NOX1基因荧光素酶报告基因系统的建立

目的：对炎症细胞因子TNF-α及IFN-γ刺激下,人NOX1基因的表达调控进行初步分析。方法：将NOX1基因5′-端上游序列连接到无启动子的PGL3-BASIC质粒,构建了PGL3-BASIC／NOX1报告质粒。PGL3-BASIC／NOX1质粒转染A549细胞,用TNF-α、IFN-γ刺激12h,双荧光素酶报告基因系统检测基因表达情况。结果：克隆的NOX1片段具有较强的启动子活性,在TNF-α和IFN-γ共同刺激下,转染报告基因的A549细胞萤光素酶活性与对照相比有明显的增高（约4．3倍）。分析显示NOX1基因5′端上游序列片段含有NF-KB结合位点,提示细胞因子刺激的荧光素酶表达增强可能与NF-KB位点激活相关。结论：NOX1基因表达水平明显受到炎症细胞因子的调控,提示该基因可能参与机体免疫防御（特别是上皮细胞免疫防御）,值得进行深入研究。     

IFN-α和IFN-γ逆转MR2细胞维甲酸耐药的实验研究

目的:探讨IFN-α和IFN-γ与全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)联合逆转MR2细胞对ATRA耐药的可能性及其机制。方法:IFN-α、IFN-γ及ATRA单独或两种IFN分别与ATRA联合作用于对ATRA耐药的细胞株MR2后,采用MTT比色法检测细胞的增殖,用光镜观察、NBT还原实验及流式细胞仪检测细胞的分化,用间接免疫荧光法检测早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia,PML)蛋白的表达。结果:两种IFN均能抑制MR2细胞的增殖;IFN与ATRA联合应用时抑制作用更加显著;但两种IFN无论是单独应用还是与ATRA联合应用,二者之间均无统计学意义(P>0.05)。两种IFN也能诱导MR2细胞发生一定程度的分化;二者分别与ATRA联合应用时作用更加显著,但IFN-γ ATRA组诱导MR2细胞分化的作用明显强于IFN-α ATRA组(P<0.05)。两种IFN都能诱导PML蛋白的表达。结论:IFN-γ与ATRA联合应用逆转MR2细胞对ATRA耐药的作用强于IFN-α与ATRA的联合,可能与IFN-α和IFN-γ信号传导途径的不同有关。     

体外单核巨噬细胞诱生IFN-α的因素分析

观察了Ｍ－ＣＳＦ预处理、ＩＦＮ－γ预处理、长程培养及新城疫病毒（ｎｅｗ－ｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ,ＮＤＶ）刺激４个因素对正常人外周血单核细胞体外产生ＩＦＮ－α水平的影响,采用生物活性法检测ＩＦＮ－α。结果表明：单独使用Ｍ－ＣＳＦ不能诱生ＩＦＮ－α;单独使用ＩＦＮ－γ或单独使用ＮＤＶ均只诱生较低水平ＩＦＮ－α,只有Ｍ－ＣＳＦ＋ＩＦＮ－γ＋ＮＤＶ或ＩＦＮ－γ＋ＮＤＶ联合使用方可诱生较高水平的ＩＦＮ－α,并且发现Ｍο、－Ｍφ长程培养也是向高产发展的一个重要因素。结论：人血Ｍο、－Ｍφ在适当体外培养条件下,可以诱发较高水平的ＩＦＮ－α     

HIV-1gp120基因及其与IFN-α基因共表达产物的构建和实验研究

目的研究细胞因子IFN-α在机体免疫应答过程中的免疫佐剂效应.方法以表达中国流行株HIV-1gp120基因的核酸疫苗质粒pGP及共表达中国流行株HIV-1gp120基因与IFN-α基因的核酸疫苗质粒pGPIFN-α免疫Balb/c鼠,用流式细胞仪测定10 000个免疫鼠脾淋巴细胞中CD4+,CD8+T细胞数及CD4+/CD8+比值.结果 pG-PIFN-α与pGP比较,pGPIFN-α免疫鼠CD4+和CD8+T细胞数明显提高.结论在机体的免疫应答过程中,细胞因子IFN-α能很好地发挥免疫佐剂的作用.     

IFN-α治疗慢性乙型肝炎疗效与记忆性T细胞的相关性

目的 研究IFN-α在治疗慢性乙型肝炎患者中对记忆性T细胞亚群变化的影响,及其临床治疗效果与记忆性T细胞亚群变化的相关性.方法 57例接受IFN-α治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者,分别在治疗前(O周),及疗程期内不同时间点(12周和24周)抽取外周血,分离外周血单个核细胞(PBMCs)后加入抗体染色,流式细胞仪检测,统计学分析.结果 非活动性HBsAg携带者CD8效应记忆性T细胞(CD8+TEM)的比例显著高于未经IFN-α治疗的CHB患者;相反,CD8中心记忆性T细胞(CD8+TCM)的百分比则显著低于未经IFN-α治疗的CHB患者(P<0.05);有效组CD8+TEM百分比在IFN-α治疗前和治疗24周时均高于无效组,CD8+TCM百分比在IFN-α治疗前和治疗24周时则低于无效组(P<0.05);有效组IFN-α的剂量明显高于无效组.结论 病毒的清除与效应记忆性T细胞亚群比例可能有关,TEM亚群在数量上占优势可能对IFN-α治疗效果有益.

Abstract：

Objective To investigate the influence of interferon-a therapy on CD8 T memory subsets in patients with chronic hepatitis B(CHB) and correlation between the effect of IFN-α and CD8 T memory subsets. Methods Blood samples from 57 patients with CHB were collected before treatment (0 week), at 12 weeks and 24 weeks of treatment with pegylated IFN-α. Assays were performed on freshly isolated peripheral blood mononuclear cells ( PBMCs). For phenotype analysis, All data were acquired on a flow cytometer instrument and prepared for analysis. Results A significantly higher frequency of CD8+ TEM and lower frequency of CD8+ TCM in inactive HBsAg carriers than that in CHB patients prior to treatment was observed (P <0.05). The proportion of CD8 + TCM was higher in group nonresponders than in group respond-ers, and the proportion of CD8 + TEM was lower in group nonresponders than in group responders (P < 0.05 ). The average dosage of IFN-α applied to patients with response was significantly higher than nonresponders. Conclusion The dominance of circulating effector memory T cells may be associated with elimination of viral infection, and possibly benefit for response to therapy with IFN-α.     

IFN-α磷酸化STAT1和STAT4诱导人NK细胞产生IFN-γ并增强其杀伤活性

目的研究IFN-α对CD56+NK细胞的细胞因子分泌、杀伤功能和细胞内信号传导的作用。方法分离健康人PBMC分别与培养液、IFN-α和IL-12培养,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中IFN-γ的水平。同时采用流式细胞仪在单个细胞水平上分析IFN-α诱导IFN-γ产生的细胞亚群以及该细胞亚群对肿瘤细胞的杀伤作用和信号传导机制。结果经IFN-α刺激后,PBMC能产生低剂量的IFN-γ。细胞亚群分析的结果表明,IFN-α诱导CD56+NK细胞产生IFN-γ,但对CD4+T和CD8+T细胞无明显作用。IFN-α促进NK细胞的杀伤功能。促进STAT1和STAT4磷酸化。结论 IFN-α通过磷酸化STAT1和STAT4,增加NK细胞IFN-γ分泌和增强杀伤功能。     

TLR9、IFN-α和BAFF水平与系统性红斑狼疮的相关性研究

目的检测系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)Toll样受体(TLR)-9 mRNA及血清干扰素(IFN)-α、B细胞活化因子(BAFF)水平,探讨TLR9与SLE疾病活动的关系及与IFN-α、BAFF在SLE发病中可能的相互作用。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测40例SLE患者及20例健康对照者PBMCs中TLR9 mRNA水平;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测60例SLE患者及20例健康对照者血清IFN-α、BAFF水平。结果 1SLE患者外周血单个核细胞TLR9 mRNA表达水平较健康对照组上调(P0.05);TLR9 mRNA表达水平与SLE疾病活动指数(SLEDAI)、血沉(ESR)呈正相关(P0.01,P0.05);与补体3(C3)呈负相关(P0.05)。2SLE患者血清中BAFF、IFN-α水平高于健康对照(P均0.05);BAFF、IFN-α水平均与SLEDAI呈正相关(P0.05)。3SLE患者中抗ds-DNA抗体阳性者TLR9 mRNA、BAFF与IFN-α水平高于阴性者(P均0.05)。4SLE患者外周血单个核细胞TLR9mRNA表达水平与血清中BAFF、IFN-α水平正相关(P0.01);血清中BAFF与IFN-α呈正相关(P0.05)。结论 SLE患者外周血单个核细胞TLR9 mRNA表达上调,血清中BAFF、IFN-α分泌增加,均与疾病活动相关。SLE患者外周血单个核细胞TLR9 mRNA表达与血清IFN-α、BAFF水平之间及BAFF和IFN-α之间均呈显著正相关,提示TLR9、BAFF及IFN-α参与了人类SLE的发病过程并相互调控,在SLE疾病活动维持中起重要作用。     

TLR2介导的BV-2细胞TNF-α及IFN-α的表达

目的:观察HCV阳性血清处理后TLR2 mRNA的表达及TLR2蛋白阻断前后TNF-α、IFN-α的表达.方法:细胞分为空白对照组、正常对照组及实验组,每组分为4h、8h、16 h及24h,同时设TLR2阻断组及其对照组,采用RT-qPCR方法检测各组各时间点TLR2mRNA的表达变化,并采用ELISA方法检测各时间点及TLR2阻断后组培养上清液中TNF-α、IFN-α水平.结果:HCV阳性血清处理后各时间点TLR2 mRNA表达均显著增加,空白对照组、正常对照组与实验组之间TLR2mRNA表达有统计学差异(P ＜0.05); TLR2蛋白阻断前后TNF-α、IFN-α的表达有统计学差异(P＜0.05).结论:HCV阳性血清处理可能激活TLR2,TLR2可能通过下游大量炎性因子如TNF-α、IFN-α等参与BV-2抗HCV免疫.     

IFN-α在SLE病理机制中的启动和维持作用

SLE的发病过程中存在T细胞凋亡、T细胞数量减少以及自身反应性T、B细胞活化和树突状细胞、调节性T细胞的异常。近年来的研究发现,IFN-α与上述免疫学异常密切相关,在SLE的发病机制中起重要作用。本文就近年来SLE体内IFN-α的产生和免疫病理作用的研究进展作一综述。     

IFN-α对宫颈癌细胞MHC-I类链相关蛋白A表达的上调作用

目的:观察IFNα对宫颈癌细胞MHCI类链相关蛋白A(MICA)表达及功能的影响。方法:以IFNα诱导宫颈癌细胞系HeLa和Caski后,用半定量RTPCR和免疫组化染色法观察诱导前后MICAmRNA和其蛋白表达的变化,用MTT比色法检测诱导前后宫颈癌细胞对外周血NK细胞杀伤敏感性的变化。结果:经IFNα诱导后,HeLa和Caski细胞中MICAmRNA和其表面MICA蛋白的表达水平均明显上调,并呈一定的时间和剂量依赖关系。NK细胞对MICA表达较高的HeLa细胞的杀伤活性,明显高于对MICA弱表达的Caski细胞。经1×106U/LIFNα诱导3d后,两种细胞对NK细胞杀伤的敏感性均明显增强(P<0.01)。结论:IFNα可上调MICA在肿瘤细胞表面的表达,并可增强肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性。     

荧光素酶报告基因标记的HBV小鼠模型的建立

建立萤火虫荧光素酶(Fluc)为报告基因标记的乙型肝炎病毒(HBV)小鼠模型。通过水动力转染10μg质粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2分别导入C57BL/6和BALB/c小鼠肝细胞内,定期取血检测HBsAg和HBV-DNA水平,活体成像检测Fluc在小鼠的表达。在BALB/c小鼠中,血清HBsAg表达水平在转染后第1w内迅速升高,随后快速下降。而在C57BL/6小鼠中,HBsAg表达水平下降较缓慢。血清病毒滴度在转染后第1d平均达到3.89×104copy/ml,在第4d和第7d达到最高,分别为1.61×105和1.31×105copy/ml,随后开始下降,在转染的第70d仍维持在103 copy/ml以上。免疫组化检测C57BL/6小鼠肝脏HBcAg的表达,结果显示在转染后第3dHBcAg高水平表达,第135dHBcAg仍有表达,但表达水平降低。活体荧光成像实时检测小鼠肝脏Fluc,结果表明两组小鼠均能持续高水平表达Fluc,转染后第7周Fluc的表达量仍然超过106 photon/s。我们建立的报告基因标记的HBV小鼠模型能够稳定表达HBV标志物和Fluc,为进一步进行HBV的疫苗评价提供了基础。     

人血单核细胞和U937细胞产生IFN-α的比较

一般认为人体单核-巨噬细胞(Mo-Mφ)系在体外诱生IFN-α较为困难,本文试图找到适合的培养条件,使Mo-M(?)系能在体外诱生IFN-α.结果显示:经M-CSF长期预处理和IFN-γ的短期预处理或单用IFN-γ短期预处理后,NDV刺激均能使人外周血Mo-M(?)产生较高水平的IFN-α;U937细胞只能产生低水平的IFN-α.     

siRNA沉默SOCS1表达增强IFN-α2a-NGR的抗肿瘤效应

目的:研究肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR抗肿瘤效应的分子机制,发现影响干扰素敏感性的关键信号分子,提高耐药肿瘤细胞敏感性。方法:培养IFNAR高表达细胞株A549、IFNAR低表达细胞株MKN-45,通过MTT检测IFN-α2a-NGR的抗细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)、Western blot检测IFN-α2a-NGR处理前后STAT1、p-STAT1、p53、OAS与SOCS1的表达变化,合成siRNA靶向干涉SOCS1。结果:IFN-α2a-NGR刺激后,A549中,p-STAT1、p53、OAS与SOCS1表达上调;MKN-45中P53、OAS无显著变化,SOCS1显著上调。靶向干涉SOCS1后,MKN-45对IFN-α2a-NGR的敏感性增加[抑制率从(14.69±1.05)%提高到(36.97±2.05)%]。结论:IFN-α2a-NGR与IFN-α2a在细胞和分子水平的效应基本一致,p-STAT1、p53与SOCS1可影响细胞对干扰素的敏感性,通过siRNA沉默技术可提高耐药细胞株敏感性,为IFN-α2a-NGR的进一步研发奠定了基础。     

IFN-γ和TNF-α协同对MIN6细胞凋亡的影响

目的研究细胞因子IFN-γ和TNF-α协同对小鼠胰岛瘤细胞株MIN6凋亡的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察比较了IFN-γ、TNF-α单独及其组合对MIN6细胞活性的影响,并进一步通过光学显微镜和激光共聚焦显微镜从形态学上对其毒性作用进行了验证,最后通过流式细胞术区分了其对MIN6细胞的凋亡和坏死的作用。结果 IFN-γ和TNF-α单独作用对MIN6细胞活性有轻微影响,但两者组合对MIN6细胞的活性具有显著的抑制作用,并且早期凋亡的细胞百分率明显高于IFN-γ单独处理组(69.91%&13.03%),而坏死或晚期凋亡细胞的百分率两组之间没有差异(2.14%&2.41%)。结论IFN-γ和TNF-α协同可促进MIN6细胞的凋亡。     

稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株的构建

目的 构建稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株.方法 PCR扩增获得ALB启动子,并与pBGLuc连接获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的pBGLuc-ALB质粒,脂质体转染质粒到不同细胞,ALB-GLuc活性检测功能.构建逆转录病毒,感染HP14.5肝干细胞株获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的稳定细胞株,经Dex、HGF体外诱导后第3、6、9、12天ALB-GLuc检测荧光素酶活性,免疫荧光检测ALB的表达.结果 PCR、酶切及测序结果显示ALB启动子正确插入至荧光素酶GLuc基因上游,HEK293、HP14.5、LC14d及Hepa1-6细胞中ALB-GLuc活性与免疫荧光结果一致.HP14.5 ALB-Gluc稳定细胞株在高浓度的稻瘟菌素中存活,免疫荧光结果显示Dex、HGF诱导后细胞中ALB的表达逐渐增强,并与ALB-Gluc活性升高一致.结论 成功构建了稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株,为研究肝干细胞的体外成熟分化提供了重要的细胞手段.     

IFN-α诱导HuH7细胞固有免疫分子APOBEC3G的表达

目的了解IFN-α对HuH7细胞固有免疫分子APOBEC3G表达的影响及其机制。方法HuH7细胞给予不同浓度的IFN-α(0 U/ml、100U/ml、400U/ml、800U/ml and 1200U/ml)刺激,10h后提取细胞总RNA,RT-PCR和实时定量RT-PCR检测HuH7细胞内APOBEC3G的mRNA水平变化,Western blot分析APOBEC3G蛋白水平的表达;分别构建不同长度的含有IRF-E(IFN regulatory factor element)位点的APOBEC3G起始密码上游序列报告质粒、不含IRF-E和IRF-E位点突变的虫荧光素酶报告质粒,报告基因分析IFN-α刺激后APOBEC3G起始密码上游IPF-E位点对APOBEC3G表达的影响。结果IFN-α上调HuH7细胞APOBEC3G mRNA和蛋白水平的表达,并具有剂量依赖的效应。序列分析发现APOBEC3G起始密码上游的-298～-283和-57～-47位碱基分别存在IRF-E和ISRE(IFN stimulated re- sponse element)序列。报告基因分析结果显示,干扰素使含有IRF-E序列的APOBEC3G启动子报告质粒的虫荧光素酶的活性增加6～8倍,而不含IRF-E序列和IRF-E位点突变的报告质粒的虫荧光素酶活性在干扰素刺激后几乎没有变化。结论IFN-α可通过IRF-E位点上调APOBEC3G mRNA和蛋白水平的表达,从而发挥抗病毒效应。     

PRL-1基因3’UTR荧光素酶报告基因载体及突变体的构建

目的针对促肝细胞再生磷酸酶1（phosphatase of regenerating liver-1,PRL-1）3’端非翻译区（3-untranslate．dregion,3’UTR）构建PRL-1荧光素酶报告基因载体及突变体,为研究miR-339-5p在结肠癌中调控其靶基因PRL-1提供有效的工具。方法PCR扩增包含PRL-1的3’UTR的DNA片段,克隆至荧光素酶载体psiCHECK-2,构建psiCHECK-2／PRL-13’UTR载体;经双酶切及测序鉴定后,对psiCHECK-2／PRL-13’UTR重组质粒“种子区”的7个碱基进行定点突变．构建psiCHECK-2／PRL-13＇UTR突变载体。结果克隆获得的psiCHECK-2／PRL-13＇UTR载体中DNA片段大小及序列与Gen-Bank报道的一致,且插入方向正确。“种子区”的7个碱基定点突变成功。结论成功构建了含PRL-1基因3＇UTR区的荧光素酶报告基因载体及突变体,可用于后续功能研究。     

SLE患者外周血DC的表面标志及其分泌IL-12 和IFN-α的研究

目的:分析SLE患者外周血中树突状细胞(DC)的表面标志,探讨DC和SLE发病之间的关系。方法:采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),在培养瓶中贴壁培养3h,吸去悬浮的细胞,联合应用GMCSF、IL4和TNFα刺激正常人及SLE患者外周血DC的增殖及分化成熟。用流式细胞仪分析DC的表面标志,用ELISA法检测培养9d的培养上清中IL12和IFNα的水平。结果:SLE患者DC表面CD1a、CD11c、CD40、CD83和CD123表达的阳性率,分别为:(58.88±7.64)%、(54.4±10.88)%、(37.29±8.08)%、(57.76±11.54)%和(13.14±4.44)%;健康志愿者(对照组)分别为:(47.71±4.01)%、(43.12±8.82)%、(28.59±7.07)%、(48.31±8.79)%和(9.85±3.97)%,两者相差明显(P<0.05)。SLE患者DC上CD80表达的阳性率为(55.16±10.12)%与对照组[(47.95±12.21)%]相差不明显(P>0.05)。培养上清中IL12的水平[(9.78±0.76)ng/L],较正常对照组[(7.49±0.74)ng/L]明显升高(P<0.05);SLE患者组IFNα的水平为[(2.95±0.61)ng/L]与对照组[(2.70±0.29)ng/L]相比升高不明显(P>0.05)。SLE患者非活动期与活动期培养上清中IL12和IFNα的水平无明显差异。结论:SLE患者的DC可能是通过其抗原递呈功能的增强及分泌IL12而参与本病的发病过程。     

NZB/W狼疮鼠体外IFN-α信号调控网络研究

通过IFN-α刺激基因(ISG)表达谱勾画SLE发病机制中可能的IFN-α异常调控通路。采用基因芯片技术,比较分析发病前新西兰黑/白(NZB/W)F1代狼疮鼠和年龄性别相匹配的对照组BALB/c小鼠脾脏单个核细胞3 h干扰素刺激基因表达谱,并运用信号通路分析软件(CRSD)解析IFN-α信号调控网络。结果:IFN-α体外刺激诱导上调了BALB/c小鼠而非NZB/W狼疮鼠脾脏单个核细胞p53通路相关基因转录产物的表达;IFN-α共同诱导了NZB/W狼疮鼠和BALB/c小鼠Th1型细胞因子和趋化因子网络,相对于BALB/c鼠,IFN-α刺激后IL15、IP10、XCL1、CCL3、CCL7及CCL12的转录产物在NZB/W狼疮鼠中高表达(P值均<0.01)。NZB/W狼疮鼠对IFN-α抑制细胞增殖作用和促炎作用的异常反应,参与并加重了NZB/W狼疮鼠自身免疫性疾病的进展。     

Graves′病患者IL-6、TNF-α、IFN-γ水平治疗前后的变化及其临床意义

对Graves′病患者, 用放射免疫分析法(RIA)测定了IL-6和TNF-α, 用双抗体夹心ELISA法测定了IFN-γ.Graves′病患者的IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均高于对照者.治疗后, IL-6水平降至正常, 而TNF-α、IFN-γ水平仍高于对照者.提示: IL-6水平与病情变化相平行, 而TNF-α、IFN-γ水平仍较高.