4.52,差异无统计学意义（t=1.552,P〉0.05）。结论成功建立了fbpB、psts1、mpt64基因的实时定量检测方法,检测显示耐异烟肼菌株的fbpB、psts1基因的mRNA表达水平显著高于敏感菌株,可能为耐异烟肼MTB的实验室诊断提供分子标识。     

结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术诊断艾滋病患者肺结核的临床应用评价

目的:探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测(Xpert MTB/RIF)技术诊断艾滋病患者肺结核的应用价值。方法:回顾性分析2017年7月至2019年11月上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心收治的226例疑似肺结核的艾滋病患者的临床资料。分别进行痰涂片荧光染色显微镜下检查、BACTEC MGIT 960液体培养(或罗氏固体培养)和Xpert MTB/RIF检测,并分析在艾滋病患者中Xpert MTB/RIF技术诊断MTB感染和利福平耐药的灵敏度和特异度。结果:226例疑似肺结核患者中,痰培养阳性94例(41.6%),其中MTB阳性51例(54.3%),非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria,NTM)阳性43例(45.7%)。以痰分枝杆菌培养阳性且结核分枝杆菌分泌蛋白64抗原阳性为金标准,Xpert MTB/RIF技术诊断MTB的灵敏度为72.6%[95%可信区间(confidence interval,CI)66.7%~78.4%],特异度为97.1%(95%CI 95.0%~99.3%)。Xpert MTB/RIF技术诊断痰涂片阳性患者MTB的灵敏度为76.7%(95%CI 67.7%~85.8%),特异度为90.0%(95%CI 83.6%~96.5%)。Xpert MTB/RIF技术诊断痰涂片阴性患者MTB的灵敏度为50.0%(95%CI 41.8%~58.2%),特异度为99.3%(95%CI 97.9%~100.0%)。18例患者同时检测利福平表型和基因型耐药,以表型耐药为金标准,Xpert MTB/RIF技术检测利福平基因型耐药的灵敏度为75.0%,特异度为100.0%。结论:艾滋病患者中Xpert MTB/RIF技术诊断肺结核的灵敏度和特异度均较高,且能快速区分MTB和NTM,具有较好的应用价值。     

实时定量qPCR检测耐异烟肼结核分枝杆菌Ag85B和38ku蛋白mRNA表达水平

目的运用实时定量qPCR(quantitative real-ti me PCR)检测结核分支杆菌耐异烟肼菌株和敏感株Ag85B和38 ku蛋白编码基因(fbpB、psts1)的表达水平,分析结核分支杆菌耐异烟肼株和敏感株的蛋白抗原在转录水平的差异性。方法根据GenBank提供的序列,设计目的基因fbpB、psts1及内参基因Sigа的特异引物,将fbpB、psts1及Sigа扩增片段克隆入载体pMD18-Tsi mple,重组质粒经纯化及倍比稀释,应用实时定量PCR检测22株耐异烟肼菌株及25株敏感菌株(含H37Rv标准株)中fbpB、psts1的表达水平。结果耐异烟肼菌株的fbpB表达水平为0.65±0.22,敏感菌株fbpB表达水平为0.36±0.13,差异有统计学意义(t=5.683,P<0.01);耐异烟肼菌株的psts表达水平为13.63±4.16,敏感菌株psts1表达水平为9.86±2.79,差异有统计学意义(t=3.869,P<0.01)。结论应用实时定量PCR检测耐异烟肼菌株的fbpB、psts1的表达水平显著高于敏感菌株,为耐药结核的实验室诊断提供分子标识。     

结核分枝杆菌异烟肼和丙硫异烟胺耐药及其交叉耐药相关机制研究进展

结核病是一种严重危害人类健康的呼吸道传染病。据世界卫生组织估算,2018年全球耐多药结核病患者数为48.4万。异烟肼是重要的一线抗结核药物,但其目前耐药情况比较严重。丙硫异烟胺,作为异烟肼耐药患者的替代治疗药物,与异烟肼存在部分的交叉耐药性。本文综述了异烟肼和丙硫异烟胺交叉耐药的相关机制,为异烟肼耐药及耐多药结核病患者的治疗提供科学依据。     

实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。     

结核分枝杆菌休眠期和活跃期差异表达基因分析

目的探讨结核分枝杆菌休眠的机制,寻找结核分枝杆菌休眠期高表达基因。方法分别取对数生长期结核分枝杆菌和已培养100 d的陈旧结核分枝杆菌(荧光染色证实为休眠菌),提取基因组RNA,DNA酶处理后用RNA回收试剂盒回收RNA,用mRNA纯化试剂盒纯化RNA,利用抑制性消减杂交(SSH)技术分析两时期结核分枝杆菌的基因组mRNA的表达差异;通过基因克隆、基因测序和序列分析,寻找差异表达基因;采用实时荧光定量PCR鉴定高表达基因。结果通过SSH杂交,以休眠结核分枝杆菌cDNA为检测子的正相杂交和以对数生长期结核分枝杆菌cDNA为检测子的反相杂交的各自检测子高表达或特异性表达的片段都得到了选择性扩增,杂交产物经基因克隆、转化、测序分析以及用BioEdit软件比对和Blast分析,正相得到14个休眠结核分枝杆菌特异性表达或高表达的功能基因,反相得到17个对数生长期结核分枝杆菌特异性表达或高表达的功能基因。结论利用SSH杂交技术筛选到休眠结核分枝杆菌和对数生长期结核分枝杆菌的差异表达基因,为休眠结核分枝杆菌休眠机制的研究奠定了基础。     

Diagnostic performance of DNA microarray for detecting rifampicin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis

BackgroundWhile rifampicin (RFP) and isoniazid (INH) are the most commonly used first-line antituberculosis drugs, multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis poses a threat to the success of tuberculosis (TB) control programs. Clinical practice guidelines and expert consensuses recommend drug susceptibility testing (DST) before the initiation of antituberculosis treatment. However, traditional DST is time-consuming and has high requirements for laboratory conditions. The recently developed molecular diagnostic techniques, such as DNA microarray, offer new options. We thus investigated the diagnostic value of DNA microarray in detecting RFP + INH-resistant TB, with an attempt to identify simple, efficient, and accurate drug-resistant TB testing methods.MethodsThe clinical features and DST results of patients diagnosed with pulmonary tuberculosis by Bactec MGIT 960 liquid culture system (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) who received DNA microarray analysis in our center from July 2019 to July 2020 were retrospectively analyzed. Level of agreement between liquid culture and DNA microarray technology was assessed by using the Cohen kappa coefficient. With the results of liquid culture as the gold standard, the sensitivity and specificity of the DNA microarray were calculated, and the receiver operating characteristic (ROC) curves were used to assess the diagnostic values of the DNA microarray in detecting RFP + INH-resistant TB.ResultsA total of 825 patients were enrolled. The sensitivity and specificity of DNA microarray were 0.84 and 0.94, respectively, in the detection of RFP resistance, with an area under the curve (AUC) of 0.89 [95% confidence interval (CI): 0.87–0.91)] and a Cohen kappa coefficient of 0.78 (95% CI: 0.72–0.83). For INH resistance, the sensitivity and specificity of the DNA microarray were 0.73 and 0.97, respectively, with an AUC of 0.85 (95% CI: 0.82–0.87) and a Cohen kappa coefficient of 0.75 (95% CI: 0.70–0.80).ConclusionsThe DNA microarray had high specificity and sensitivity in detecting RFP + INH-resistant TB. As a rapid, accurate, and practical technique, it can be routinely performed in clinical laboratories.     

4种药物外排泵抑制剂对异烟肼抗结核分枝杆菌最低抑菌浓度的影响研究

目的 研究4种药物外排泵抑制剂对异烟肼抗结核分枝杆菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentra tion,MIC)的影响.方法 纳入37株单耐异烟肼和10株全敏的结核菌临床分离株以及H37Rv,应用微孔板Alamar blue显色法检测以上菌株分别加入维拉帕米(verapamil,VP)、氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ)、硫利哒嗪(thioridazine,TZ)和羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone,CCCP)4种外排泵抑制剂前后异烟肼抗结核菌的MIC的变化情况,并用配对x2检验比较不同抑制剂对异烟肼MIC的影响程度.结果 37株单耐异烟肼结核菌中,分别有64.86％(24/37)、48.65％(18/37)、43.24％(16/37)和37.84％(14/37)的菌株被VP、CPZ、TZ和CCCP降低异烟肼MIC,且均以降低2倍为主,VP致异烟肼MIC降低2倍及以上的菌株数均高于TZ和CCCP,P值均＜0.05.6/10的全敏结核菌以及H37Rv的异烟肼MIC被VP降低2倍及以上.结论 4种药物外排泵抑制剂对异烟肼抗结核菌存在不同程度的影响,VP降低异烟肼MIC的作用较强.