DHPLC法和测序法检测结核分枝杆菌临床分离株链霉素的耐药性

目的我国是WHO认定的结核病高发区域之一。链霉素在我国已经使用50年以上,现在在结核病治疗中仍广泛使用。本工作采用变性高效液相色谱(DHPLC)法和测序法来分析结核分枝杆菌链霉素耐药基因rpsL和rrs基因突变,从而检测是否对链霉素耐药。方法215株结核分枝杆菌临床分离株(经常规方法证实,115株为链霉素耐药,100株为敏感),测定链霉素最小抑菌浓度(MIC),同时采用DHPLC和测序法检测rpsL和rrs基因突变。结果85.2%(98/115)的链霉素耐药株携有rpsL或/和rrs基因突变,其中rpsL基因突变占大多数(76.5%,88/115)。对98株带有基因突变的菌株的分析表明,rpsL,rrs基因的突变类型与MIC之间未见密切关系。100株敏感株未检出基因突变。DHPLC法与测序法结果完全一致。结论本工作建立的DHPLC法可以认为是结核分枝杆菌链霉素耐药分析的一种有效的工具。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变的快速检测

目的：探讨快速检测结核分枝杆菌异烟肼（INH）耐药基因型的分子药敏方法。方法：用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测了30株INH敏感菌株及30株耐药株的katG基因，随后用SSCP方法鉴定扩增产物有无突变，以结核分枝杆菌H37Rv作对照。结果：所有INH敏感株均观察到katG基因扩增产物，30株INH耐药株中28株观察到katG基因扩增产物。以H37Rv标准株为对照，30株敏感株SSCP带谱与对照相同；28株INH耐药株中13株与对照相同，15株有不同程度的差异。与药敏试验比较，PCR－SSCP检测INH耐药结核菌的敏感性为57%，特异性为100％。结论：多数结核分枝杆菌耐INH是由于katG基因突变所致，用PCR－SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分枝杆菌INH耐药基因型的目的。     

应用单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性分析

目的探讨单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性,评价此方法在耐药性检测中的临床应用价值。方法采用聚合酶链反应-单链探针反向杂交试验技术,PCR扩增50株结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL、rrs、embB耐药基因,将标记生物素的基因扩增产物与固定在硝酸纤维膜上的核酸探针杂交,通过链亲和素碱性磷酸酶,BICP/NBT显色系统检测分析基因突变,同时与传统药物敏感实验比对分析。结果 PCR-LiPA方法分析50株结核分枝杆菌临床分离株,耐RFP菌株中检出4株,耐INH菌株中检出5株,耐SM菌株中检出7株,SM敏感株检出1株,50株rrs基因均未检测到相应位点的突变;耐EMB菌株1株、EMB敏感株1株检测到embB基因突变。结论应用PCR-LiPA可快速、简便地检出部分结核分枝杆菌耐药株,可作为临床辅助诊断手段。     

探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药突变

目的对采用探针熔解分析法对结核分枝杆菌的链霉素耐药突变情况进行快速检测的应用价值进行研究分析。方法抽取740株结核分枝杆菌的临床分离菌株,采用探针熔解分析法,对链霉素耐药突变情况进行检测。结果 740株结核分枝杆菌中有86株发生突变,9份标本中发现杂合信号,8份标本中没有任何信号。29份存在药敏性的标本的检测结果均显示为野生型,有耐药性的13份标本中仅有5份存在突变现象,另外的8份标本检测结果显示为野生型。结论采用探针熔解分析法对结核分枝杆菌的链霉素耐药突变情况进行快速检测,其特异性非常明显,且具有快速、准确的特点。     

基因芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性

目的研究基因芯片在检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性中的应用。方法根据与利福平和异烟肼耐药相关的4条基因上的11个位点和30种单核苷酸多态性设计制作芯片,用芯片检测结核分枝杆菌的基因突变,从而判断其耐药性。结果用基因芯片在110株异烟肼耐药株中检测出85侏（73．3％）,在30株异烟肼敏感株中检测出22株（73．3％）,在94株利福平耐药株中检测出77株（81．9％）,在46株利福平敏感株中检测出40株（87．0％）。芯片检测结果与部分样本的测序结果完全相符。结论用DNA芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性具有较高的特异性和敏感性,该法快速、精确,可以应用于结核分枝杆菌耐药性的检测。     

1431株结核分枝杆菌原发耐药性分析

目的了解广东省结核分枝杆菌临床分离株的原发耐药性情况,为今后结核病防治工作提供参考依据。方法采用WHO推荐的结核病耐药性监测的药敏比例法,对1431例从未用过抗结核药物的临床分离株进行耐药性测定。结果总原发耐药率为17.7%;4种一线常用抗结核药物的原发耐药率分别为:异烟肼(H)11.5%、链霉素(S)8.9%、利福平(R)7.1%、乙胺丁醇(E)3.6%。耐多药〔MDR〕78株,占5.5%。结论要重视化疗原则和加强管理水平,进一步减少耐药病例的发生。     

3种耐药结核分枝杆菌检测及临床应用

目的探讨耐链霉素(SM)、利福平(RFP)、异烟肼(INH)结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG3种基因突变情况及在耐药检测中临床应用的可行性。方法采用聚合酶链反应单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对221株临床分离株,100例涂片阳性肺结核病痰标本进行rpsL、rpoB、KatG3种基因突变分析。221株临床分离株中敏感株34株,单耐SM、RFP、INH分别为32株、37株、28株,耐SH、SR、HR、SHR分别为14株、30株、8株、52株,100例痰标本耐SM、RFP、INH分别为51例、54例、40例。结果以结核分枝杆菌H37RV为对照,34株敏感株rpsL、rpoB基因SSCP图谱正常,特异性为100%,KatG基因2株SSCP图谱异常,特异性为94.1%。单耐SM、RFP、INH结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG基因突变率分别为78.1%(25/32)、86.5%(32/37)、53.6%(15/28),耐多药(SM、RFP、INH)结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG基因突变率分别为78.1%(75/96)、88.9%(80/90)、55.4%(41/74)。100例涂片阳性肺结核患者痰标本经PCR扩增67例阳性,直接检测耐SM、RFP、INH结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG基因突变率分别为74.1%(25/35)、89.1%(33/37)、48.0%(12/25),阳性检出率分别为49.0%、61.1%、30.0%。结论耐单药和耐多药(SM、RFP、INH)结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG基因突变率分别经χ2分析差别无统计学意义(P>0.05),也就是耐单药和耐多药结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG基因突变率相同,耐多药结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG3种基因突变相互之间无影响。PCR-SSC技术有望直接用于检测涂片阳性肺结核患者痰标本中rpsL、rpoB、KatG基因突变判定耐药,但还需在方法学上进一步改进以达到技术容易掌握、操作简便、影响因素少,结果检出率高等。     

用分子生物学技术快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的：用PCR—SSCP技术检测耐INH、RFP、SM结核分枝杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变，评价其在快速检测结核分枝杆菌耐药性方面的临床价值。方法：以结核分枝杆菌H；vRv为对照，20株耐多药菌株和20株敏感株，分别用PCR—SSCP方法检测KatG、rpoB、rpsL基因突变，并将SSCP结果与药敏试验结果作对照分析。结果：PCR—SSCP方法检测20株敏感株SSCP带语均与H37RV标准株相同，而20株耐多药结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL基因突变的阳性率分别为70％，100％和75％。发现20株耐多药菌株中有11株(55％)共INH、RFP、SM3种耐药遗传标志均发生突变，7株(35％)有2种耐药遗传标志突变，2株(10％)只有RFP耐药标志突变。结论：PCR—SSCP方法敏感、特异，可快速检测结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因突变，有利于耐多药结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

PhaB和FQ-PCR两种快速检测结核分枝杆菌方法的比较

目的比较裂解型分枝杆菌噬菌体检测技术(Phage amplified biologically assay,PhaB)和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)快速检测临床标本中结核分枝杆菌的优缺点及临床应用价值。方法对142例肺结核患者的痰标本和41份非结核性痰标本应用PhaB法和FQ-PCR进行检测和结果比较。结果PhaB法阳性76例,阳性率53.5%;FQ-PCR法阳性84例,阳性率59.1%。PhaB法和FQ-PCR法相比,有统计学差异(P<0.05)。2种方法检测41份非结核性痰标本均为阴性。结论两种方法能快速、简便、灵敏、特异检测结核分枝杆菌,同时又有不同的特点。     

用DNA芯片检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因突变的研究

目的利用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变。方法根据结核分枝杆菌embB基因序列设计探针并制作DNA芯片。根据结核从分枝杆菌embB基因突变的热点片段设计引物，该片段用TAMRA荧光标记PCR扩增增后与DNA芯片杂交，同时以PCR-SSCP和DNA测序法为对照。结果120株结核分枝杆菌临床分离株中，35株敏感株DNA芯片杂交结果与标准株完全相同；85株耐乙胺丁醇临床分离株中有50株检测到embB基因突变[58．8％（50／85）]，均为306位密码子突变，该突变与PCR．SSCP和测序结果完全一致；85株耐药株中后有35株未检测到突变，占41．2％（35／85）。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株的embB基因突变，可协助临床医生制定合理的治疗方案，特别是复治患者，可帮助选择有效药物。     

快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性

目的：建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法：用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析结核分支杆菌rpoB基因突变并与药敏试验对照。结果：116株结核分支杆菌的PCR-SSCP图谱与H37Rv为对照，81株耐药菌73株有明显区别，而35株敏感，仅1株位置有区别；检测阳性率90．1％；特异性97．1％。结论：rpoB基因突变是结核分支杆菌耐利福平的主要机理，PCR-SSCP可简便快速地检出rpoB基因的突变，有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究。     

基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值

目的探讨基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值。方法回顾性分析685例结核病临床疑似病例的临床资料,采用晶芯结核分枝杆菌生物芯片技术进行检测。结果本组685例临床疑似病例中,阳性135例,阳性率为19．7％,基因芯片检测结果显示结核131例,非结核4例,阳性率为19．1％。耐药基因检测68例,利福平和异烟肼基因突变12例。总突变率为17．6％,其中11例为利福平和异烟肼均耐药,双重基因突变率为16．2％,另1例只耐利福平。利福平总突变率为17．6％,异烟肼总突变率为16．2％,耐多药率为16．2％。结论晶芯结核分枝杆菌生物芯片技术用于临床诊断结核病及其耐药性,能够缩短诊断时间,提高临床时效性,值得推广应用。     

结核分支杆菌耐药基因检测结果分析

目的 分析肺结核患者结核分支杆菌获得性耐药情况,比较两种耐药性检测方法的检测效果.方法 用药敏试验(绝对浓度法)检测结核分支杆菌株对利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)、吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)的耐药情况,采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测结核分支杆菌耐药rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变.结果:400例肺结核耐药患者常规药敏试验耐药316例(79.8%);耐药基因检测耐药株288株,突变率72.0%.RFP耐药例数和耐药率明显高于SM、PZA和EMB(耐药例数:F=2.45,2.56,2.69,P＜0.05;耐药率:F=2.55,2.66,2.79,P＜0.05),rpoB突变株和突变率明显高于katG、rpsL、pncA和embB(突变株:F=2.28,2.46,3.19,3.33,P＜0.05～0.01;突变率:F=2.36,2.61,3.25,3.45,P＜0.05～0.01),高浓度药物耐药菌株的突变株和突变率显著高于低浓度药物耐药菌株,随着不规律用药时间的延长,耐药率和突变率均逐渐上升(耐药率:F=2.77,2.88,P＜0.05;突变率:F=2.72,2.85,P＜0.05).结论 PCR-SSCP是一种快速检测结核杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变敏感、特异的方法.     

结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制的研究

目的　了解结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制 ,建立快速分子药敏试验方法。方法　通过聚合酶链反应 (PCR) -单链构象多态性 (SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性 (RFL P)和 PCR-直接测序 (DS)技术分析 10 7株结核分枝杆菌临床分离株 emb B基因。结果　以 H3 7Rv标准株为对照 ,10 7株结核分枝杆菌临床分离株的 16 S r DNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准相同。 38株药物敏感株的 emb B基因、SSCP均泳动正常 ,RFL P和 DS分析与对照株相同。 6 9株耐乙胺丁醇 (EMB)分离株中 ,2 5株 (36 .2 % ) emb B基因 SSCP泳动异常 ;8株 RFL P分析异常 ;DS分析 2 5株均为 30 6位密码子突变 ,其中 1株合并有 2 74位 CGC→ CCC突变 ,其 EMB MICs均≥ 2 0 μg/ml;8株为 30 6位 ATG→ATA或 ATT突变 ,17株为 ATG→GTG或 CTG突变 ,后者 EMB MICs均≥ 30μg/ml。结论　部分结核分枝杆菌耐乙胺丁醇是由于其 emb B基因 (尤其是 30 6位密码子 )突变所致 ,PCR- SSCP技术可能成为测定部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型的简便、快速的方法     

单管半套式PCR-SSCP用于结核分支杆菌rpoB基因突变的研究

目的 ①证明单管半套式聚合酶链反应(PCR)是检测结核分支杆菌的特异性方法;②研究结核分支杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性的关系。方法 设计三条针对结核分支杆菌的特异性引物,采用单管半套式PCR-单链构象多态性(SSCP)方法对结核分支杆菌、其它分支杆菌和富含GC碱基的细菌进行分析。结果 ①结核分支杆菌标准菌株H_(37)Rv和55株临床分离株均扩增出一条193bp片段,其特异性为100％,敏感性约为10pgDNA;15株非结核分支杆菌和8株富含GC的细菌均未得到扩增;②55株结核分支杆菌临床分离株193bp扩增片段SSCP图谱特点:以H_(37)Rv为对照,15株利福平敏感株均无区别;40株耐药株除6株外其余34株SSCP图谱有明显区别,检测阳性率为85％。结论 单管半套式PCR检测结核分支杆菌简便、敏感、特异,结合SSCP可检出耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变,此突变与利福平耐药关系密切。     

结核分支杆菌耐喹诺酮分子机制的研究

目的了解结核分支杆菌耐喹诺酮药物的分子机制，建立快速的药敏的方法。方法通过16S rRNA聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR—SSCP)技术分析77株分支杆菌临床分离株；通过PCR—SSCP和直接测序技术(PCR—DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况。结果75株为结核分支杆菌复合群。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗为对照．30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常，测序分析与对照株相同。45株耐喹诺酮的菌株中，34株(75．6％)gyrA基因SSCP图谱泳动异常；测序证实10株为90位密码子的突变，24株为94位密码子突变，所有gyrA突变株的氧氟沙星4μg／ml≤MICs≤32vg／ml，左氧氟沙星2μg／ml≤MICs≤16vg／ml。结论gyrA基因突变，尤其90位和94位密码子突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制，PCR—SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌喹诺酮耐药基因型的简便、快速的方法，并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验。     

结核病临床分离株及痰标本中embB基因型的快速测定

目的建立快速测定结核病耐乙胺丁醇(EMB)分离株和痰标本中结核分枝杆菌EMB耐药基因型的方法，以期为患者提供及时、有效地化验结果。方法应用16S rDNA聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)和PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)对11株耐EMB分离株和46例结核病痰标本进行分子菌种鉴定和embB基因突变的部位与性质分析。结果以结核分枝杆菌H37Rv标准株为对照，11株耐EMB分离株和46例临床痰标本经16S rDNA PCR-SSCP分析电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同；限制性内切酶NlaⅢ消化embB基因扩增产物显示，11株耐EMB分离株中4株(36．4％)不被NlaⅡ消化；46例结核病痰标本中10例(21．7％)不被NlaⅡ消化。结论部分结核分枝杆菌耐EMB是由于embB基因突变所致。采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法可直接快速测定结核病耐EMB分离株和痰标本中结核分枝杆菌耐EMB基因型。