人博卡病毒VP2蛋白的原核表达及血清学检测方法的建立

目的 获得高表达量的人博卡病毒( HBoV1、HBoV2) VP2蛋白,建立血清学检测方法.方法 按照大肠埃希菌密码子使用偏性,对HBoV1、HBoV2 VP2衣壳蛋白基因编码区序列进行优化合成.将合成的目的基因克隆至表达载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-VP2,转化大肠埃希菌BL21 (DE3),使用IPTG诱导表达并摸索最佳表达条件;粗提取蛋白进行Ni亲和层析纯化后建立间接酶联免疫吸附试验( ELISA),进行临床血清标本筛查,分析人群HBoV1、HBoV2感染情况.结果 优化合成的HBoV1、HBoV2 VP2基因正确连接至pET30a载体,开放阅读框正确,用1 mmol/L IPTG过夜诱导表达(25℃)得到高表达量的VP2蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在.粗提取蛋白经NiNTA亲和层析,在pH4.5时获得较理想的纯化蛋白,以其为抗原建立ELISA检查方法,筛查临床血清标本IgG抗体水平,结果显示健康儿童HBoV1阳性率为62.2％,HBoV2阳性率为55.5％,混合感染率为37％.结论 本研究成功将HBoV1、HBoV2 VP2衣壳蛋白基因编码区序列进行优化,得到了较高的蛋白表达量,所建立的ELISA法可以应用于HBoV1、HBoV2人群血清流行病学调查.     

人博卡病毒VP2病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫反应的研究

目的 探讨酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测人博卡病毒(HBoV) VP2病毒样颗粒(VLPs)诱导特异性细胞免疫反应的最佳条件.方法 HBoV VP2 VLPs免疫小鼠后,用ELISPOT方法检测小鼠的特异性细胞免疫反应,观察不同多肽刺激、不同细胞培养时间、不同细胞浓度以及不同浓度特异性刺激多肽条件下ELISPOT结果.结果 多肽P3(GYIPIENEL)及P5(LYQMPFFLL)刺激HBoV1 VLPs免疫小鼠脾脏淋巴细胞产生斑点数分别为233个/10(6)和157个/10(6)细胞,P8(GYIPVIHEL)刺激HBoV2 VLPs免疫小鼠脾脏淋巴细胞产生斑点数为113个/10(6)细胞;培养时间以24 h为最佳,此时HBoV1与HBoV2实验组特异性分泌IFN-(ｒ)的比率分别为232个/10(6)和119个/10(6)细胞;小鼠脾脏淋巴细胞浓度以5×10(5)为最佳,此时HBoV1与HBoV2实验组特异性分泌IFN-(γ)的比率分别为232个/10(6)和108个/10(6)细胞;刺激物浓度10μg/ml为最佳,HBoV1与HBoV2实验组特异性分泌IFN-(γ)的比率分别为233个/10(6)和96个/10(6)细胞.结论 HBoV1与HBoV2特异性BABL/c小鼠T细胞表位多肽分别为HBoV1:P3;HBoV2:P8.检测人博卡病毒VP2病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫反应ELISPOT方法最佳实验条件为:培养时间24 h,细胞浓度5×10(5)细胞/孔,刺激多肽终浓度10 μg/ml,可用于HBoV在小鼠上的细胞免疫研究.     

人博卡病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

目的 表达纯化人博卡病毒( human Bocavirus,HBoV) VP2蛋白,采用杂交瘤方法制备抗HBoV VP2蛋白的单克隆抗体.方法 应用原核表达载体pET-30a和大肠埃希菌表达VP2蛋白,并用固定化金属亲和层析,纯化后的蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELASA方法筛选阳性的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体进行分型检测和滴度测定.结果 表达并纯化获得了重组HBoV VP2蛋白,利用杂交瘤技术得到单克隆IgG抗体,抗体效价达到1∶4×105.结论 利用HBoV VP2蛋白免疫制备了单克隆抗体,并具有较高的效价.本研究为快速诊断和研究HBoV打下基础.     

人博卡病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

目的表达纯化人博卡病毒（human Bocavirus,HBoV）VP2蛋白,采用杂交瘤方法制备抗HBoVVP2蛋白的单克隆抗体。方法应用原核表达载体pET-30a和大肠埃希菌表达VP2蛋白,并用固定化金属亲和层析,纯化后的蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELASA方法筛选阳性的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体进行分型检测和滴度测定。结果表达并纯化获得了重组HBoVVP2蛋白,利用杂交瘤技术得到单克隆IgG抗体,抗体效价达到1：4×10^5。结论利用HBoVVP2蛋白免疫制备了单克隆抗体,并具有较高的效价。本研究为快速诊断和研究HBoV打下基础。     

人博卡病毒外壳蛋白(VP3)的重组表达及间接ELISA检测方法的建立

人博卡病毒（Human Bocavims）是2005年Tobias Allander等从小儿下呼吸道感染分泌物中分离到的新细小病毒，我们曾报道中国分离的人博卡病毒（WLL-1株）的全基因组序列。为了进一步检测分析人博卡病毒感染情况，我们重组表达了人博卡病毒WLL-1株的外壳蛋白（VP3）并建立了间接ELISA检测方法。     

上海地区人博卡病毒在儿童急性呼吸道感染的研究CSCD

目的了解上海地区人博卡病毒（HBoV）在儿童急性呼吸道感染中的流行情况和临床特点。方法上海地区在2012年1月至2012年12月共收集271例急性呼吸道感染患儿的鼻咽抽吸物,采用巢式聚合酶链反应（Nested PCR）方法检测人博卡病毒NS1基因、并经测序确认,对所获得的基因序列进行同源性和进化分析,博卡病毒阳性样本同时检测鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等8种呼吸道相关病毒。结果271例标本中共检出HBoV阳性31例,检出率11.4%;21例存在混合感染,全年均有检出,阳性患儿中位年龄17个月（4个月-4岁）,诊断包括上呼吸道及下呼吸道感染,临床表现包括发热、阵发性咳嗽、咳痰、腹泻、呕吐、咽充血、湿罗音等,无死亡病例,门诊患者检出率明显高于住院患者;序列分析表明其中29例为HBoV1、2例为HBoV2、与参考株的核苷酸同源性为99%-100%,氨基酸同源性96%-100%。结论HBoV1是上海地区急性呼吸道感染患儿中的重要病原,HBoV2在该地区首次检出,临床症状及诊断无特异性。     

检测人博卡病毒抗体间接酶联免疫吸附法的建立及临床应用

目的 建立间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测人博卡病毒(HBoV)抗体,探讨其临床应用的可行性.方法 以重组表达的HBoV融合蛋白VP2作为包被抗原,建立检测HBoV抗体的间接ELISA,优化该检测方法的最佳条件,观察其精密度、敏感度和特异性,并与荧光定量PCR方法对比检测40份临床样本,同时采用免疫印迹法(Western blot)确认其符合率.结果 所建立的间接ELISA最佳抗原包被浓度为2 mg/L,酶标二抗工作浓度为1∶5000,血清标本最佳稀释度为1∶200.该方法平均批内变异系数为6.87%,平均批间变异系数为4.67%.40份临床样本间接ELISA检测结果与荧光定量PCR及免疫印迹结果一致,符合率100%.结论 利用VP2融合蛋白作为抗原,建立的检测血清HBoV抗体间接ELISA方法特异性强、重复性好,可用于HBoV抗体的定量和定性检测.     

检测人博卡病毒抗体间接酶联免疫吸附法的建立及临床应用

目的 建立间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测人博卡病毒(HBoV)抗体,探讨其临床应用的可行性.方法 以重组表达的HBoV融合蛋白VP2作为包被抗原,建立检测HBoV抗体的间接ELISA,优化该检测方法的最佳条件,观察其精密度、敏感度和特异性,并与荧光定量PCR方法对比检测40份临床样本,同时采用免疫印迹法(Western blot)确认其符合率.结果 所建立的间接ELISA最佳抗原包被浓度为2 mg/L,酶标二抗工作浓度为1∶5000,血清标本最佳稀释度为1∶200.该方法平均批内变异系数为6.87%,平均批间变异系数为4.67%.40份临床样本间接ELISA检测结果与荧光定量PCR及免疫印迹结果一致,符合率100%.结论 利用VP2融合蛋白作为抗原,建立的检测血清HBoV抗体间接ELISA方法特异性强、重复性好,可用于HBoV抗体的定量和定性检测.     

人博卡病毒1型的近似全基因组扩增及HBoV1-4重组分析

目的 扩增人博卡病毒1型的近似全基因组序列,分析HBoV1-4之间的基因重组关系.方法 以检出HBoV1单阳性的鼻咽抽吸物为原始标本,采用PCR的方法扩增HBoV1的5个片段并测序,Blast比对确定是HBoV1片段后用DNAMAN进行序列拼接,拼接序列与已提交的近似全基因组的HBoV1在不同编码区进行同源性分析,并构建进化树;对HBoV1-4的不同编码区进行序列比对和进化分析,揭示HBoV1-4间的基因重组.结果 得到近似全长为5287 bp的HBoV1-NC序列,同源性分析发现HBoV1-NC与重庆株进化关系最近,与广州株进化距离最远;HBoV3可能由HBoV1和HBoV4重组进化而来,HBoV4可能由HBoV2与HBoV3重组进化而来.结论 本研究成功获得近似全基因组的HBoV-NC,HBoV1-4间存在着基因重组关系.     

人细小病毒——博卡病毒的研究进展

2005年8月22日瑞典学者Tobias Allander[1]在世界首次报道从呼吸道感染患者病理标本中分离出一种新型的人细小病毒,并命名为人博卡病毒(Human Bocavirus,HSoV).随后在全球相继有该型病毒感染的报道,初步判断人博卡病毒是引起急性呼吸道感染的一种新型重要病原.本文将对该型病毒的临床感染情况和分子生物学研究方面作一综述.     

北京地区人Boca病毒外壳蛋白VP2的原核表达及抗原性初步分析

目的 获得新发现的北京地区人Boca病毒(HBoV)主要外壳蛋白VP2,为对该病毒病原学的深入研究打下基础.方法 从已证明为HBoV阳性的临床标本BJ3722中经PCR扩增得到HBoV VP2蛋白编码区基因片段,将其克隆至pUCm-T载体中,然后再亚克隆至原核表达载体pET-30b(+),经双酶切、PCR、序列测定等方法 挑选、鉴定阳性克隆,得到重组表达质粒pET-30b-VP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同的温度下利用IPTG诱导蛋白表达;对得到的蛋白表达产物粗提物经Ni2+亲和层析纯化后,利用抗组氨酸抗体、兔抗HBoV-VP2多肽免疫血清及人血清进行抗原性初步分析.结果 BJ3722 VP2基因正确插入pET-30b中,开放阅读框架正确,表明得到了预期的pET-30b-VP2重组原核表达质粒.比较25℃、30℃、37℃ 3个不同温度下的蛋白表达产物,以25℃ 1 mmol/LIPTG诱导培养过夜后产生的带6×His标记的重组VP2蛋白量最大,主要以包涵体形式存在.VP2蛋白粗提物经Ni2+亲和层析,在pH4.5时获得较理想的纯化结果.Western blot显示所表达的蛋白质能够与抗组氨酸特异性抗体、兔抗HBoV-VP2蛋白多肽免疫血清以及人血清发生反应.结论 本研究成功构建了重组pET-30b-VP2原核表达质粒,改善了表达及纯化条件,得到了较大量的HBoV-VP2蛋白表达,并初步证明表达产物具有抗原特异性,可用于对这一新发现病毒的进一步深入研究.     

抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备具有中和活性的抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1的单克隆抗体.方法 人工合成SP55和SP70(分别包含VP1的第163-177,208-222位氨基酸)两段VP1的多肽,分别免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术进行细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞并测定效价.用分泌的单抗和EV71病毒在RD细胞上进行中和试验以检验其中和活性.结果 得到2株能稳定分泌抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,2株单抗的中和效价分别为1:8和1:16.结论 成功制备出2株具有中和活性的抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体,为其下一步应用打下基础.     

Immunogenicity and protective efficacy of the <Emphasis Type="Italic">E. coli</Emphasis>-expressed domain III of Japanese encephalitis virus envelope protein in mice

Domain III of Japanese encephalitis virus (JEV) envelope protein (E-DIII) was synthesized in E. coli as a fusion protein containing maltose-binding protein (MBP-E-DIII) or six contiguous histidine residues (His-E-DIII) at its N-terminus. MBP-E-DIII was found both in the soluble as well as the insoluble fraction of the bacterial lysate, while His-E-DIII was found exclusively in the inclusion bodies. These purified proteins were examined in mice for their immunogenicity in presence of an aluminium hydroxide based-adjuvant Alhydrogel and Freund’s adjuvant. While both proteins generated anti-JEV antibodies that neutralized JEV activity in vitro, His-E-DIII generated higher antibody titers than MBP-E-DIII. Mice immunized with His-E-DIII in presence of Alhydrogel generated antibody titers similar to those induced by the commercial vaccine and protected mice against lethal JEV challenge. Alka and Kaushik Bharati contributed equally to this work.     

HPV31和52 L2融合蛋白的原核高效表达及免疫效果评价

目的 高效表达HPV31和52型L2融合蛋白疫苗,并评价其免疫效果.方法 根据GenBank上公布的HPV31、52型L2蛋白11-200位氨基酸序列,设计合成两个型别L2该区域对应的优化密码子基因融合序列,并将其克隆至原核表达载体中.利用原核表达系统表达HPV31和52 L2融合蛋白,纯化目的蛋白后免疫小鼠,用血清抗体检测及HPV假病毒体外中和试验评价融合蛋白疫苗的免疫效果.结果 HPV31和52 L2融合蛋白在原核表达体系中呈高效表达,表达量约占全菌20％.融合蛋白加铝佐剂免疫小鼠后,血清中能检测到高滴度的总抗体及一定水平的中和抗体和交叉中和抗体.结论 HPV31和52 L2融合蛋白能够刺激机体产生广谱中和抗体,为高危型广谱HPVL2蛋白疫苗研发提供了实验室依据.     

血管内皮生长因子C在维吾尔族妇女宫颈病变组织及血清中表达的临床研究

目的 检测血管内皮生长因子C(VEGF-C)在新疆维吾尔族妇女宫颈病变中组织表达及血清含量,评价组织及血清中VEGF-C的相关性及临床意义.方法 ①应用免疫组织化学方法检测22例慢性宫颈炎、24例宫颈上皮内瘤变( CIN)及43例宫颈鳞癌组织中VEGF-C的表达.②用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测15例慢性宫颈炎、23例CIN及40例宫颈鳞癌患者血清中VEGF-C的含量.结果 ①慢性宫颈炎、CIN及宫颈癌组织中VEGF-C阳性表达率分别为9.10％、87.50％、100％,差异有统计学意义(P＜0.05).②慢性宫颈炎、CIN和宫颈癌患者血清中VEGF -C含量呈逐渐增高趋势,差异有统计学意义(P＜0.05).③慢性宫颈炎、CIN和宫颈鳞癌患者组织及血清中VEGF-C的表达及含量,两者之间有相关性,差异有统计学意义(r=0.27,F=5.327,P＜0.05),组织表达越强,血清含量越高.结论 VEGF-C在新疆维吾尔族妇女CIN及宫颈鳞癌的转变过程中起一定的作用.