液质联用鉴定重组人血管内皮抑制素

目的：用液质联用技术鉴定重组人血管内皮抑制素（rhEndostatin）。方法：利用ESI—Q—TOF—MS法测定rhEndostatin的精确相对分子质量，通过HPLC—ESI—Q—TOF—MS／MS法测定其胰蛋白酶酶切后肽段的部分氨基酸序列并结合数据库检索进行结构鉴定。结果：重组人血管内皮抑制素的实测相对分子质量为21114．5，与理论相对分子质量21113．8相比非常接近。HPLC—ESI—Q—TOF—MS／MS测定m／z802．0的肽段的部分氨基酸序列为Ala—Pro—Ser—Ala-Thr—Gly—Gin—Ala—Ser—Ser—Leu—Leu。将其m／z和氨基酸序列在MASCOT数据库检索，结果表明重组人血管内皮抑制素的结构正确。结论：液质联用是鉴定蛋白质的灵敏、快速、准确的新方法。     

重组人纽兰格林二硫键分析

目的：应用多种质谱技术确证重组人纽兰格林（rhNRGL）的一级结构及其二硫键定位。方法：（1）利用Q—FT—MS测定rhNRGL二硫键还原前后的精确相对分子质量，确定分子中二硫键数目；（2）应用MALDI—TOF／TOF—MS法测定rhNRGL的N端序列；（3）用ESI-MS／MS法测定rhNRGL的C端序列；（4）通过Trypsin和Glu—C2种蛋白酶进行酶解，获得肽质量指纹谱，确证其序列及定位3对二硫键。结果：（1）测定rhNRGL还原前后的精确相对分子质量，两者相差6．0516，确证其主成分形成了3对二硫键；（2）串联质谱法测定rhNRGL的N端序列的5个氨基酸和C端序列的11个氨基酸，均与理论序列一致；（3）2种酶切肽谱的序列覆盖率分别为82％和64％，分析确证主成分二硫键配对正确，但同时存在少量错配二硫键异构体。结论：以上结果表明，该样品的一级结构正确，主要二硫键模式为：1—3，2—4，5—6。多肽药物的二硫键分析常常需要多种质谱及样品制备技术联合。     

奥曲肽一级结构的确证

目的：对奥曲肽(人工合成8肽)的一级结构进行确证。方法：采用：HPLC法测定了奥曲肽的氨基酸组成，采用：Edman降解法测定了除苏氨醇外的7个氨基酸的序列，采用ESI—MS／MS对奥曲肽的分子量以及C—末端的苏氨醇残基进行了确证。结果：采用HPLC法测得除色氨酸以外，样品的氨基酸组成与理论值基本一致。采用Edman降解法测得除苏氨醇外其余7个氨基酸序列与理论结构一致。采用ESI—MS／MS测得样品的相对分子质量为1018．7，与理论值1019．3基本符合。对二级质谱碎片的解析确证样品C—末端确为苏氨醇残基。结论：本文对奥曲肽的C—末端苏氨醇残基以及一级结构全序列进行了确证。     

液相色谱-串联质谱法研究重组水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的一级结构

利用液质联用研究重组水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的一级结构。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的相对分子质量；采用液质联用分别分析HV12p-rPA的胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)酶解产物。MALDI-TOF-MS测得HV12p-rPA的相对分子质量为41 472 Da，与理论值相符；HV12p-rPA的胰蛋白酶(trypsin)酶解产物进行液质联用分析结果表明该融合蛋白中含有瑞替普酶序列；HV12p-rPA的胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)酶解产物进行液质联用分析，结果表明融合蛋白中含有水蛭素12肽，并检测出融合蛋白中的链接肽(DEGGGSY)，融合蛋白的N末端MASDF和C末端LDWIRDNMRP；采用液质联用进行肽图分析，识别出的多肽匹配度Xcorr均超过1.5，部分多肽的Xcorr超过3.0，表明本实验测定过程中多肽识别结果准确可靠；目标蛋白的氨基酸序列覆盖率超过85%。结果确定了HV12p-rPA融合蛋白的序列与理论值相符。     

液质联用技术（LC-MS）在rh-PTH（1-34）肽图确定中的应用

目的：建立可用于质量控制的rh—PrrH（1—34）的标准胰酶肽图分析方法，并确定其理论肽图。方法：用胰酶动态酶切rh—PTH（1—34）探索最佳肽图分析条件，利用氨基酸特征吸收波长色谱分析结合LC—MS相对分子质量分析确证理论肽图。结果：多批rh—PTH（1—34）原液经胰酶解、RP—HPLC分析后，可产生4个主要肽段，其图谱与人工合成的hPTH（1—34）对照品一致；确定其理论肽图为：T1-HLNSMER、T2-LQDVHNF、T3-VEWLR、T4-SVSElQLMHNLGK。结论：建立的胰肽图分析方法可用于rh—PTH（1—34）产品的质量控制，用氨基酸特征吸收波长分析辅助LC—MS相对分子质量分析可有效用于rh—PTH（1—34）的标准肽图确定。     

液质联用分析重组人白细胞介素-11的肽图

目的用液质联用技术分析鉴定重组人白细胞介素-11(rhIL-11)的肽图。方法用胰蛋白酶酶解rhIL-11，采用HPLC测定肽图，用电喷雾-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF/MS)技术分析肽段的精确相对分子质量，通过串联质谱(MS/MS)测定肽段的氨基酸序列。结果根据肽段的色谱保留时间、相对分子质量及对其碰撞诱导解离质谱的解析结果，归属出肽图中各肽段所在的色谱峰，已检出肽段的总覆盖率为97%。结论液质联用研究肽图是验证和分析蛋白质结构的高效准确的方法。     

重组L-天门冬酰胺酶II的液相色谱/电喷雾离子化质谱法分析

目的　对基因重组L-天门冬酰胺酶II产品进行一级结构分析。方法　采用流动注射方式,电喷雾离子化质谱法测定分子量;三氯乙酸变性,胰蛋白酶水解后,HPLC测定肽图谱;结合质谱源内碰撞诱导解离技术,解析酶解肽段的氨基酸顺序。结果　分子量测定值与理论值不符,质谱解析表明样品中存在3个氨基酸变异现象,由此计算的分子量与测定值吻合。结论　液相色谱/电喷雾质谱法为基因重组蛋白质药物的一级结构分析和质量控制提供了新途径。     

依替巴肽一级结构的确证

目的:对合成的依替巴肽一级结构进行确证。方法:采用串联质谱序列分析法测定了氨基酸序列,采用 ESI-MS/MS 对依替巴肽的相对分子质量和肽链环化结构进行了确证,采用~1 HNMR 进一步确定了依替巴肽的结构。结果:串联质谱序列分析法,证实合成肽氨基酸序列和非天然氨基酸结构正确;ESI-MS/MS 测得样品准确的相对分子质量为831.48,与依替巴肽的参照品及理论值(831.96)完全一致;质谱分析确证合成依替巴肽分子内形成了一个正确的二硫键;~1 HNMR 进一步确定了依替巴肽分子的一级结构。结论:本文对依替巴肽的氨基酸序列以及一级结构全序列进行了确证。     

重组人干扰素αdb质量肽图分析及二硫键定位

目的：液质联用绘制重组人干扰素αlb的质量肽图并鉴定二硫键位点。方法：LC-MS联用绘制重组人干扰素αlb的胰蛋白酶酶切质量肽图；对比特定肽段的实测相对分子质量与理论相对分子质量初步定位二硫键，对比烷基化及还原烷基化处理后特定肽段实测相对分子质量的变化确证二硫键位点。结果：重组人干扰素αlb的质谱测定相对分子质量为19382．50，与理论相对分子质量19382．18一致，其质量肽图中共发现16个匹配肽段，有3个理论酶切片段（单一氨基酸：Lys135、Lys165、Glu166）未发现，氨基酸覆盖率为98．2％。通过分析胰蛋白酶酶切质量肽图，发现主要存在2种二硫键连接方式：Cys29-Cys139、Cys86-Cys99，同时还存在少量其他二硫键连接方式，如：C1-C99。结论：质量肽图可作为一种对重组蛋白制品进行质量控制的手段，并可定位蛋白中的二硫键。     

电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF2)鉴定重组人FKBP12

目的用最新的生物质谱技术-电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF2)鉴定重组蛋白质rhFKBP12.方法通过ESI-MS测定rhFKBP12分子量及ESI-MS/MS测定其胰蛋白酶酶切后肽段的序列和数据库查寻进行结构鉴定.结果 rhFKBP12的测定分子量为11 820.38,与理论值相比测定误差为0.007%.ESI-MS/MS测定出的两个肽段的部分序列分别为QVETMS和EEGVAQMSV,用这两段序列查寻数据库的结果表明rhFKBP12的结构正确.结论 ESI-MS/MS是鉴定蛋白质的灵敏、快速和准确的新方法.     

LC-MS/MS法对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定

运用液质联用、两种串联质谱对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定, 确证其一级结构。将样品还原烷基化后, 通过胰蛋白酶酶解蛋白, PNGase F去除多肽混合物中糖肽的糖基化, 将去糖后的总肽用于液质联用系统, 通过液相分离后, 运用Q-TOF和线性离子阱两种串联质谱测定各个肽段的b, y碎片离子, 分析测定融合蛋白FP3的氨基酸全序列。通过LC-ESI-Q-TOF完成了融合蛋白FP3的76%氨基酸序列测定, 通过LC-ESI-Trap完成余下24%氨基酸序列测定。液质联用、串联质谱法测定蛋白质氨基酸序列快速、灵敏、准确, 是对重组蛋白结构分析和确证的重要手段。     

重组人干扰素α1b质量肽图分析及二硫键定位

目的:液质联用绘制重组人干扰素α1b 的质量肽图并鉴定二硫键位点。方法:LC-MS 联用绘制重组人干扰素α1b 的胰蛋白酶酶切质量肽图;对比特定肽段的实测相对分子质量与理论相对分子质量初步定位二硫键,对比烷基化及还原烷基化处理后特定肽段实测相对分子质量的变化确证二硫键位点。结果:重组人干扰素α1b 的质谱测定相对分子质量为19382.50,与理论相对分子质量19382.18一致,其质量肽图中共发现16个匹配肽段,有3个理论酶切片段(单一氨基酸:Lys 135、Lys 165、Glu 166)未发现,氨基酸覆盖率为98.2%。通过分析胰蛋白酶酶切质量肽图,发现主要存在2种二硫键连接方式:Cys 29-Cys 139、Cys 86-Cys 99,同时还存在少量其他二硫键连接方式,如:C1-C99。结论:质量肽图可作为一种对重组蛋白制品进行质量控制的手段,并可定位蛋白中的二硫键。     

应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和N端测序鉴定重组人粒／巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）的结构

目的：应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS）和N端测序方法鉴定重组人粒／巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF)的结构。方法：1．用Edman降解法进行N端测序。2．应用MALDI－TOF－MS测定分子量并鉴定纯度。3．通过还原、烷基化确定rhGM-CSF分子中二硫键数目。4．通过蛋白内切酶Glu-C酶切的肽质量指纹谱确证氨基酸序列并确证其中两对二硫键的配对。结果：1．测定的rhGM-CSF N端15个氨基酸序列与从cDNA推导的序列一致。2．测定的rhGM-CSF分子量与理论计算值一致。3．证明rhGM-CSF没有自由巯基,含有两对二硫键,与理论值一致。4．证明rhGM-CSF的氨基酸序列是正确的,并确证其中的两对二硫键配对正确。结论：确证重组人粒／巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF)的结构是正确的,没有修饰、变异和氨基酸的丢失。应用的方法灵敏、准确、可靠。     

方格星虫多肽的结构分析及体外抗氧化活性

目的 以方格星虫为原料,酶解制备水溶性多肽并考察其抗氧化活性,探究其结构-活性关系。方法 利用5种蛋白酶酶解新鲜方格星虫,并结合超滤方法得到高分子量(>50kDa)、中分子量(5～50 kDa)和低分子量(＜5kDa)的酶解肽段;利用氨基酸自动分析仪测定方格星虫酶解肽的氨基酸组成。综合考察多肽对1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH.)自由基、羟基自由(.OH)、超氧阴离子自由基( O-2.)的清除能力以及还原力效果,评价方格星虫多肽抗氧化活性;利用高效液相色谱-串联质谱方法鉴定小分子肽的氨基酸组成和序列结构。结果 胰蛋白酶水解方格星虫4h得到的酶解液蛋白含量最高,并在酶解液中检测确定了17种氨基酸,其中精氨酸含量最高13.65%。高中低三组肽段中,低分子量肽段的抗氧化活性优于其他：对DPPH 自由基和羟自由基清除能力大小顺序为低分子量>高分子量>中分子量、对超氧阴离子清除能力大小顺序为低分子量>高分子量≈ 中分子量、还原能力强弱顺序为高分子量>低分子量 > 中分子量。经高效液相色谱-串联质谱联鉴定了GFAGDDAPR、GLGGLSPEK 、LDLAGR和VTKEIPR 4个肽段。结论 低分子量的方格星虫酶解多肽具有较好的抗氧化活性,有潜力用作生物医药或化妆品工业的原料。     

液相色谱-质谱技术对利妥昔单抗及其类似药结构表征和相似性的研究

目的 应用液相色谱-质谱法(liquid chromatography-mass spectromety,LC/MS)和液相色谱-非数据依赖二级质谱数据采集技术(liquid chromatography-data independent acquisition mass spectromety,LC/MSE)对利妥昔单抗及其类似药进行结构表征和相似性研究.方法 用LC/MS对利妥昔单抗及其类似药的完整蛋白及轻链和重链的相对分子质量进行测定;用基于LC/MSE的肽图分析确定利妥昔单抗及其类似药的氨基酸全序列;用LC/荧光检测法分析利妥昔单抗的糖基化修饰结构及相对含量.结果 LC/MS可准确测定利妥昔单抗的相对分子质量.基于LC/MSE的肽图分析显示,利妥昔单抗的氨基酸序列覆盖率＞99％.LC/荧光检测法对利妥昔单抗的糖谱分析具有较好的重复性.利妥昔单抗类似药与原研药的相对分子质量和糖型信息相符、氨基酸序列完全一致、糖谱相似.结论 LC/MS和LC/MSE可用于利妥昔单抗及其类似药的结构表征和相似性比较,这为今后其他单克隆抗体结构表征平台的建立提供了依据.     

重组人酸性成纤维细胞生长因子C-末端测序

目的：应用蛋白质N-末端序列分析仪测定重组人酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）C-末端氨基酸序列。方法：应用多肽分析软件选择合适的蛋白内切酶完全酶切aFGF，酶切后用RP—HPLC进行分离，收集软件预测C-末端肽段保留时间处的肽段峰，用蛋白质N-末端序列分析仪直接测得该肽段氨基酸全序列。结果：实测肽图图谱与软件预测理论图谱一致，所得到的肽段为aFGF C-末端肽段，经测序其结果与理论序列完全一致。结论：通过选择合适的蛋白内切酶，可运用RP—HPLC和蛋白质N-末端序列分析仪测定基因工程产品C-末端氨基酸序列。     

基于数据非依赖性采集质谱技术对注射用曲妥珠单抗及其类似药结构的表征及相似性研究

目的 基于数据非依赖性采集(DIA)质谱技术对注射用曲妥珠单抗(赫赛汀)及其类似药进行结构表征和相似性研究.方法 用液相色谱/质谱(LC/MS)对赫赛汀及其类似药的完整蛋白及轻链和重链的相对分子质量进行测定;应用DIA质谱技术进行肽图分析,确定赫赛汀及其类似药的氨基酸全序列.结果 LC/MS可准确测定赫赛汀的相对分子质...     

电喷雾质谱法（ESI-MS）分析两种寡肽的一级结构

目的：测定肽类药物曲普瑞林、促黄体素释放激素类似物的分子量及其一级结构。方法：应用电喷雾质谱法（ESI MS）及源内碰撞诱导解离技术对肽类药物曲普瑞林及促黄体素释放激素类似物进行测定，根据其典型碎片离子确证其氨基酸序列及分子量。结果：肽类化合物在正离子模式下可得到较好的质谱信息，2种寡肽均测得其准分子离子峰（M＋H）^＋及（M＋Na）^＋信号，分子量分别与理论值一致。利用电喷雾碰撞诱导解离方法，得到一系列典型的y及b系列碎片离子，从而确证了2种寡肽的一级结构。结论：本研究为测定寡肽的分子量和一级结构提供了一个简便、快速、准确的方法。     

液质联用进行干扰素理化对照品的一级结构鉴定及比对研究

应用UPLC与质谱联用技术对5个厂家生产的重组人干扰素理化对照品进行一级结构鉴定及比对研究。通过测定质谱分子量及胰蛋白酶酶解肽图,对其氨基酸序列进行验证,并对二硫键连接方式等翻译后修饰进行分析鉴定。结果 5份对照品的实测分子量均与理论一致;液质肽图结果显示各样品的氨基酸序列均与理论一致;4批样品的二硫键连接方式为Cys1-Cys98、Cys29-Cys138,1批为Cys29-Cys139、Cys86-Cys99;部分样品存在N-末端"+Met"、乙酰化及蛋氨酸氧化等翻译后修饰。液质联用技术可用于干扰素理化对照品的一级结构鉴定及不同厂家产品的比对研究。     

基于UPLC-Q-Exactive-MS的菲牛蛭酶解物肽段鉴定与分子特性表征

目的 基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-Exactive-MS）技术对菲牛蛭酶解物中肽段进行鉴定与表征。方法 采用胰蛋白酶对菲牛蛭进行酶解,利用UPLC-Q-Exactive-MS技术结合Maxquant软件对菲牛蛭酶解物进行分析并对其肽段进行序列鉴定,同时采用生物信息学平台对这些肽段进行生物活性与不良反应预测以及相对分子质量、等电点（pI）、净电荷、亲水性氨基酸比例、不稳定指数等基本分子特性的预测。结果 利用UPLC-Q-Exactive-MS技术联合Maxquant软件在菲牛蛭酶解物中共鉴定出32条肽段,其中肽段AGFAGDDAPR的各项肽段分子特性符合目前已知抗血栓肽的共性特征,鉴定分数为103.83,可信度高;活性概率为0.56,相对分子质量976.01,肽链长度为10;平均亲水性为0.5,亲水性氨基酸残基比例为30%,水溶性良好;pI值为4.21,净电荷为-1;不稳定性指数为20.72,在水中稳定性强;具有抗血栓活性的可能性较大。同时6条肽段SSGETSSIIRR、AGFAGDDAPR、SSGETSSIIR、DSYVGDEAQSKR、GARRER、SIEDQVKR被预测具有抗血管生成活性且无溶血现象,但仍需进一步的合成与活性验证。结论 以菲牛蛭为例,提供了一种快速从酶解物中鉴定动物药肽段序列的方法,以期为动物药的肽类成分的研究提供思路。