布鲁杆菌Cu-Zn SOD和GroEL的克隆表达及细胞免疫特性比较分析

目的 分析比较布鲁杆菌两种外膜蛋白Cu-Zn SOD和GroEL的细胞免疫特性.方法 以布鲁杆菌16M基因组为模板,PCR扩增Cu-Zn SOD和GroEL蛋白的基因序列.采用Gateway方法构建表达载体,在大肠埃希菌中诱导表达并纯化,用获得的纯化蛋白刺激减毒活疫苗S19免疫小鼠的脾细胞,并测定细胞上清中IFN-γ的水平.结果 成功克隆表达了Cu-Zn SOD和GroEL蛋白,用这两种蛋白刺激S19免疫小鼠脾细胞后,细胞上清中的IFN-γ水平明显升高,并且GroEL刺激后的IFN-γ水平高于Cu-Zn SOD刺激后的IFN-γ水平.结论 GroEL和Cu-Zn SOD蛋白均具有细胞免疫反应特性,且GroEL的细胞免疫反应特性强于Cu-Zn SOD.     

抗Erbin特异性单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗Erbin单克隆抗体.方法:应用基因工程技术构建含Erbin PDZ序列的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)以获得重组蛋白的表达;采用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白;通过质谱鉴定重组蛋白;利用纯化的重组蛋白免疫小鼠,通过细胞融合技术制备单克隆抗体.结果:构建了原核表达载体pET-28a(+)-Erbin PDZ,获得了重组蛋白在工程菌中的高效表达.通过对以包涵体形式存在的重组蛋白进行洗涤、溶解、复性和纯化,获得了纯度在90%以上的重组蛋白.经质谱鉴定确证表达的重组蛋白为Erbin PDZ.用重组蛋白免疫小鼠后,经细胞融合、筛选及鉴定,获得了高效价的单克隆抗体.讨论:该抗体可识别天然状态下的Erbin蛋白,可用于ELISA、免疫荧光和免疫沉淀实验.抗Erbin单克隆抗体的制备为研究Erbin的功能奠定了基础.     

人禽流感HSN1病毒HA1蛋白抗原表位及主要免疫功能区特征的研究

目的 确定人禽流感H5N1病毒HA1蛋白的单克隆抗体(McAb)抗识别表位及主要免疫功能区.方法 将16条人禽流感H5N1病毒HA1基因重叠片段克隆入真核表达载体pDisplay,构建表达HA1蛋白的重叠肽段重组质粒,转染HeLa细胞后制备细胞抗原片.利用灭活的H5N1病毒免疫BALB/C小鼠,制备病毒特异单克隆抗体(单抗)和多克隆抗体(多抗),采用间接免疫荧光法分析单抗、多抗与HA1肽段的反应性.确定HA1蛋白的单抗识别表位及主要免疫功能区.结果 成功克隆、表达了16条不同长度的H5N1肽段,并制备、获得30株分泌抗H5N1型禽流感病毒McAb的杂交瘤细胞株,其中18株为抗HA的单抗,18株中有6株单抗具有中和病毒活性.利用表达的H5N1肽段对单抗识别表位进行分析,初步确定3B5、3D1、3132、M6、M3等18株McAb识别表位区域分别位于氨基酸残基aa133-143、aa155-165、aa166-196、aa166-176、aa34-66及aa296-328之间,其中3B5、3D1、3B2、M6等McAb识别表位为序列依赖型表位,M3和M7等具有中和活性的McAb识别表位为构象性中和表位.结论 利用制备的H5N1病毒特异性McAb和表达的病毒HA1蛋白重叠肽抗原,初步确定了18株抗HA McAb的识别表位和HA1蛋白的主要免疫功能区,为进一步研究开发新型疫苗提供了重要理论依据.     

重组人铜锌超氧化物歧化酶脂质体的制备

应用反相蒸发法制备出重组人铜锌超氧化物歧化酶(rh Cu/Zn SOD)脂质体,其包封率为49.1%,在大鼠体内半衰期为3.45 h,体外模拟胃酸、胃蛋白酶、胰酶耐受力分别为90.3%、86.2%.79.8%;在小鼠体内脾、肝、肺脏中分布最高.     

人肽抗生素hPAB-β重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建人肽抗生素hPAB-β重组质粒,并在大肠杆菌中进行表达,为大量制备hPAB-β奠定基础.方法通过PCR将hPAB-β融合蛋白的CNBr裂解位点改为羟胺裂解,将修改的目标片段克隆到pFAST-HTa质粒中,挑取阳性重组子,酶切出目标片段再亚克隆到pQE32-CP中,含阳性重组子的工程菌用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,进一步以亲和层析纯化融合蛋白,用羟胺裂解分析.结果构建的pFAST-hPAB-β重组质粒经酶切可得到约230bp的片段,与预期大小相符,测序结果表明其序列正确;构建的pQE32-CP-hPAB-β重组表达质粒酶切亦可切出230bp的片段,测序结果表明序列和阅读框均正确;重组表达质粒在大肠杆菌中能表达出Mr约27×103大小的蛋白,表达量约占细菌总蛋白的43%,该融合蛋白以包涵体形式存在,通过亲和层析可获得该蛋白,纯度为80.4%,该融合蛋白经羟胺裂解1h即可得到与合成肽大小相符的小肽.结论本研究成功构建了含hPAB-β重组质粒的工程菌,为进一步研究和大量制备hPAB-β创造了前提.     

人睫状神经营养因子的克隆与原核表达

目的：克隆人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，并探索其在大肠杆菌中高效表达。方法：提取总ＲＮＡ，逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），序列测定正确后原核表达并用制备电泳纯化。结果：克隆了人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，实现了其在大肠杆菌中的高效表达，表达量至少达到２６％，制备电泳纯化后，重组蛋白纯度达到９５％。结论：从胎儿坐骨神经组织中克隆到人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，制备电泳纯化出高纯度的重组蛋白     

长效重组人超氧化物歧化酶的研制及其辐射防护作用

选用无毒、无免疫原性的高分子化合物聚乙二醇(PEG)为修饰剂,以活性酯法制备出PEG- 重组人超氧化物歧化酶(PEG-rh SOD)共价结合物.修饰酶的生物半衰期为15h,比修饰前延长了90倍,对酸、碱、热的耐受力明显高于修饰前.用照射小鼠的活存率评价了PEG-rhSOD的辐射防护作用.小鼠受8.5Gy γ射线照射前1h腹腔注射30万U/kg PEG-rh SOD,可提高活存率42%,与未修饰的rhSOD相比,活存率提高14%.实验仍在进行中.     

咪唑啉受体抗血清选择性蛋白的表达、纯化及单克隆抗体制备

目的:表达和纯化咪唑啉受体抗血清选择性蛋白(imidazoline receptor antiserum-selected protein,IRAS protein),制备IRAS蛋白的单克隆抗体.方法:采用基因重组技术在大肠杆菌表达IRAS蛋白;金属镍螯合的Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以间接ELISA方法筛选分泌特异性IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞;采用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体的特异性.结果:成功表达并纯化了IRAS重组蛋白,纯度达到95%.共筛选出5株分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了IRAS的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体效价分别为1∶ 8×106,1∶ 2×106和1∶ 5×106,属于IgG1亚型.该抗体能与原核及真核系统表达的IRAS重组蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光显示IRAS蛋白主要定位于细胞质中.结论:建立了稳定分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,成功制备了特异性好的IRAS单克隆抗体,为研究IRAS的功能提供了有力的研究工具.     

用单克隆抗体分析鉴定登革3型病毒的不同抗原决定簇

登革病毒(DEN)抗原成分复杂,与许多虫媒披膜病毒都有严重的血清学交叉反应。杂交瘤单克隆抗体(Mcab)技术建立之后,Dittmar等人首先制备出了抗DEN-3病毒的McAb,可进行DEN-3病毒的鉴定分型。随后,Henchal等人制备出了抗DEN1-4型病毒的McAb,用这些McAb进行DEN病毒抗原决定簇研究,依据间接免疫荧光染色(IFA)证实了DEN病毒的四种不同抗原决定簇,即:黄病毒属特异的、DEN-1-4型病毒特异的、DEN-1、3型病毒特异的和DEN病毒各型型特异的。阎国珍等人在研究抗DEN-4病毒McAb时,获得了抗DEN-2、4型病毒特异的McAb,证明DEN-2和DEN-4病毒间有共同特异抗原决定簇。本文介绍通过用抗DEN-3病毒McAb对不同披膜病毒抗原交叉反应测定来分析鉴定     

小分子GnRH-luffinS重组嵌合毒素的制备及其细胞毒性检测

目的:制备以小分子丝瓜素(luffin)S2为毒性部分,以Ⅰ型促性腺激素释放激素(GnRH)为导向部分的重组嵌合毒素GnRH-luffinS,体外检测其对肿瘤细胞的杀伤作用.方法:重叠PCR方法扩增GnRH-luffinS的基因,克隆至表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆诱导表达,产物用Ni-NTA亲和层析柱纯化.纯化蛋白经重组肠激酶(rEK)切割去除Trx融合蛋白,XTT法检测重组毒素对HeLa, A549, HepG-2, SP2/0和鸡胚成纤维细胞(CEF)的体外细胞毒性.结果:成功构建了GnRH-luffinS的表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,纯化后的纯度为93%.GnRH-luffinS对HeLa,A549,HepG-2和SP2/0的IC50分别为67.19, 70.42, 84.44和106.25 μg/ml,而对CEF无作用.结论:重组毒素GnRH-luffinS对肿瘤细胞有一定的杀伤作用.     

抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A, BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合,初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均＞3．0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与BoNT／AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ）,3H3属于IgM（Κ）,而5H8属于IgG2b （Κ）;叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

抗Salmonella minnesota R_(595)菌脂多糖杂交瘤的建立及其抗体特性的初步鉴定

将煮沸致死的R_(595)菌体免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞在PEG介导下与SP_(2/0)细胞融合,经筛选获得2个阳性孔2D_6、3H_4。将2D_6、3H_4阳性孔细胞克隆,传代最终获得8株能稳定分泌抗R_(595)内毒素单抗的杂交瘤株。经鉴定,杂交瘤细胞染色体数90余条,抗体效价(EL1SA法)10~4～10~5,2D_6B_1,2D_6E_7单抗的Ig类型为IgG_1,3H_42F_7、3H_42H_3单抗Ig类型为IgG2_b,轻链均为K链。类脂A抑制试验显示,单抗识别的表位为类脂A或KDO,表明抗体识别内毒素保守区域。间接EL1SA试验表明,抗体能与多种GNB交叉反应,提示抗体具广谱交叉反应性。玻片凝集试验显示,抗体仅能凝集R_(595)菌,不能凝集其它GNB菌。     

CD9类单克隆抗体的研制

本研究用血小板作为免疫原,免疫Balb/C小鼠,并按常规方法进行细胞融合.在筛选时,用血小板、幼稚B细胞(Nalm-6)及EB病毒转化后的人B淋巴母细胞系Raji细胞同时检测杂交瘤细胞上清,仅选与血小板及Nalm-6细胞反应,不与Raji细胞反应的抗体分泌杂交瘤细胞,建立了B9-1、B9-2、B9-3杂交瘤株.根据B9系列抗体与各种血液、造血细胞的反应特点,对通过对肾小球血管内皮及远端曲管上皮反应性及对其相应抗原分子量测定表明,B9系列抗体为CD9类抗体.本系列抗体与某些白血病细胞反应结果表明,与CD10类抗体配伍,可能形成更有效的针对普通型急性淋巴细胞白血病的导向药物.对B9系列抗体在血小板及白血病免疫分型中的研究前景也作了简要讨论.     

人CD81胞外大环在大肠杆菌中的克隆表达及活性研究

目的：构建人CD81分子胞外大环（ED2）的原核表达质粒,并研究胞外大环同HCV E2蛋白的结合性能。方法：从人外周血淋巴细胞中经RT－PCR克隆出CD81胸外大环序列,插入原核表达载体pBVILl中,构建表达质粒pBVILl-EC2并在大肠杆菌中表达。表达产物经纯化后用间接ELISA法测定同E2蛋白的结合能力。结果：经序列测定证明,CD81分子胞外大环正确插入载体。融合蛋白得到高效表达,以包涵体形式存在,经Q－Sepharose FF阴离子交换柱得到有效纯化。初步结果表明,重组CD81胞外大环能同原核表达的截短的HCV E2（384－661）蛋白结合。结论：本研究为进一步研究CD81同E2及HCV的相互作用和制备抗EC2单克隆抗体奠定了基础。     

日本人群中HEV感染的血清学调查

应用纯化的ＨＥＶ（８７Ａ株）热灭活抗原进行ＥＬＩＳＡ试验，测定日本大阪地区收集的１４９例各种肝病患者急性血清中的抗ＨＥＶ抗体、获得１９份阳性（阳性率为１２．７％），其中单纯抗ＨＥＶ ＩｇＭ阳性１１份和抗ＨＥＶ ＩｇＧ阳性６份。两者都阳性的２份。     

Effect of carbohydrate modification on the localization of human polyclonal IgG at focal sites of bacterial infection.

Radiolabeled human polyclonal IgG localizes at focal sites of infection/inflammation. Previous studies have sought to identify the mechanism of localization, but the relative importance of specific antigen recognition by individual antibody molecules, binding to Fc receptors on inflammatory cells and nonspecific processes such as increased tissue permeability remains uncertain. This study was performed to evaluate the specific role of Fc receptor binding as a mechanism of localization. The Fc region of IgG was modified by endoglycosidase-F digestion and periodate oxidation to reduce the binding of IgG to Fc receptors. In-vitro binding was tested in an Fc receptor binding assay using the human monocyte-like cell line, U937. The in-vivo ability of the modified antibodies to localize at focal sites of E. coli infection was tested by biodistribution studied with the 111In-labeled proteins. Modification of the carbohydrate moiety of the Fc region of IgG resulted in a marked decrease in Fc receptor binding in vitro; with antibody concentrations of 1 micrograms/ml (which is presumed to exist at infected sites) showing no binding for endoglycosidase modified IgG and 50% binding for periodate modified IgG. In contrast, in-vivo infection localization as measured by level of accumulation or target-to-background ratio was not significantly effected by carbohydrate modification. These studies suggest that the contribution of Fc receptor binding to IgG localization at sites of infection is minimal.     

抗-HIV单克隆抗体的筛选与鉴定

我们用HIV抗体阳性者血浆包被聚苯乙烯条,加入纯化的HIV组织培养抗原,通过夹心ELISA法,筛选出3株能分泌抗HIV单克隆抗体杂交瘤细胞,传代稳定。培养上清经Western blot染色鉴定含有抗-HIV gag蛋白。夹心ELISA法测得杂交瘤细胞培养上清中单克隆抗体滴度达到1∶6400,接种BALB/C小鼠获腹水抗体效价为1∶2430000。实验表明,用此单克隆抗体检测HIV病人血清抗体敏感、特异、稳定、重复性好,是一种良好的试剂。     

抗人IgK和Igλ链单克隆抗体的制备及临床初步应用

用初乳和血清IgA免疫Balb/c小鼠的脾细胞与SP_2/O和NS-1瘤细胞融合,以ELISA双抗原夹心法检测获得5株杂交瘤细胞。其中3株(1D1、5C3、11A7)分泌抗人游离和结合型λ轻链;2株(4G12、14A6)分泌抗人游离和结合型K轻链。4G12与结合型K链反应比游离K链好。这些细胞株在长达1年的培养中仍能稳定分泌特异性单克隆抗体,经液氮冻存10个月后杂交瘤细胞仍保持原有的特性。用固相抗原竞争ELISA试验表明,两个抗K链McAb是针对不同的抗原位点,而3株抗λ链则针对相同的抗原位点。用于检测副蛋白和本周氏蛋白具有很好的特异性和敏感性。把McAb4G12-HRP和1D1-HRP混合,用于检测-EB病毒早期抗原(EA)和壳抗原(VCA)抗体被证明是满意的,同时试用于抗核抗体的检测也获得了初步的结果。     

人白细胞介素17的多克隆抗体制备与单抗杂瘤的筛选

目的：制备重组人IL－17的兔抗血清并纯化,克隆化筛选IL－17的阳性杂交瘤克隆。方法：应用纯化的IL－17程序免疫家兔,得到兔抗人IL－17的抗血清;采用盐析法和亲和层析法对兔抗血清进行纯化,应用纯化的IL－17免疫小鼠,将其脾脏与骨髓瘤细胞SP2／0融合,采用有限衡释法和克隆化筛选阳性杂交瘤克隆,抗体的检测分别用脂糖双向扩散试验法和酶联免疫测定法（ELISA）。结果和结论：纯化得到多克隆抗体2．5ml,IgG纯度大于95％,初步得到5个阳性杂交瘤克隆,可用于以后的深入研究。     

CT抗原NY-ESO-1基因克隆、表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达人CT抗原NY-ESO-1,对表达产物进行Western印迹鉴定和纯化,为今后利用其进行肿瘤疫苗的研究奠定基础.方法:通过全基因拼接获得NY-ESO-1基因,构建重组表达载体NY-ESO-1-pET28a( ),在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG诱导获得表达,利用单克隆抗体进行Western印迹鉴定,通过Ni柱亲和纯化获得纯化蛋白.结果与结论:拼接的NY-ESO-1全基因经测序证明与GenBank中人的NY-ESO-l全基因完全相符;构建的原核表达载体NY-ESO-1-pET28a( )可稳定地可溶性表达NY-ESO-1蛋白;经Ni柱亲和纯化获得较好的纯化结果;利用鼠抗人单克隆抗体对表达的蛋白进行验证,结果显示阳性.本研究成功利用原核表达系统实现了对CT抗原NY-ESO-1的可溶性表达.