男性外阴部皮肤成纤维细胞雄激素受体的研究──（二）核特异结合及受体温度稳定性的检测

在完整细胞与３Ｈ－Ｒ１８８１特异结合的基础上，用ＳＴＭ－ＴｒｉｔｏｎＸ－１００缓冲液分离粗制核，建立了简便而快速地检测核雄激素特异结合的方法。对正常男性包皮成纤维细胞核与３Ｈ－Ｒ１８８１特异结合的Ｓｃａｔｃｈａｒｄ及单点分析表明，该细胞核与３Ｈ－Ｒ１８８１的特异结合具有高亲和力、低容量的特征，当细胞与近饱和浓度的３Ｈ－Ｒ１８８１温育５０ｍｉｎ后，４７．１６±７．９９％（ｎ＝２０）的特异结合被发现存在于核内，而一睾丸女性化（ｔｆｍ）综合征患者的核特异结合量明显低于该值。我们还显示，正常男性包皮成纤维细胞与３Ｈ—Ｒ１８８１在４２℃温育时的特异结合量比在３７℃温育时减少，但其量低于４０％。当减少量超过４０％时，表明存在热不稳定型的雄激素受体。     

正常成年男性外阴部皮肤成纤维细胞雄激素受体的研究 Ⅰ.完整细胞受体测定法

本文以[~3H]R1881为配体,建立了正常男性外阴部皮肤成纤维细胞雄激素受体(AR)的完整细胞检测法。实验表明外阴部皮肤成纤维细胞[~3H]R1881的特异结合具有高亲和力、低容量的特点及明显的雄激素结合的特异性,符合AR判定的基本条件。用Scatchard及单点分析法检测了18例我国正常成年男性包皮成纤维细胞[~3H]R1881的特异结合量,其值为6194±982结合位点/细胞((?)±SD)。该法取材比较容易,不需特殊仪器设备,是AR基础与临床研究的简便灵敏的方法。     

诱导成纤维细胞表达核结合因子的研究

目的：探讨诱导条件下成纤维细胞表达成骨细胞特异性转录子－核结合因子（Cbfal)的可能性及成纤维细胞表达成骨表型的发生机理。方法：分离、纯化人皮肤成纤维细胞,使其生长在分别含一定浓度肿坏死因子（TNF）α,骨诱导蛋白（BMP）－2,TNF－α加BMP－2的条件培养液中,采用逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学技术,分别检测Cbfal,骨钙素,H－ras,BMPI型受体（BMPR－I A）和I,Ⅲ型胶原mRNA表达及Ras,BMPR-I A蛋白形成状况,结果：TNF－α可诱导成纤维细胞由表达I,Ⅲ型胶原表型向表达I型胶原转化;促进成纤维细胞Ras的形成,在TNF－α作用1,3h和1周后,可使成纤维细胞H－ras mRNA的相对表达量分别升高39．5％,7．4％和43．2％,TNF－α作用1h后的成纤维细胞可产生BMPR－I A,联合应用TNF－α与BMP－2可诱导成纤维细胞表达Cbfal,骨钙素mRNA。结论：TNF－α与BMP－2联合应用,可刺激成纤维细胞表型转化,是调节成纤维细胞表达Cbfal的诱导条件之一。     

核结合因子a1基因修饰的皮肤成纤维细胞修复骨缺损的实验研究

目的探讨核结合因子a1（Cbfal）基因修饰的兔皮肤成纤维细胞与煅烧骨构建的移植材料对长骨大段骨缺损的修复作用。方法分离、纯化、培养兔皮肤成纤维细胞（RSF）,应用pSG5-Cbfal及pSG5质粒分别转染RSF,获得pSG5-Cbfal／RSF及pSG5／RSF,培养生长48h后,分别接种于长2cm、直径4mm的圆柱状牛煅烧骨（TBC）上,制成pSG5-Cbfal／RSF／TBC及pSG5／RSF／TBC复合物材料。制备兔桡骨中部长2cm的骨缺损模型,随机分组后,植入pSG5一Cbfal／RSF／TBC材料作为实验组（I组）,以pSG5／RSF／TBC材料植入组（Ⅱ组）、单纯TBC材料植入组（Ⅲ组）和无植入材料的自然修复组（Ⅳ组）作为对照,每组6只（12个桡骨）动物。分别于术后第4周及第12周摄X线片检查并最终获取骨折处标本,对植骨处进行三点抗折弯测试、脱钙骨组织切片的HE染色和Masson染色及新生骨小梁图像计量分析。结果I组标本骨质生长活跃,有大量新生骨小梁,生物力学性能良好,骨缺损处已完成早期愈合及修复;II组、Ⅲ组及Ⅳ组无明显新生骨形成,未显示骨修复现象。结论CbfaI基因修饰的兔皮肤成纤维细胞经与煅烧骨复合植入兔体内后,能完成对大段骨缺损的修复。     

胎儿和少儿皮肤内碱性成纤维细胞生长因子及其受体的基因表达

目的　探讨不同胎龄的胎儿和少儿皮肤中碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)及其两种受体 (bek和flg)基因表达的变化。 方法　提取 18例不同胎龄 ( 13～ 3 2周 )的胎儿皮肤和 6例少儿皮肤的总RNA后 ,分离mRNA ,用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测这 3种基因在不同组织中的表达。结果　在早期妊娠胎儿的皮肤中 ,bFGF ,flg和bek基因表达较强 ,随着胎儿的生长和发育 ,皮肤组织内这 3种基因表达逐渐降低 ,在少儿皮肤中 3种基因的表达量分别为晚期妊娠胎儿皮肤的 62 .5 % ,5 9.5 %和 5 2 .9% ,基因表达显著降低 ( P <0 .0 5 )。结论　bFGF及其受体基因可能在皮肤的发生、结构功能的维持以及伤后修复中起重要作用。这 3种基因在胎儿皮肤中表达水平较高可能与胎儿皮肤细胞增殖较快 ,皮肤创面愈合迅速有关。     

家兔皮肤成纤维细胞的成骨潜能（组织化学及放射自显影研究）

家兔皮肤的中厚皮片，经制备成小皮块以后作体外培养，成纤维细胞自皮块游出，不断增多，以后开始汇合，形成多层结构，成纤维细胞分泌众多颗粒，堆积在细胞的表面，逐步形成去雾状物质，云雾状物质增大，成为圆形或卵圆形结节。相邻的结节可被条状小梁联在一起，用新生骨细胞的特异标记物－四环素及茜素红，作组织化学观察，结节及小梁均呈阳性反应，说明成纤维细胞所形成的结节及小梁均为骨组织，将体外培养的成纤维细胞用＾Ｈ－Ｔ     

成纤维细胞生长因子-10及其受体对胎儿皮肤附件形成的诱导作用

目的:探讨成纤维细胞生长因子-10(FGF10)及其受体(FGFR2b或Bek)在胎儿皮肤附件(SA)形成中的表达特征及其生物学意义.方法:对130块分别来自26例不同胎龄(EGA 8～31周)胎儿,5个不同部位(头、下颌、耳垂、肩和胸骨柄)的皮肤标本,采用病理学、免疫组化方法和计算机图像扫描技术检测FGF10、Bek、细胞角蛋白-19(CK19)、Bcl-2和细胞增殖核抗原(PCNA)在胎儿皮肤组织的表达水平.结果:除EGA8周胎儿缺乏典型的皮肤组织学结构和FGF10和Bek蛋白表达外,所有蛋白在E11周以后的皮肤内都有阳性表达.在EGA11周,表皮下成团分布的间质细胞过表达FGF10、PCNA和Bcl-2,表皮细胞和周皮细胞则所有蛋白均呈强阳性表达;在EGA13周时表皮细胞局灶性增殖形成SA胚芽,并逐渐向真皮内生长、分化和迁移;在EGA11～31周的皮肤组织内,真皮内间质细胞表达FGF10、PCNA和Bcl-2以及SA上皮细胞表达FGF10、Bek、PCNA、CK19和Bcl-2蛋白呈现与生长发育同步的表达特征,但单个细胞表达的平均光密度(A)值则随胎龄增加而逐渐下降(P＜0.05～0.001).结论:间质细胞旁分泌的FGF10与上皮细胞膜Bek特异性结合,是诱导胚胎SA上皮细胞生长及其形态发生的重要信号,但有关SA的形成部位和种类及其与FGF10蛋白表达的相互关系仍有待深入研究.     

男性靶组织中雄激素受体分析及其数据处理方法的比较研究

应用放射配基结合测定法，以R1881为特异配基；分析正常成年男性雄激素靶组织─—外阴皮肤组织中细胞质和核基质雄激素受体（AR），同时分别用Scatchard、woolf和双倒数作图法三种常用数据处理方法详细分析AR的Bmax（Bm）和Kd。结果表明，作为阳性对照和质量控制的6例雄性大鼠肝脏细胞质AR的Bm为4.77±0．61pmol／g蛋白，Kd为9.662.03×10－10mol／L。11例正常男性的细胞质ARBm为24．03±7．19pmol／g蛋白，Kd为15.13±7.06×10－10mol／L；细胞核内AR的Bm为204．37±119．62pmol／g蛋白，Kd为6．38±4．14×10－10mol／L。Scatchard、Woolf和双倒数法分析的结果均一致。提示AR的Scatchard作图分析是稳定可靠的，并且具有显著的实用价值。     

碱性成纤维细胞生长因子促进受创皮肤再生的实验研究

成纤维细胞生长因子（ｆｉｂｒｏｂｌｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＦＧＦ）有促进肉芽，组织生长作用，但对皮肤的修复与再生的作用研究尚少，为此设计了本实验研究。采用大鼠与小型猪背部创伤模型，在无菌条件下用手术刀在动物背部切割皮肤，形成面积约２．５ｃｍ２的圆形创面。分别用碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ），６０Ｕ／ｃｍ２创面以及相同剂量的生理盐水处理创面，隔天换药一次。结果表明，ｂＦＧＦ具有显著促进上皮细胞生长、加速创面上皮化速率以及增加愈合组织抗张力强度等作用。ｂＦＧＦ显著促进受创皮肤的再生效应可能与它能直接作用于皮肤基底细胞上特异性ｂＦＧＦ受体有关。     

胎儿皮肤附件形成与成纤维细胞生长因子-10和Bek基因表达的关系

目的探讨在不同发育阶段胎儿皮肤中成纤维细胞生长因子-10(FGF-10)及其受体Bek基因表达特征及其与皮肤附件形成的关系。方法用病理学技术检测不同发育阶段胎儿皮肤的结构特征，并提取不同胎龄(12～32周)胎儿皮肤的总RNA，用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测FGF-10、Bek基因在不同胎龄标本中的表达变化。结果在早期发育的胎儿皮肤中。FGF-10和Bek基因表达较弱，随着胎龄的增长和发育的进展，特别在皮肤附件诱导形成阶段。两种基因表达逐渐增强，在胎儿发育后期，两种基因表达开始减弱。结论FGF-10与其受体Bek基因的特异表达方式及两者结合后引起的信号激活对皮肤附件的诱导形成和形态发生及皮肤生理功能的维持具有重要意义。     

pcDNA 3.1/RPs15载体构建及对皮肤成纤维细胞作用的实验研究

目的 构建核糖体蛋白s15(RPs15)基因真核表达载体，研究其对小鼠皮肤成纤维细胞的体外作用。方法 将RT-PCR法获得的鼠胚皮肤RPs15cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3．1(-)，在FuGENE6介导下转染体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞，观察RPs15基因的表达情况及其对成纤维细胞生物学特性的影响。结果 构建的重组表达载体pcDNA3．1／RPs15经DNA测序证实序列正确。RT-PCR法检测RPs15基因在转染的成纤维细胞中获得表达，细胞生长密度下降，形态发生变化。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／RPs15，并可在体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞中表达，为深入研究RPs15基因对皮肤成纤维细胞的作用奠定了基础。     

转化生长因子βRⅡ抗体对皮肤成纤维细胞抑制作用的研究

目的探讨转化生长因子Ⅱ型受体(TGF-βRⅡ)抗体对皮肤成纤维细胞的影响,以期寻找利用生长因子控制瘢痕的途径.方法①测定培养细胞液中羟脯氨酸含量.②活细胞四甲基偶氮唑(MTT)增殖实验.③流式细胞仪测定细胞周期.④光学显微镜及电子显微镜形态学观察.结果①实验组中羟脯氨酸含量较对照组明显降低(P＜0.01).②抗体作用下细胞增殖受到抑制(P＜0.01).③抗体抑制细胞周期的G0-G1期,导致细胞无法完成正常有丝分裂.④抗体作用下,细胞外合成的纤维素样物质明显减少,细胞生长受到抑制.结论应用外源性TGF-βⅡ型受体抗体能阻断TGF-β的信号传导,有效地抑制培养成纤维细胞的增殖,降低其细胞外胶原基质的分泌.     

血小板源生长因子受体α和β在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达的差异性研究

目的：研究血小板源生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor,PDGFR）-α和PDGFR-β在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达差异。方法：分别应用免疫细胞化学、western blot及荧光定量RT-PCR技术,检测瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞中PDGFR-α和PDGFR-β的蛋白和mRNA表达。结果：与正常皮肤成纤维细胞相比,瘢痕疙瘩成纤维细胞中PDGFR-α的蛋白和mRNA表达都显著升高（P=0．00,0．00,0．02）,而PDGFR-β蛋白和mRNA表达的升高不显著（P=0．07,0．06,0．06）。结论：PDGFR-α表达升高与瘢痕疙瘩形成密切相关,可能是其病因机制之一。     

成纤维细胞生长因子受体3及p53蛋白表达与膀胱癌预后关系的研究

目的 探讨膀胱癌组织中成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、p53蛋白表达及与膀胱癌预后的关系.方法 免疫组织化学法检测108例膀胱癌组织和8例正常膀胱黏膜中FGFR3和p53的表达.膀胱癌患者中男60例,女48例.年龄29～87岁.TNM分期Ta～T164例、T2～T4 44例.病理分级G130例,G249例、G329例.结合临床资料分析其与膀胱癌分期、分级、复发的相关性.Kaplan-Meier法和Cox回归分析法进行生存分析. 结果 108例膀胱癌组织FGFR3阳性表达59例(54.6%),其中Ta～T1肿瘤阳性表达率75.0%,T2～T425.0%;G1 70.0%、G2 57.1%、G334.5%;p53阳性表达48例(44.4%),其中Ta～T1 25.0%、T2～T4 72.7%;G1 36.7%、G2 34.7%、G369.0%.8例正常膀胱黏膜组织FGFR3、p53表达均为阴性.组间差异均有统计学意义(P＜0.01).Spearman等级相关分析表明FGFR3与p53表达不相关(P＞0.05).Kaplan-Meier法结果表明FGFR3阳性表达组较阴性表达组、p53阴性表达组较阳性表达组有较长的复发间期(P＜0.05).单因素Cox回归分析显示FGFR3表达缺失和p53过度表达与肿瘤分级分期显著相关(P＜0.05).多因素Cox回归分析表明,p53表达是膀胱癌预后的独立影响因素(OR=0.59,P=0.04).结论膀胱肿瘤组织中FGFR3蛋白过度表达及p53蛋白表达缺失提示患者预后较好.     

晚期糖基化终产物受体介导AGE-β2微球蛋白与人成纤维细胞的结合

目的探讨被晚期糖基化终产物修饰的β２微球蛋白（ＡＧＥｓβ２Ｍ）与人类成纤维细胞的相互关系。方法用去垢剂提取人成纤维细胞系（ＨＳＦｓ）膜成份。用免疫印迹法和免疫荧光法鉴定细胞ＡＧＥ受体（ＲＡＧＥ）。用放射性配体结合法观察ＡＧＥβ２Ｍ与ＨＳＦｓ的相互关系。结果ＨＳＦｓ膜表面表达ＲＡＧＥ。ＡＧＥβ２Ｍ能以特异、剂量依赖的方式与ＨＳＦｓ结合［亲和常数（Ｋｄ）≈８６５ｎｍｏｌ／Ｌ］，这一过程可被抗ＲＡＧＥ抗体所抑制，提示该结合是由ＲＡＧＥ所介导。结论成纤维细胞及其相关的间质细胞可能是ＡＧＥβ２Ｍ病理生物学效应的靶细胞，从而可能参与了透析相关性淀粉样变（ＤＲＡ）的发生。     

睾酮通过调控趋化因子受体CXCR3影响尿道狭窄疤痕成纤维细胞迁移的实验研究

目的 探索人尿道狭窄疤痕成纤维细胞在不同双氢睾酮(DHT)环境中CXCR3表达水平变化及迁移变化、并探寻涉及的潜在相关生物信号通路。方法 选取不同DHT浓度作用于人尿道狭窄疤痕成纤维细胞,Western-blotting检测不同组成纤维细胞CXCR3受体的表达情况。通过Transwell小室试验研究不同浓度的DHT对成纤维细胞迁移能力的影响。取用不同浓度DHT处理组和酒精刺激后的空白对照组,利用转录组测序技术(RNA-seq)分析寻找DHT与CXCR3潜在相关生物信号通路。结果 Transwell实验证实,随着DHT浓度的逐步升高,成纤维细胞的迁移得以相应减弱。同时阶梯式升高浓度的DHT溶液环境可显著增加各组成纤维细胞CXCR3的表达,加入恩杂鲁胺拮抗雄激素受体(AR)后CXCR3受体表达明显下降。通过RNA测序后发现不同浓度雄激素处理后能显著改变部分基因的表达,主要富集于TGF-β信号通路、细胞黏合信号通路、类风湿炎症信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、细胞运动骨架信号通路、Hippo信号通路、WNT信号通路等。结论 在高雄激素环境中,人尿道狭窄疤痕成纤维细胞迁移有明显变化,...     

高代次人皮肤成纤维细胞的热原检测及致敏性研究

目的对多个样本的高代次(第2～10代)人皮肤成纤维细胞进行热原检测及致敏性研究,为其作为组织工程肌腱种子细胞的安全性提供相关依据。方法采用胶原酶消化法获取人皮肤成纤维细胞,在体外扩增培养、传代至第10代并收集培养细胞的上清液作为实验组,同时收集第2代细胞培养上清液作为对照,根据《医疗器械生物学评价》等国家规定的相关标准实验方法,分别对所收集的不同样本上清液进行热原检查和致敏性分析。结果各样本实验组和对照组动物均未发生明显的体温异常变化和皮肤过敏反应,根据国家相应标准判断为阴性结果。结论高代次(第10代以内)人皮肤成纤维细胞无热原,且不会产生致敏反应,用于组织工程肌腱构建具有较高的安全性。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化生长因子 -βⅠ、Ⅱ型受体的表达及调控

目的：了解瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)－βⅠ、Ⅱ型受体的表达及TGF－β1,β3对其的影响。方法；体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFB）和正常皮肤成纤维细胞（NFB），利用免疫组化及计算机图像分析系统测定TGF-βⅠ、Ⅱ型受体含量。结果：KFB胞浆内阳性信号明显强于NFB（P＜0．05）；经TGF－β1,β3处理组胞浆内阳性信号差别均不明显（P＞0．05）。结论：KFB存在高表达的TGF－βⅠ、Ⅱ型受体；TGF－β1,β3均能促进KFB TGF－βⅠ、Ⅱ型受体的表达。     

选择性雄激素受体调节剂（Sarm）对迟发性腺功能减退大鼠的作用研究

目的 通过观察选择性雄激素受体调节剂对迟发性腺功能减退大鼠的作用,为治疗LOH提供理论依据.方法 将30只符合标准的老年Wistar大鼠作为LOH动物模型,并随机分成3组：对照组（A）、DHT组（B）、Sarm组（C）,分别给予空白溶剂、雄激素及选择性雄激素受体调节剂（Sarm）进行干预,实验4周后观察各组大鼠LOH症状的改善情况并评分,检测血清游离睾酮的水平,计算前列腺相关指数.结果 干预4周后A、B、C三组大鼠LOH症状评分分别为（18.20±1.87）、（30.00±2.49）、（35.20±1.87）,血清游离睾酮分别为（2.248±0.305）、（1.088±0.258）、（2.526±0.283） pg/mL,前列腺指数分别为（0.321±0.008）％、（0.419±o.015）％、（0.304±0.007）％,各组间差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 Sarm可能通过其与雄激素受体高度亲和力及选择性调节雄激素受体表达,明显改善LOH模型大鼠的LOH症状,有效抑制前列腺组织的增生,不影响自身睾酮的分泌.