枸橼酸钠抗凝剂对疟原虫生长活性的影响

目的　了解枸橼酸钠抗凝剂对疟原虫生长活性的影响。　方法　将疟原虫经抗凝剂(ACD,CD和SC)处理后以感染率为指标检测抗凝剂对虫体的影响。未同步化的恶性疟原虫分别使用3种不同浓度抗凝剂于37℃作用3h。处理后的红细胞与正常虫体混合,同时处理后的虫体与正常红细胞混合,随后观察两种培养混合物的感染率以确定抗凝剂作用的靶细胞。同上处理期同步化的疟原虫(环状体,滋养体和裂殖体)以观察抗凝剂作用的期特异性。将伯氏疟原虫用抗凝剂处理后接种小鼠,通过感染率的变化观察抗凝剂对鼠疟的影响。　结果　 3种抗凝剂均可抑制疟原虫的生长,其中ACD影响最甚。以抗凝剂分别处理红细胞和疟原虫,结果表明抗凝剂作用于虫体而非红细胞。处理同步化的虫体表明抗凝剂对裂殖体的抑制最为显著。同样处理伯氏疟原虫后接种小鼠进一步验证了抗凝剂对恶性疟原虫作用的抑制性效应。　结论　ACD对疟原虫的抑制性效应最为明显,SC是疟原虫试验中枸橼酸钠抗凝剂的首选。     

恶性疟原虫在裂体增殖中裂殖子蛋白质和糖蛋白的合成

宿主对疟原虫的免疫应答中,细胞外的裂殖子可能是重要的靶子。作者用代谢标记法,研究了恶性疟原虫裂殖子蛋白质和糖蛋白的组分、合成及其抗原性。作者选用取自夜猴的恶性疟原虫(K~ 株分离物FVO),经山梨醇同步培养,用Percoll梯度离心法,由上而下可得到疟原虫的滋养体、裂殖体、环状体小团及没有感染的红细胞。收集滋养体和裂殖体,去除环状体和大     

人恶性疟原虫培养物期特异蛋白质的合成和命运

作者用[~(35)S]-甲硫氨酸为标记物经同步培养分别获得恶性疟原虫环状体、滋养体和裂殖体。然后将这些不同生长期疟原虫制备成Triton-可溶蛋白制剂进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,用放射自显影显示各期蛋白质的合成和命运。结果:在环状体、滋养体和裂殖体生长的每一阶段都合成了许多蛋白,并且从环状体到下一次红内期裂殖子这整个循环中许多蛋白质保持不变。至少15种高分子量为177,170,158,87,83,47KD_a的8种蛋白在裂殖体中出现而不是在裂殖子。分子量为240、203、106、80、35、19、15与14KD_a的8种蛋白在裂殖子中出现,但不在环状体到下一次裂殖子这一阶段中出现,有些蛋白合成     

体外培养恶性疟原虫培基中RESA的初步研究

培养恶性疟原虫培基的上清与不同稀释度的环状体感染红细胞表面抗原(RESA)抗体阳性的10份云南恶性疟患者血样共育,取上清进行RESA-IFA。结果显示,所有血样的RESA抗体滴度均有不同程度的下降.培基经加热处理后,并不影响其抑制活性。表明体外培养恶性疟原虫培基中存在可溶性RESA,且对热稳定。用不同程度的裂殖子可溶性抗原和O型红细胞影抗原与RESA抗体阳性的血样共育,再进行RESA-IFA。裂殖子抗原在浓度为3.1μg/ml时产生完全抑制。相反,O型红细胞影抗原在浓度比裂殖子抗原高约30倍时,才产生抑制。表明RESA源于裂殖子。     

化学药品和红细胞膜成分的酶改变对 疟原虫侵入人体红细胞的影响

文献报道红细胞膜表面可能有裂殖子受体,当它被蛋白质消化处理后可阻止裂殖子侵入红细胞。作者利用这一特性对疟原虫侵入红细胞机理进行了研究。感染恶性疟原虫的红细胞经同步化处理使其仅含环状体,再用胰蛋白酶或链霉蛋白酶等处理,发现这样的处理并不影响环状体的发育但可使红细胞抑制新的裂殖子侵入。同时,如加入未经处理的红细胞,则可观察到有大量新裂殖子侵入。由此不仅巧妙地提供了分离裂殖子的方法并使有可能研究裂殖子侵入与红细胞成分之间的关系。胰凝乳蛋白酶处理人红细胞并不能阻止裂殖子的侵入。用化学方法如以作用于氨基的活性试剂H_2DIDS或交链剂     

使用培养的恶性疟原虫抗原作疟疾间接免疫荧光试验的评价

目前间接免疫荧光试验(IIF)检测疟疾抗体用的抗原系由感染猴疟原虫或人疟原虫的夜猴制得。作者以培养的恶性疟原虫作抗原,对其敏感性、特异性和重复性等进行了观察,并与来自感染夜猴的恶性疟原虫抗原作了比较。当培养的恶性疟原虫血症达8%,其中环状体20%,滋养体35%,裂殖体45%时进行收集,以pH7.2的PBS洗5次,最后用同样的PBS制成悬液,涂制的抗原片厚血膜的每一高倍视野可见20～30个原虫,即以蜡纸封存于-70℃。感染夜猴的恶性疟原虫     

酮替芬、赛庚啶及苯噻啶体外抗恶性疟原虫的作用

在体外培养条件下观察了酮替芬、赛庚啶及苯噻啶对恶性疟原虫的抑制作用,其中以酮替芬的效果最佳,5×10~-5M酮替芬可明显抑制疟原虫的发育,使虫数减少并不再能形成裂殖体。作者还用同步化了的疟原虫进一步研究了酮替芬对疟原虫生长环节的抑制作用.     

关于间日疟原虫红内期的体外培养

作者报道了间日疟原虫红内期体外培养43天的结果。从曾旅居于巴西6个月的27岁年轻人采得间日疟原虫虫株,原虫密度为2.5%(大滋养体及裂殖体),用Tragcr烛缸平皿法,培养液由RPMI 1640,葡萄糖及Rh阳性的O型血清组成,不同点主要是在培养液的pH方面。在培养的头6天pH较酸,每天更换3次培养液,每2天添加红细胞1次。间日疟原虫连续培养27天,然后将其冻存于液氮中;为测定原虫活力,再将冻存的原虫进行复苏培养。到43天时中止培养再冻存于液氮。在培养过程中可见到大滋养体,未成熟裂殖体,在39天时还见到幼小滋养体及环状体。在中止培养时,原虫密度为0.25‰。     

恶性疟原虫裂殖子和感染恶性疟原虫裂殖体的红细胞表面蛋白

作者按照Tragager和Jensen的方法,用含10%人血清的RPMI 1640-HEPES(称为RPS培基)在100mm的陪氏培养皿中培养恶性疟原虫。为收集大量的裂殖子,首先进行同步培养。最初,用山梨糖醇处理培养物,然后,在明胶中漂浮反复地分离环状体和滋养体。用这种方法(一般是5次)每40—42小时挑选一次感染滋养体的红细胞,直到3—4小时内原虫同步发育。在释放裂殖子预测时间的八小时前,吸出培养基,并用含下列任一基质:(a)[~(35)S]蛋氨酸,10μci/ml的培养基;(b)[~3H]亮氨酸,10μci/ml 60ci/mmol;(c)[~3H]葡萄糖胺,40μci/ml;(d)[~3H]甘露糖,25μci/ml的10ml RPS培养基进行补充。     

西咪替丁抗疟作用的研究Ⅰ．西咪替丁对体外恶性疟原虫生长的影响

在体外培养条件下观察了西咪替丁对恶性疟原虫生长的影响。当西咪替丁的浓度为５×１０－３～４×１０－２ｍｏｌ／Ｌ时，具有明显的直接杀灭疟原虫及抑制其生长的作用。进一步观察西咪替丁对恶性疟原虫红内期发育的影响，结果表明，该药对环状体期的虫体最为敏感，可致原虫数目减少，并抑制其发育成滋养体。     

用一步和二步冰冻法保存疟原虫红内期

作者将合诺氏疟原虫的环状体、滋养体和裂殖体的红细胞分别混合于等量的二甲亚砜中(200毫升/升DMSO),将此血样直接浸入液氮内(一步法)或者先置于-25～-32C中5、10、30或60分钟后,再置于-196C的液氮内(二步法),以观察二种方法对不同时期的红细胞内期原虫的保存作用。结果发现,当用20%感染红细胞,其中96%为滋养体和裂殖体的血样作观察时,一步法对滋养体和裂殖体都有严重的损害,而二步法的血样,即先     

诺氏疟原虫的人体自然感染

云南省墨江县1例“间日疟”患者的血片,经回顾性镜检,发现疟原虫形态特别,早期滋养体多核,红细胞内有多个虫体寄生,晚期滋养体有形成带状趋势。裂殖体和配子体与间日疟原虫相似。经分子生物学鉴定为诺氏疟原虫。     

叔丁基羟基类化合物体外抗疟活性初步观察

目的了解叔丁基羟基类化合物对恶性疟原虫体外生长抑制作用。方法以奎宁为阳性对照,采用Rieckmann体外微量法测定2（6）-叔丁基-羟基甲酚体外抑制恶性疟原虫生长的活性,采用最小自乘法和几何均数法计算各测试化合物的IC50、IC90和完全抑制裂殖形成平均浓度。结果叔丁基羟基甲酚对体外生长的恶性疟原虫具有抑制作用,IC50和IC90分别是58.585μmol/L和170.411μmol/L,较阳性对照奎宁的IC50、IC90分别高出221.4和148.8倍,所设测试浓度系列内无BHT完全抑制裂殖形成的浓度。结论叔丁基羟基类化合物具有一定的恶性疟原虫体外生长抑制作用,但有效浓度明显高于奎宁。     

恶性疟原虫二氢乳清酸脱氢酶抑制剂体外诱导恶性疟原虫耐药的实验研究

目的分析恶性疟原虫二氢乳清酸脱氢酶(Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase,PfDHODH)抑制剂(二氢噻吩酮类化合物,编号50,以下简称PfDHODH抑制剂50)对体外培养恶性疟原虫的作用特点及其诱导耐药的可能机制。方法恶性疟原虫氯喹敏感株(3D7株)和氯喹抗性株(Dd2株)同步化培养后分为不加药对照组、环状体期加药组和大滋养体期加药组,药物终浓度为80 nmol/L。分别在同步化后0 h(环状体期)、24 h(大滋养体期)、42 h涂薄血膜片镜检;通过逐步加大药物浓度的方法,体外诱导产生耐药虫株,3个月后经有限稀释培养,获得单克隆耐药虫株。采用SYBR GreenⅠ染料法检测各耐药虫株对PfDHODH抑制剂50、氯喹和青蒿素的半数抑制浓度(IC_(50));PCR扩增各耐药虫株Pfdhodh基因并测序,分析其突变情况。结果与不加药对照组相比,环状体期加药组恶性疟原虫从滋养体到裂殖体的发育受到明显抑制,大滋养体期加药组恶性疟原虫呈现明显的空泡化,核质密度大大降低。通过体外诱导并经有限稀释培养,获得44株PfDHODH抑制剂50的单克隆耐药虫株,其中,母本为Dd2、3D7的耐药虫株分别为24和20株,它们对PfDHODH抑制剂50的IC_(50)分别为(2.284±0.096)和(0.678±0.018)μmol/L,较母本虫株的(0.018±0.002)和(0.015±0.002)μmol/L分别提高了近130倍和50倍;对氯喹和青蒿素的IC_(50)分别为(0.011±0.002)、(0.014±0.004)和(0.013±0.003)、(0.012±0.001)μmol/L;与母本Dd2虫株相比,Dd2耐药虫株对氯喹的IC_(50)从(0.072±0.002)μmol/L下降为(0.011±0.002)μmol/L。测序分析结果显示,23株Dd2来源的耐药虫株PfDHODH蛋白氨基酸序列发生了G181D的点突变,另有1株除G181D的点突变外,还产生了K32N的点突变;3D7来源的耐药虫株未发现相应突变。结论体外诱导获得PfDHODH抑制剂50的单克隆耐药虫株,G181D的点突变可能是导致恶性疟原虫高水平耐受PfDHODH抑制剂50的重要分子机制。     

我国恶性疟原虫对氯喹抗性的消长

目的　监测停止或减少使用氯喹防治恶性疟后恶性疟原虫对氯喹抗性的变化。　方法　采用世界卫生组织 (WHO)制定的体外微量法和体内四周法 ,在停用氯喹后不同时间测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性。　结果　海南省乐东县抱由镇体外法测定抗性率由 1981年的 97.9%降至 1997年的 2 6.7% (P <0.0 1) ,完全抑制裂殖体形成的平均药浓度由 10.46±7.14 pmol/μl 血 降至 1.63± 1.47pmol/μl 血 (P<0.0 1) ,用较高药浓度 (>6.4pmol/μl血)才能完全抑制裂殖体形成的病例所占比例由 83.3 %降为 6.7% (P<0.0 1)。体内法测定抗性率由 1981年的 84.2 %降为 1997年的 18.4% (P<0.0 1) ,三级抗性 (RⅢ )占抗性病例的比例由 5 3.1%降为 14.3 % (P<0.0 1) ,血中无性体疟原虫平均消失时间由 72.0± 2 1.6 h变为 5 0.7± 16.1 h。2 0 0 1年三亚市雅亮乡体外法测定抗性率为 5 9.8% ,平均抑制药浓度 3.5 6± 2.12 pmol/μl 血 。 2 0 0 3年乐东县福抱乡体内法测定抗性率为 62.5 % ,RI、RⅡ和RⅢ分别占抗性病例 50 %、30 %和 20 % ,无性体疟原虫平均消失时间 5 6.9± 17.2 h。云南省勐腊县体外法测定抗性率由 1981年的97.4%降至 1999年的 77.8% (P <0.0 1) ,完全抑制裂殖体形成的平均药物浓度由 17.2± 12.6 pmol/μl血降至4.4±3.1 pmol/μl(P<0.01)。2002年景洪县体外法测定抗性率为70.4%，抑制裂殖体形成的平均药物浓度为4.0±3.3 pmol/μl 血。 结论 减少或停止使用氯喹后，我国恶性疟原虫对氯喹抗性呈降低趋势，逐渐恢复了对氯喹的敏感性。     

体外连续培养的恶性疟原虫抗原与体内原虫抗原的比较分析

本文报道,不同发育阶段的体外连续培养和取自感染夜猴的恶性疟原虫无性红内期经代谢标记后进行蛋白抗原比较分析结果。实验用的恶性疟原虫Uganda-Palo-Alto株已在体外连续培养8年以上。俟原虫血症达3～5%时,在含20%人血清的RPMI-1640培养基内加4mM秋水仙硷培养24小时,每5小时用不含秋水仙硷的培养基更换一次,48小时可完成体外培养原虫的同步化。每一种主要含环状体、滋养体及裂殖体的同步化培养基用~3H-异白氨酸按1.0mCi:0.5ml压积红细胞的比率进行代谢标记。另以同株恶性疟原虫感染夜猴,俟原虫血症达25～30%时采血,以RPMI-1640洗3次,过纤维素     

微量酶联免疫吸附试验测定恶性疟患者抗体的特异性

作者用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定疟疾病人和在流行区居民的抗体。收集恶性疟原虫感染的红细胞(50～100%为滋养体和裂殖体)和游离的原虫,经洗涤、离心超声等处理后,获得抗原。有些试验中用~(35)S-蛋氨酸代谢标记培养中的恶性疟原虫抗原进行试验,另以正常人体红细胞溶血后的细胞膜制备红细胞抗原与疟原虫抗原平行进行试验。抗IgG、抗IgM免疫球蛋白碱性磷酸酶     

用单克隆抗体测定从巴布亚新几内亚分离的恶性疟原虫的抗原多样性

作者以单克隆抗体结合荧光染色方法,对巴布亚新几内亚分离的恶性疟原虫(PNG)的初次分离株的抗原性进行了测定。所用单克隆抗体除一株(7.5)识别滋养体和裂殖体抗原,另一株(5.1)识别环状体后各原虫期抗原外,其它都是针对裂殖体和裂殖子的。单克隆抗体反应结果,如呈现荧光的寄生虫≥50形为阳性(+),<50%为阴性(-)。当比较     

恶性疟原虫对药物的敏感性--一种体外微量测定技术

本文作者报道了测定疟原虫对药物敏感性的微量技术。试验用的恶性疟原虫为对氯喹敏感的乌干达帕洛阿尔托株(FUP)和抗氯喹的越南奥克克诺尔株(FVO)。感染夜猴后采集血样约50微升,用下述微量技术测定不同浓度的氯喹对正常的成熟滋养体发育到裂殖体的抑制程度,以判断疟原虫对氯喹的     

恶性疟原虫体外培养污染皮氏罗尔斯顿菌的检测

目的探讨恶性疟原虫体外培养过程中皮氏罗尔斯顿菌污染的检测及预防。方法体外培养恶性疟原虫,涂片、染色后镜检观察;提取被污染虫血的总DNA,采用真菌、细菌通用引物对保守序列进行PCR扩增和克隆测序,将测序结果在Gen Bank中比对。结果导致恶性疟原虫体外培养失败的污染物单个细胞和污染物聚集体在油镜下的形态分别与恶性疟原虫环状体和裂殖体相似,但其胞质内无空泡或无明显细胞核,且位于红细胞外侧;测序比对结果显示污染物与皮氏罗尔斯顿菌相似度99%。结论恶性疟原虫体外培养过程中污染的皮氏罗尔斯顿菌形态与恶性疟原虫环状体或裂殖体相似,可导致镜检误判甚至使培养失败。因此,应严格无菌操作以防疟原虫体外培养污染。