应用重组分泌型内皮抑素腺相关病毒治疗膀胱癌的实验研究

目的包装重组分泌型内皮抑素腺相关病毒（rAAV-ES）并研究其在体内外的抗肿瘤作用。方法采用质粒共转染方法包装rAAV—ES;转染（感染复数MOI=10^5）膀胱癌细胞（EJ）后,ELISA法测定上清液中重组内皮抑素的浓度并检测其对血管内皮细胞趋化运动的抑制作用;建立裸鼠肿瘤模型,检测EJ细胞被转染后的成瘤率及全身应用rAAV-ES后抑制肿瘤发展的作用及其毒副作用。结果成功包装具有生物活性的rAAV-ES,病毒滴度为1．0×10^12v·g／ml;转染EJ细胞后上清液中重组内皮抑素浓度为54．09ng／ml,对血管内皮细胞趋化运动的抑制率为37．45％;被rAAV-ES转染后EJ细胞的成瘤率仅为对照组的2／5,体内实验证实全身应用rAAV-ES后血清中内皮抑素长期高效表达（30～40ng／ml）,肿瘤生长速度慢（32d±9d）,瘤体微血管密度低[（8±3）条／0．739mm^2],与对照组比较,差异有统计学意义（均P〈0．05）,心脑组织学检查未见缺血和其他异常改变。结论rAAV-ES无毒副作用,可有效地抑制肿瘤的血管生成,从而抑制膀胱癌的发生、发展,其成功包装为原位基因治疗膀胱癌奠定了基础。     

应用重组分泌型内皮抑素腺相关病毒治疗肾细胞癌

【目的】研究重组分泌型内皮抑素腺相关病毒（rAAV—Endostatin，rAAV—ES）的抗肿瘤血管生成及抑制肾细胞癌进展的作用。【方法】应用rAAV—ES转染肾癌细胞，ELISA法测定上清液中重组内皮抑素的浓度并检测其对血管内皮细胞趋化运动的抑制作用；建立裸鼠肿瘤模型，检测肾癌细胞被感染后的成瘤率及全身应用rAAV—ES后抑制肿瘤发展的作用及其毒副作用。【结果】RCC细胞感染rAAV—ES后上清液中重组内皮抑素浓度为52．67ng／ml，对血管内皮细胞趋化运动的抑制率为38．13％；转染rAAV—Es后的肾癌细胞成瘤率为对照组的60％，体内实验证实全身应用rAAV—ES后血清中内皮抑素长期高效表达，肿瘤生长速度减慢，瘤体微血管密度变低，心脑组织检查未见缺血和其他病理改变。【结论】rAAV—ES无毒副作用，可有效地抑制肿瘤的血管生成，从而抑制肾细胞癌的发生和发展。     

联合自杀基因及内皮抑素基因双靶点治疗膀胱癌的实验研究

目的 探讨基因重组腺相关病毒自杀基因及内皮抑素(KS)联合基因治疗膀胱癌的效果.方法 (1)通过重组腺相关病毒(rAAV)-增强绿色荧光蛋白(EGFP)转染膀胱肿瘤T24细胞,来确定rAAV对该细胞的转染情况及转染效率;(2)通过rAAV-胸苷激酶(TK)-核糖体插入位点(IRES)-ES(简称rAAV-TIE)体外转染T24膀胱肿瘤细胞及人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞),应用MTT法、流式细胞仪等方法 来检测其对T24细胞及HUVEC细胞凋亡的诱导作用;(3)构建裸鼠膀胱癌模型,分析rAAV-TIE联合基因治疗膀胱癌的体内效果.结果 (1)rAAV-EGFP转染T24细胞后可以表达携带的外源基因EGFP;(2)rAAV-TK、rAAV-TIE转染T24细胞72 h后,流式细胞仪检测结果 显示,rAAV-TK、rAAV-TIE两组凋亡率分别是34.12%和36.91%,明显高于空病毒转染组[rAAV-多克隆位点(MCS)组](3.08%)和空白对照组(0.84%);(3)瘤内注射rAAV-KS、rAAV-TK、rAAV-TIE大约9 d后,肿瘤生长受到显著抑制,治疗结束后:各组肿瘤的体积分别是:rAAV-Es组(0.75±0.08)cm3、rAAV-TK组(0.71±0.11)cm3、rAAV-r11E组(0.52±0.09)cm3、rAAV-MCS组(1.27±0.13)cm3和空白对照组(1.24±0.17)cm3,除rAAV-ES组与rAAV-TK组间比较差异无统计学意义外,其余组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05).结论 体外和体内实验表明rAAV-TIE可有效抑制膀胱癌的血管生成和肿瘤的生长,能够双靶点基因治疗膀胱肿瘤.     

重组小鼠血管抑素基因转染抗血管生成治疗胆囊癌的实验研究

目的:研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白,以及对裸鼠种植性胆囊癌生长的抑制作用. 方法:应用脂质体lipofectamine2000将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒pcDNA3.1( )-angiostatin转染胆囊癌细胞株GBC-SD,G418抗性筛选;以Western blot检测血管抑素的表达,以血管内皮细胞增殖分析检测其生物学活性,接种裸鼠并比较肿瘤体积和肿瘤微血管密度(MVD). 结果:得到表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖(P＜0.01);血管抑素组裸鼠肿瘤体积小于野生细胞对照组(P＜0.01),免疫组化检测显示血管抑素组裸鼠肿瘤微血管密度(MVD)低于野生细胞对照组(P＜0.05). 结论:血管抑素基因转染对裸鼠种植性胆囊癌的生长有抑制作用,这是血管抑素组肿瘤组织内新生血管形成受到抑制而减少所致.     

重组分泌型内皮抑素腺相关病毒的包装及在膀胱癌EJ细胞系中的表达

目的:包装重组分泌型内皮抑素腺相关病毒(rAAV-Endostatin)制备内皮抑素原位基因治疗膀胱癌的基因载体药物。方法:采用分子生物学方法构建腺相关病毒质粒载体(pAAV-IgG-Endostatin),酶切、测序鉴定;经质粒共转染方法包装rAAV-Endostatin,测定病毒颗粒滴度并电镜下鉴定;转染膀胱癌EJ细胞后,ELISA法测定重组内皮抑素的浓度。结果:pAAV-IgG-Endostatin的构建和rAAV-Endostatin的包装均获成功,病毒滴度达1.0×1012v.p/ml。感染EJ细胞后内皮抑素成功表达并分泌,上清液中浓度达54.09ng/ml。结论:rAAV-Endostatin载体的构建、包装与表达的成功为rAAV-Endostatin原位基因治疗膀胱癌的实验研究奠定了基础。     

应用重组内皮抑素腺相关病毒抑制内皮细胞趋化运动

【目的】检测重组内皮抑素腺相关病毒(rAAV-Endostatin)感染膀胱癌细胞后内皮抑素的分泌及其对内皮细胞趋化运动的抑制作用,为rAAV-Endostatin抑制膀胱癌血管生成基因治疗提供依据。【方法】以rAAV-Endostatin感染膀胱癌EJ细胞,24 h后ELISA法测定上清液中内皮抑素浓度;以该上清液为条件介质,Tran-swell法检测其对血管内皮细胞趋化运动的抑制作用。【结果】rAAV-Endostatin转染EJ细胞后上清液中内皮抑素浓度为54.09 ng/ml,经Transwell检验,该上清液对血管内皮细胞趋化运动的抑制率为37.45%。【结论】rAAV-Endostatin是介导内皮抑素基因治疗的有效载体,为膀胱癌的原位基因治疗奠定了基础。     

携带人分泌型内皮抑素基因重组腺病毒的制备和鉴定

目的制备包含人分泌型内皮抑素基因的重组腺病毒,为下一步探讨其在血管生成依赖性疾病的治疗研究中的应用提供基础。方法以T-Endostatin质粒为模板,通过PCR扩增回收hEndostatin,将hEndostatin连接到pShuttle2中,构建pShuttle2-hEndostatin表达质粒,将此表达质粒连接到缺陷型腺病毒载体,构建Ad-hEndo。其线性化后转染HEK293T细胞,纯化后的重组腺病毒Ad-hEndo在HEK293T细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,并测定其滴度。结果利用PCR反应进行鉴定,扩增得到的hEndostatin经酶切鉴定,DNA测序证实为重组腺病毒,测定病毒滴度为5.2×109PFU/ml。结论本实验成功构建了人分泌型内皮抑素重组腺病毒Ad-hEndo,可直接用于血管生成依赖性疾病基因治疗的实验研究。     

重组分泌型内皮抑素抑制兔角膜新生血管形成的实验研究

目的:研究重组分泌型内皮抑素(endostatin)对兔角膜新生血管的抑制作用。方法:利用角膜缝线法诱导兔角膜新生血管形成。在缝线后第1天,将重组内皮抑素和生理盐水分别注射于兔球结膜下,观察角膜新生血管生长状况及组织病理学改变。结果:重组内皮抑素治疗组新生血管长度及生长面积明显少于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);光镜下,治疗组与对照组比较,基质层新生血管少,管腔小,浆细胞及成纤维细胞少。结论:球结膜下注射重组内皮抑素可有效抑制兔角膜新生血管的形成,为临床上角膜新生血管的防治提供新的方法。     

重组人血管内皮抑制素联合放化疗治疗局部晚期头颈部鳞癌

目的 分析重组人血管内皮抑制素注射液 (恩度) 联合放化疗治疗局部晚期头颈部鳞癌的疗效及安全性.方法 收集自2011年7月至2014年6月云南省肿瘤医院收治的局部晚期头颈部鳞癌患者病例资料.放化疗联合恩度组 (恩度组) 有46例患者, 放化疗组 (对照组) 有45例患者.分析比较2组近期疗效及毒副反应比, 总生存率 (OS) 、无疾病进展期 (PFS) .采用美国华盛顿大学生活质量评估比较2组生活质量.结果 恩度组与对照组客观反应率分别为87.0%和75.6% (χ2=1.946, P>0.05) , 疾病控制率分别为97.8%和95.6% (χ2=0.368, P>0.05) .恩度组与对照组的中位PFS分别为18.7月和14.7月 (P<0.05) , 中位OS分别为26.8月和23.6月 (P>0.05) , 恩度组与对照组各项不良反应发生率相近.恩度组生活质量评估在心情、焦虑、总分方面高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) .结论 恩度联合放化疗治疗局部晚期头颈部鳞癌过程中, 在一定程度上增加疗效, 延长了无疾病进展期, 同时不增加不良反应发生率, 提高一定生活质量, 但对于患者的生存期获益仍需进一步研究.     

重组人内皮抑素提取方法的优化及其对膀胱癌的抑制作用

目的 摸索重组人内皮抑素(rhES)蛋白的最佳表达条件.探索内皮抑素(Es)对膀胱癌实体肿瘤及细胞系的抑制作用.方法 分别从不同异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、加IPTG 时机、表达时间等几个方面对 rhES 的蛋白表达条件进行摸索和优化.活性检测:(1)动物实验:观察内皮抑素对裸鼠皮下移植瘤的生长情况的影响.(2)细胞实验:MTT法、肿瘤细胞生长曲线观察内皮抑素对T-24膀胱癌细胞系的作用.结果 rhES 在大肠杆菌中的表达量占总菌体蛋白的58.65%,纯化后的蛋白纯度为96.22%.动物实验:rhES的抑瘤率为66.8%.细胞实验:MTT实验中rhES的半数抑制浓度IC_(50)=22μg/ml;肿瘤细胞生长曲线表明第7天时rhES组的细胞数比对照组减少了58.75%.结论 本实验所优化的最佳表达条件可获得高表达、高活性的rh Es蛋白,Es不但对裸鼠接种的膀胱癌有抑制作用,对膀胱癌细胞系也有抑制作用.     

动脉化疗栓塞术联合膀胱灌注治疗中晚期膀胱癌

目的探讨动脉化疗栓塞术和腔内化疗联合应用在中晚期膀胱癌治疗中的价值。方法对28例经病理证实的膀胱癌患者采用“夹心面包法”同时行双侧膀胱肿瘤供血动脉化疗栓塞,化疗栓塞后7天进行膀胱腔内灌注化疗;对于膀胱癌伴有良性前列腺增生者采用导丝引导4F导管插入法实施膀胱灌注。结果28例患者在化疗栓塞后血尿即减轻或消失;随访24～38个月,平均30个月,其中完全缓解率39．3％(11／28),部分缓解率46．4％(13／28),有效率为85．7％,死亡2例。1、2年带瘤生存率分别达100％、92．9％。结论动脉化疗栓塞术联合膀胱腔内化疗是中晚期膀胱癌安全有效的姑息性治疗方法;对于膀胱癌伴有良性前列腺增生者导丝引导4F导管插入法是实施膀胱灌注的简便易行的新方法。     

紫杉醇膀胱灌注抑制大鼠膀胱癌生长的机制

目的探讨紫杉醇连续膀胱灌注对大鼠膀胱肿瘤生长的作用和机制。方法将40只雌性Wistar大鼠,随机分为对照组(n=20)和紫杉醇组(n=20),制作N-甲基亚硝基脲诱导大鼠原位膀胱癌模型,于第8周分别行生理盐水和紫杉醇制剂连续膀胱灌注,每周1次,共6次。于第14周进行病理观察、测量膀胱总重量,微血管密度(MVD)和凋亡指数(AI)。结果第14周时,对照组(n=16)和紫杉醇组(n=12)大鼠膀胱均可见明显肿物,光镜下可见癌组织侵入肌层。紫杉醇组大鼠膀胱的重量和肿瘤的MVD小于对照组(P<0.01);紫杉醇组大鼠膀胱肿瘤的AI大于对照组(P<0.01)。结论紫杉醇连续膀胱灌注可抑制大鼠膀胱肿瘤生长,可能与抑制肿瘤血管生长和诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

膀胱癌基因治疗的回顾及展望

多发、难治和术后复发率高是膀胱癌的特点.目前的治疗以手术切除和放、化疗为主,但均无法取得理想的效果,近年来新兴的基因治疗被寄予了厚望.恶性肿瘤的基因治疗已成为当前临床肿瘤研究的热点,作者就膀胱癌的基因治疗情况作一回顾及展望.     

吡喃阿霉素联合卡介苗灌注预防膀胱肿瘤复发的效果观察及尿中IL-8变化的研究

目的：比较吡喃阿霉素（tetrahydropyranyl-doxorubicin ,THP）加卡介苗（bacillus calmette-guerin ,BCG）与单用BCG膀胱灌注预防膀胱肿瘤复发的效果及灌注引起的副作用,测定灌注前后白细胞介素8（interleukin-8,IL－8）的变化,并探讨IL-8变化与药物灌注预防肿瘤复发效果之间的关系。方法：将62例原发膀胱肿瘤患者随机分为2组,于膀胱部分切除术后分别给予THP联合BCG（联合用药组）及单用BCG膀胱灌注（单用BCG组）,于术前、术后2周、1～6次BCG灌注后2?h留取尿液标本,采用酶联免疫（ELISA）法测定IL-8的含量。术后定期行B超、膀胱镜及尿细胞学检查,监测膀胱肿瘤复发情况。并对联合用药与单一用药预防肿瘤复发的效果,灌注引起的副作用及IL-8的变化情况进行观察及统计学分析。结果：联合用药组复发率明显低于单用BCG组,两组灌注后副作用发生率及严重程度差异无统计学意义（P＞0.05）。两组灌注后尿中IL 8的含量均有明显的变化,但两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。无复发患者灌注后尿中IL-8含量明显高于复发者。结论：THP联合BCG膀胱灌注可有效降低膀胱肿瘤复发率,且不增加灌注引起的副作用。这一效果是作用机制不同的药物的叠加作用,而不是化疗药物对免疫药物疗效的放大作用。BCG灌注后尿中IL-8有明显的升高,且变化程度与肿瘤复发相关。     

卡介苗与白介素-2联合应用预防浅表性膀胱癌复发疗效观察

目的：提高浅表性膀胱癌治疗效果，降低膀胱癌术后复发率。方法：对48例浅表性膀胱癌局部手术后随机分为2组。每组24例，分别采用卡介苗(BCG) 白介素-2(IL-2)和单用丝裂霉素(MMC)进行膀胱灌注。结果：48例随访12个月—36个月(平均20个月)，卡介苗组有2例肿瘤复发，丝裂霉素组有8例肿瘤复发，二组肿瘤复发率差别有显著性意义。结论：卡介苗(BCG)联合IL-2预防浅表性膀胱癌术后复发疗效较好，副反应较少，临床应用安全可靠。     

小剂量丝裂霉素膀胱灌注预防膀胱癌术后复发

目的探讨小剂量丝裂霉素膀胱灌注预防膀胱癌术后复发的疗效及安全性。方法回顾性分析104例接受保留膀胱术式治疗的膀胱癌患者临床资料，其中62例接受小剂量丝裂霉素素C（4mg／次）膀胱灌注治疗，42例接受标准荆量（40mg／次）膀胱灌注治疗。随访时间5年。结果两组术后5年复发率差异无显著性，但小剂量膀胱灌注疗法并发症远少于后者。结论小荆量丝裂霉素C可以有效地预防膀胱癌术后复发，同时减少了细胞毒性药物膀胱灌注的副作用，是一种安全、有效的预防膀胱癌术后复发的治疗手段。     

术中放射治疗在膀胱癌治疗中的应用分析

目的：探讨术中放射治疗膀胱癌的临床疗效。方法选择2002-2010年收治的62例膀胱癌患者,随机分成两组,其中治疗组32例,对照组30例,治疗组患者手术中给予放射治疗,对照组患者给予单纯手术治疗,比较两组患者总生存率、无复发生存率、无远处转移生存率以及住院时间。结果两组患者随访均超过3年,随访率均为100.00%,两组间总生存率、无复发生存率及无远处转移生存率均有统计学差异（均P＜0.05）,住院时间无统计学差异（P＞0.05）。结论术中放射治疗膀胱癌疗效显著,可有效提高无复发生存率、无远处转移生存率及总生存率,且不增加术后住院时间,值得在临床上推广使用。     

丝裂霉素与卡介苗联合灌注预防表浅膀胱癌术后复发的疗效观察

目的评价丝裂霉素（MMC）和卡介苗（BCG）联合灌注预防表浅膀胱癌术后复发的疗效。方法110例患者经病理检查确诊为表浅移行细胞癌,接受经尿道切除手术（TUR）。术后分为2组：A组为联合诱导组（59例）,术后6h内及术后1周、2周分别行膀胱腔内灌注MMC,术后3周开始BCG诱导加维持膀胱腔内灌注治疗（BCG“6＋3”疗法）。B组为单纯BCG组（51例）,术后3周开始接受BCG“6＋3”疗法。定期行膀胱镜和尿脱落细胞学检查,观察2组患者的肿瘤复发和毒副反应情况。结果经过12—70个月,中位35个月随访,A组9例患者肿瘤复发（9／59,复发率15．3％）,B组17例患者肿瘤复发（17／51,复发率33．3％）,2组复发率有显著性差异（P〈0．05）;2组肿瘤进展发生率均低,差异不显著;2组膀胱炎的发生率分别为39．0％、35．3％,差异无显著性意义。结论经尿道膀胱肿瘤切除术后早期MMC膀胱灌注加BCG定期灌注预防表浅膀胱癌术后复发疗效较好,且比较经济,未增加毒副反府发生率．临床使用安全可靠。