神经干细胞原代培养及GABA能神经元的诱导分化

目的探讨神经干细胞(NSC)的原代培养及γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的诱导分化、鉴定。方法取出生1~3dSD大鼠全脑,分离、培养NSC并诱导分化了GABA能神经元,用免疫荧光染色进行鉴定。结果培养24h后,由单细胞发展成2~4细胞神经球,随时间延长球体增大,神经球均有Nestin阳性细胞;用含10%血清分化液分化1d后,神经球开始贴壁,伸出细长突起,部分可和周边神经球伸出的突起连接。神经球周边见大量散在贴壁的双极或多极细胞,免疫荧光染色可见NSE、GABA阳性细胞。加了分化液的实验组GABA阳性细胞分化率为(30·25±2·12)%,而对照组分化率为(1·14±1·39)%。结论成功从新生大鼠脑组织中分离、培养了NSC,并能较大比率分化GABA能神经元。     

脑肿瘤干细胞体外分化的形态、标志物及细胞增殖动力学特征

目的探讨脑肿瘤干细胞(BTSC)在体外分化过程中的细胞形态、分化相关标志物表达和增殖动力学变化,为进一步研究BTSC分化走向提供实验依据。方法取同一病例初发和复发的间变性室管膜瘤患者的肿瘤手术标本,用CD133免疫磁珠分离出CD133+细胞,加血清分化,相差显微镜下观察其形态,在未分化和分化后第3、7、10、21天收集细胞,流式细胞术检测细胞CD133+、神经上皮干细胞蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、β-微管蛋白(Tubulinβ-)Ⅲ的表达。在未分化和分化第7天做增殖周期测定。取正常神经干细胞(NSC)作为对照。结果(1)形态:BTSC由圆形到短梭形和多角形、再到长梭形及少量星形,第7天以后细胞形态往短梭形和圆形回复,出现细胞聚集成球重新飘浮在培养基中;NSC按固有规律分化。(2)标志物:BTSC和NSC未分化时CD133+和Nestin均高表达,BTSC分化后CD133+和Nestin全程表达,且先降后升,第7天表达率分别为(3·65±0·17)%和(28·99±1·26)%,第21天分别为(14·63±1·16)%和(45·46±1·27)%;GFAP和β-TubulinⅢ表达量一直偏低,但GFAP阳性表达率相对高于β-TubulinⅢ;NSC在分化第10天时失去了CD133+和Nestin的表达,GFAP和β-TubulinⅢ表达量明显增加,分别为(88·94±1·23)%和(11·94±0·36)%。(3)增殖周期及倍体:BTSC分化前为亚二倍体,分化后有少量二倍体和大量亚二倍体及超二倍体,处于G2-M期和S期的细胞比例大于NSC,复发BTSC分化后细胞组成比原发BTSC复杂;神经干细胞分化前后都为整二倍体,主要处于G0-G1期。结论细胞形态、标志物的表达、增殖周期及倍体变化反映出脑肿瘤干细胞分化走向和神经干细胞不同,前者存在明显的分化障碍。     

胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法新生1日龄大鼠禁食24 h后腹腔注射胰岛素50 u.kg-1,血糖值<1.0 mmol.L-1后取脑海马组织在含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和B27的无血清培养基中进行原代和传代培养,并分别对原代和传3代的细胞进行单克隆培养及诱导分化:单克隆培养细胞行巢蛋白(Nestin)免疫细胞荧光染色;诱导分化后的细胞分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞荧光染色,计数NSE阳性细胞比例。结果原代组培养细胞与传代组和对照组原代细胞相比生长较快;单克隆培养的细胞均Nestin阳性表达,诱导分化后的细胞分别呈NSE或GFAP阳性表达;原代组的细胞诱导分化为神经元的比例明显高于传代组和对照组(P<0.05);传代组的细胞诱导分化为神经元的比例与对照组传代细胞比较无统计学意义(P>0.05)。结论低血糖能够短暂地促进新生大鼠海马神经干细胞增殖及提高向神经元分化比例。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

丹参注射液诱导骨髓基质细胞分化为神经元的研究

目的 :探讨丹参注射液体外诱导成年大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞 .方法 :用贴壁法分离纯化SD大鼠骨髓基质细胞 .培养传至第 5代 ,以 10 %丹参注射液诱导骨髓基质细胞分化 ,6h后相差显微镜观察形态变化及免疫细胞化学染色鉴定神经细胞特异性标志物NSE及GFAP .结果 :诱导 1h后部分骨髓基质细胞胞体收缩 ,有突起伸出 ;6h后突起增多形成网络结构 ,免疫细胞化学染色 ,NSE强阳性表达率为(43 3± 4 3) % ;而GFAP无阳性表达 .结论 :丹参可以诱导成年大鼠骨髓基质细胞在体外分化成为神经元样细胞 .     

乳鼠海马神经干细胞向神经细胞分化过程中Notch1 mRNA的表达

目的建立神经干细胞(NSC)向神经细胞分化的培养体系,探讨Notch1mRNA在NSC分化过程中的表达情况。方法无菌分离新生(24h)SD大鼠海马NSC,体外扩增、纯化,并诱导NSC向神经细胞分化。细胞诱导前、后,采用免疫荧光化学法鉴定巢蛋白(Nestin)和神经元特异性烯醇酶(NSE)的表达;用逆转录-PCR检测NSC中Notch1mRNA的表达情况。结果从乳鼠海马分离的NSC在体外能克隆增殖,并表达Nestin。诱导分化后,细胞NSE阳性表达;Notch1mRNA在NSC诱导分化前、后均有表达。与诱导前相比,NSC诱导分化后各阶段Notch1mRNA表达水平均明显降低(P<0.05),而NSC分化各阶段Notch1mRNA表达的差异无统计学意义(P>0.05)。结论诱导NSC向神经细胞分化能抑制其Notch1mRNA的表达,低水平的Notch信号可能有利于神经细胞的分化。     

益气活血化痰中药复方对大鼠胚胎神经干细胞生长分化增殖的影响机制研究?

目的研究益气活血化痰药物血清对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞(NSC)生长分化增殖的影响。方法细胞分为空白血清组、含药血清组、阻滞剂组、含药血清+阻滞剂组和培养基对照组5组。采用细胞培养、血清药理学、免疫荧光等技术,观察中药复方血清对大鼠NSC生长分化的影响;相差显微镜进行形态学观察;免疫荧光染色技术,检测各组细胞nestin、神经元特异性烯醇化酶(NES)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察神经干细胞的分化。结果益气活血化痰中药对神经干细胞无毒性,并能够促进神经干细胞生长分化。nestin蛋白在诱导分化24 h内表达最强,诱导72 h后nestin表达明显减弱直至消失。益气活血化痰中药组NES和GFAP阳性细胞数明显增加。结论益气活血化痰药物血清有促进NSC生长分化增殖的作用。     

APP5肽模拟物P165对体外培养大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的 研究一种小分子多肽─APP5肽的模拟物P165对体外培养的大鼠胚胎海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的影响,以期能找到一种可代替神经营养因子的小分子物质,能够促进NSCs的增殖或分化,为将来的临床应用提供理论依据.方法 (1)原代培养SD大鼠胚胎脑海马NSCs; (2)利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的特异性标记物微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、2,3-环核苷酸-3磷酸二酯酶(CNPase)对培养的NSCs进行鉴定;(3)将培养的NSCs分为对照组、血清组、APP5肽反序列组和P165组, 观察各组细胞形态的变化;(4)将培养的NSCs分为对照组、APP5肽反序列组和P165组,利用细胞计数,测定干细胞克隆形成率、干细胞克隆形成大小的方法分析P165对海马NSCs增殖的影响.结果 (1)海马神经干细胞呈神经球聚集生长,BrdU染色阳性;加入血清后神经球周围有细胞呈放射状向四周生长,并带有突起.染色呈MAP2、GFAP或CNPase阳性; (2)海马NSCs加入P165及其反序列后细胞形态上与对照组相比没有明显改变;(3)与对照组相比,加P165后海马NSCs数量明显增加,克隆形成率和克隆形成的直径均有明显的增加, 并有统计学差异.结论 P165能够促进海马NSCs的增殖,但并不促进其分化.     

胶质母细胞瘤干细胞的分离、培养及其生物学特性

目的：从人胶质母细胞瘤SC 326和SC 189细胞株分离培养干细胞,研究其自我更新、增殖和分化等生物学特性。方法：用无血清培养基培养人胶质母细胞瘤SC 326和SC 189细胞,检测细胞形成神经球的能力。对培养3代以上的细胞(GSC)进行神经球细胞单细胞克隆形成率实验;用第3代和第7代的细胞评价神经球单细胞克隆形成率;免疫荧光染色法检测神经球细胞的干细胞标记物表达及多向分化能力。结果：无血清培养基培养24 h时SC 326、SC 189
形成神经球样细胞团,1周时神经球内细胞可达数百个,3代内神经球细胞SC 326的增殖率为(2.10±4.33)%、(4.03±4.14)%和(6.91±5.12)%,SC 189为(12.79±2.32)%、(15.78±3.25)%和(37.91±4.58)%;单细胞克隆形成率GSC 326和GSC 189分别为5.56%和8.33%,次级单细胞克隆形成率分别为9.89%和14.58%;GSC 326 P3和P7神经球克隆形成率最大值为(12.67±2.86)%和(20.44±1.73)%,GSC 189 P3和P7神经球克隆形成率最大值为(32.00±1.00)%和(42.67±5.03)%。免疫荧光染色,干细胞表面标记物CD133和神经巢蛋白呈强阳性表达,分化标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性类β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)表达极弱。分化诱导后分化标记物GFAP和β-TubulinⅢ的表达呈阳性。结论：早期原代胶质母细胞瘤细胞株中存在少量具有自我更新、增殖和多向分化能力的细胞,这些细胞具有明显的干细胞特性。
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低氧浓度改变对神经干细胞增殖分化及HIF-1α表达的影响

目的:探讨不同的低氧浓度下离体培养胎鼠脑皮质神经干细胞(NSCs)的增殖分化及HIF-1α的表达情况,以此分析HIF-1α对神经干细胞的增殖分化作用。方法:体外低氧条件下(3%O2和10%O2)培养扩增胚鼠皮质来源的神经干细胞,实验组分为3%O2低氧1、3、5d组;10%O2低氧1、3、5d组,常氧为对照组。免疫细胞化学染色法鉴定神经干细胞及其子代细胞。RT-PCR检测实验组细胞HIF-1αmRNA的表达。结果:各低氧组NSCs内HIF-1αmRNA的表达量均明显高于对照组,且10%O2组与3%O2组相比,低氧5dHIF-1αmRNA的表达量显著增加;实验组NSE阳性神经元的比率均明显高于对照组,10%O2组与3%O2组相比,低氧5d10%O2组中NSE阳性神经元的比率明显增高。结论:低氧可促进NSCs增殖分化及HIF-1αmRNA的表达,且HIF-1αmRNA的表达量与低氧浓度及时间有关。     

血性脑脊液对人胎脑神经干细胞影响的体外研究

目的:研究血性脑脊液对人胎脑神经干细胞增殖和分化的影响.方法:分别用人的血性脑脊液和正常脑脊液培养神经干细胞,分为试验组(血性脑脊液组)和对照组(正常脑脊液组),分别于不同时间观察神经干细胞在两组脑脊液中的生长及增殖分化情况,并应用免疫细胞化学技术对两组脑脊液中神经下细胞的分化进行鉴定和比较.结果:神经干细胞在血性脑脊...     

外源性神经节苷脂对神经干细胞增殖、分化作用的初步研究

目的 探讨外源性神经节苷脂(GM1)对从胎鼠大脑分离培养的神经干细胞(NSCs)增殖及分化的作用.方法 ①利用无血清培养技术从胎鼠大脑皮层和海马分离培养原代细胞,加血清诱导其分化.②在NSCs培养基和DMEM/F12培养基中加入不同浓度的GM1,观察GM1对NSCs增殖和分化的影响.结果 ①与不含GM1的NSCs培养基相比,在NSCs培养基中加入低浓度的GM1,NSCs的生长无明显改变,随着GM1浓度的增加,NSCs克隆球体积逐渐减小,细胞逐渐死亡;②在DMEM/F12培养基中单独加GM1而不加血清,NSCs克隆球均未见继续生长,也未见分化,而是迅速的死亡.结论 在NSCs培养基中,低浓度(12.5 μg/mL)GM1对NSCs的增殖无明显影响,但较高浓度的GM1对NSCs的增殖有抑制作用;在无血清的DMEM/F12培养基中,GM1不能诱导NSCs分化.     

LIF对人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨LIF对人胚神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法:从孕24周流产胎儿脑组织中分离NSCs,并分4组培养。对照组用基础培养液,第1,2,3实验组分别于基础培养液中加入20μg/L EGF和B27,20μg/L LIF和B27,20μg/L LIF、20μg/L EGF及B27。观察细胞生长情况并在不同时间进行细胞计数。诱导细胞分化后,显微镜下观察。结果:培养3 d细胞开始分裂并聚集成球,后逐渐增大,培养10 d,第1,2,3实验组和对照组神经球形成数分别为(21.5±7.8),(23.8±5.4),(25.2±6.3)和(24.8±6.9),各组间差异无统计学意义。分化实验显示含LIF培养的神经干细胞分化少。结论:在体外,LIF能够促进神经干细胞的增殖并抑制神经干细胞的分化。     

EPO对鼠胚脑皮质神经干细胞抗凋亡作用的研究

目的探讨促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）对体外培养神经干细胞（neural stem cells,NSCs）凋亡的影响,为NSCs移植治疗脑损伤和脑部疾病提供实验依据。方法孕14 d（El4）大鼠取鼠胚脑皮质悬浮培养、贴壁诱导分化。采用光电镜观察,用免疫细胞化学染色以Nestin蛋白作为鉴定NSCs的标记物,以MAP2、GFAP蛋白检测NSCs的分化。取第3代（P3）NSCs向悬浮培养基中分别添加不同剂量的EPO,EPO浓度分别为0.5U/ml,5U/ml,50U/ml,500U/ml,并设不添加EPO的对照组,通过Caspase-3蛋白检测NSCs的凋亡。结果 1）提取和分离E14d SD大鼠的胚脑皮质,在添加B27、bFGF、EGF的无血清培养基中培养,可形成大量悬浮的神经球并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈Nestin阳性、BrdU阳性。在添加10%胎牛血清的培养基中,神经干细胞可自然分化为神经元和神经胶质细胞。2）加入≥5U/ml EPO,神经球内Caspase-3的表达显著下降（P〈0.01）。结论 1）大鼠胚胎脑皮质体外培养可得到大量增殖的NSCs并能分化为神经元和神经胶质细胞,为NSCs的研究提供了适宜的细胞培养模型。2）加入≥5U/ml EPO可降低体外培养的鼠胚脑皮质NSCs的凋亡率。     

EPO促进胚胎神经干细胞向神经元分化的形态学研究

目的：探讨促红细胞生成素（erythropoietin ,EPO）促进神经干细胞（neural stem cells ,NSCs）分化的形态学表现,为细胞移植治疗脑部疾病和脑损伤提供实验依据。方法取大鼠14 d胚胎脑皮质先增殖培养,后贴壁分化培养。适时镜下观察,免疫细胞化学染色,用nestin鉴定NSCs ,GFAP鉴定神经胶质细胞、MAP2鉴定神经元。选取第3代 NSCs ,向培养基中分别添加不同剂量的 EPO ,浓度分别为0．5u/ml ,5u/ml ,50u/ml ,500u/ml ,并设不添加EPO的对照组,MAP2免疫荧光共聚焦显微镜观察NSCs向神经元方向的分化。结果1）鼠胚脑皮质在无血清悬浮培养形成大量神经球,并可传代,球内细胞均表达 nestin。分化培养,可检测出MAP2或GFAP阳性细胞。2）EPO≥5u/ml各组分化培养,表达MAP2阳性细胞显著升高（P＜0．05）。结论大鼠胚胎脑皮质体外培养可获得NSCs ;适当浓度EPO可提高NSCs向神经元的分化。     

神经干细胞移植联合腹腔注射促红细胞生成素对横断性脊髓损伤大鼠神经轴突的修复作用

目的: 探讨神经干细胞(NSCs)与促红细胞生成素(EPO)共同作用于横断性脊髓损伤大鼠后对损伤区轴突的修复作用,为临床治疗脊髓损伤提供理论依据。方法: 40只雌性成年Wistar大鼠,建立T10全横断大鼠脊髓损伤模型后,随机分为对照组、NSCs组、EPO组和联合治疗组,每组10只。术后8周采用BDA皮质脊髓束顺行追踪法和荧光金(FG)皮质脊髓束逆行追踪法评估损伤区脊髓神经轴突再生情况,同时分期采用实验性脊髓损伤运动功能BBB评分法评价大鼠后肢功能恢复情况。结果: BDA 免疫荧光染色和FG免疫荧光染色,联合治疗组可见大量被BDA-cy3红色荧光标记的再生轴突,其中部分再生轴突穿越损伤区到达远端;NSCs组仅见少量轴突再生,无神经轴突通过脊髓损伤区;EPO组偶见散在的神经纤维再生;对照组无明显的轴突再生。联合治疗组大脑皮质中可见少量被FG标记的椎体细胞及轴突发出金黄色荧光,其余3组大脑皮质中无FG标记细胞。大鼠后肢功能BBB评分,在术后1周及1周以后各时段,联合治疗组大鼠BBB评分均高于其他各组(P<0.05)。结论: 脊髓损伤后移植NSCs联合腹腔注射EPO可有效促进脊髓损伤区神经轴突的再生以及脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复。     

Wnt3a影响大鼠海马神经干细胞增殖的体外研究

目的:探讨Wnt3a对胚胎大鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外增殖的影响。方法:采用机械分离、无血清传代培养法,从胎鼠海马中获得NSCs,使用免疫荧光法对NSCs及其分化情况进行鉴定。将NSCs与5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)共孵育,观察Wnt3a对NSCs体外增殖情况的影响。结果:海马源胚胎NSCs具有增殖能力,可以传代培养,可分化为神经元和星形胶质细胞。与Brdu共孵育后,添加Wnt3a的实验组Brdu阳性率高于对照组(P0.01)。结论:使用机械分离、无血清培养的方法获得的NSCs具有增殖和多向分化能力,Wnt3a可以促进大鼠海马NSCs的体外增殖。     

新生大鼠神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的获得新生大鼠神经干细胞,为深入研究其增殖分化奠定基础。方法从新生24小时内大鼠端脑及中脑部位分离NSC,采用体外无血清悬浮培养,以获得能在体外长期生存的NSC;通过单细胞克隆实验检测其自我更新能力,免疫细胞化学检测NSC标志物nestin表达及分化为神经元和胶质细胞的能力;用细胞计数法研究其生长特点并绘制生长曲线。结果获得的NSC能在体外长期生存,具有很强的增殖能力、自我更新能力,能分化为神经元和胶质细胞,具有多向分化能力,表达nestin,体外传代至10代细胞数量扩增了40倍。结论成功地从新生大鼠端脑和中脑中分离得到了能在体外长期培养的NSC。     

外源性重组HMGB1对神经干细胞增殖分化的影响及其机制研究

目的研究外源性重组高迁移率组蛋白B1（HMGB1）对神经干细胞增殖及分化的影响及其作用机制。方法在无血清的神经干细胞培养基中培养SD鼠大脑皮层细胞,传代扩增及纯化神经干细胞,免疫荧光检测神经干细胞标记物巢蛋白（nestin）,分析神经干细胞纯度。CCK-8测定加入不同浓度的重组HMGB1对神经干细胞增殖活性的影响,选择重组HMGB1的最适浓度进行后续实验;细胞免疫荧光检测重组HMGB1对神经干细胞分化的影响,Real-time PCR检测晚期糖基化终末产物受体（RAGE）mRNA、Toll样受体（TLRs）mRNA、基质金属蛋白酶9（MMP-9）mRNA、神经生长因子（NGF）mRNA的表达,Western blot检测RAGE、TLRs、MMP-9、NGF蛋白的表达。结果大鼠大脑皮层细胞在培养至第3代时,nestin鉴定神经干细胞纯度可达99%及以上。在重组HMGB1 10 ng/mL刺激下,神经干细胞增殖活性最高。实验组神经Ⅲ类β-微管蛋白（TUJ1）表达高于对照组(P<0.05),实验组RAGE、TLRs、MMP-9、NGF mRNA及蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。结论外源性重组HMGB1或可通过RAGE、TLRs、MMP-9等信号通路促进神经干细胞增殖及其向神经元方向分化。