贵州小型香猪皮肤成纤维细胞库的构建

目的：小型猪与人的皮肤组织结构相似，探索一种贵州小型香猪成纤维细胞的分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定方法为组织工程皮肤的构建奠定基础。方法：采用细胞培养技术和组织工程学方法。结果：采用细胞培养技术将贵州小型香猪成纤维细胞传代至23代，此时的细胞数至少是原代培养的细胞数的1&;#215;10^9倍，经冻存、复苏后，猪成纤维细胞仍具有增殖能力，生长状态与原代培养的猪成纤维细胞相类似。结论：通过细胞培养技术和组织工程学的方法可以成功地构建贵州小型香猪成纤维细胞库。     

贵州小型香猪皮肤成纤维细胞库的构建

目的:小型猪与人的皮肤组织结构相似,探索一种贵州小型香猪成纤维细胞的分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定方法为组织工程皮肤的构建奠定基础。方法:采用细胞培养技术和组织工程学方法。结果:采用细胞培养技术将贵州小型香猪成纤维细胞传代至23代,此时的细胞数至少是原代培养的细胞数的1×109倍,经冻存、复苏后,猪成纤维细胞仍具有增殖能力,生长状态与原代培养的猪成纤维细胞相类似。结论:通过细胞培养技术和组织工程学的方法可以成功地构建贵州小型香猪成纤维细胞库。     

原代人尿道狭窄成纤维细胞的体外培养及鉴定

目的对原代人尿道狭窄成纤维细胞的体外培养及鉴定,了解其增殖能力及生物学特性。方法人尿道狭窄成纤维细胞通过细胞的提取、传代、冻存与复苏获得。采用倒置显微镜观察、HE染色及波形蛋白免疫染色的方法鉴定细胞。以人胚肺成纤维细胞为对照组,以原代培养人尿道狭窄成纤维细胞的第2、4代及复苏后的第2、4代为试验组,通过对比试验组与对照组的细胞生长曲线、噻唑蓝(MTT)及流式细胞仪的检测结果了解细胞的增殖能力。结果倒置显微镜观察发现试验组与对照组细胞的形态相似,细胞HE染色及波形蛋白免疫染色鉴定细胞为成纤维细胞。通过比较试验组与对照组的细胞生长曲线、MTT及流式细胞仪的检测结果,发现各组间差异无统计学意义(P0.05),表明试验组与对照组的细胞具有相似的增殖能力。结论该试验确立了人尿道狭窄成纤维细胞的原代培养。     

人正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞的培养及生物学差异

背景:成纤维细胞是创伤愈合过程中的主要效应细胞,对瘢痕疙瘩成纤维细胞进行培养可为体外研究瘢痕疙瘩提供基础.目的:比较体外培养的人正常皮肤和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞生物学特性的差异,为体外研究瘢痕疙瘩提供平台.方法:应用组织微粒贴壁法,对人正常皮肤和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞进行原代培养、传代培养、冻存及复苏,观察二者的生长增殖情况及差异.结果与结论:瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖与正常皮肤来源的成纤维细胞无明显差异,二者进入对数生长期的时间大致相同;体外培养的成纤维细胞在液氮中冻存后,细胞复苏状态良好,接种后绝大部分细胞存活,与冻存前无明显差异.说明瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞及正常皮肤来源的成纤维细胞生长增殖无明显差异,且均可成功冻存和复苏.     

高效制备昆明鼠胚胎成纤维细胞饲养层

背景：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法,能有效抑制胚胎干细胞分化并促进其增殖,但其制备过程繁琐,工作量大,准备周期长。目的：探索建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层简单、高效的培养体系。方法：取13.5d胎龄胎鼠用改良组织块法及简化酶消化法分离培养原代成纤维细胞,倒置显微镜下观察不同方法培养的原代和传代鼠胚胎成纤维细胞的生长形态、结构及细胞数量变化。收集鼠胚胎成纤维细胞进行冻存,复苏后细胞经不同浓度作用时间的丝裂霉素C处理,制备饲养层。结果与结论：两种简化方法培养的原代鼠胚胎成纤维细胞生长状态良好,得到高效优质足量细胞,操作过程简单,省去了多次消化、离心、细胞计数等繁琐操作,均适宜于鼠胚胎成纤维细胞的原代培养。简化复苏法复苏后的细胞,按其生长汇合情况,以丝裂霉素C10mg/L作用1.5～2.0h或1mg/L培养过夜,省时并可获得细胞生长状态最佳的饲养层。     

高效制备昆明鼠胚胎成纤维细胞饲养层

背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法,能有效抑制胚胎干细胞分化并促进其增殖,但其制备过程繁琐,工作量大,准备周期长。目的:探索建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层简单、高效的培养体系。方法:取13.5d胎龄胎鼠用改良组织块法及简化酶消化法分离培养原代成纤维细胞,倒置显微镜下观察不同方法培养的原代和传代鼠胚胎成纤维细胞的生长形态、结构及细胞数量变化。收集鼠胚胎成纤维细胞进行冻存,复苏后细胞经不同浓度作用时间的丝裂霉素C处理,制备饲养层。结果与结论:两种简化方法培养的原代鼠胚胎成纤维细胞生长状态良好,得到高效优质足量细胞,操作过程简单,省去了多次消化、离心、细胞计数等繁琐操作,均适宜于鼠胚胎成纤维细胞的原代培养。简化复苏法复苏后的细胞,按其生长汇合情况,以丝裂霉素C10mg/L作用1.5～2.0h或1mg/L培养过夜,省时并可获得细胞生长状态最佳的饲养层。     

人胚胎骨骨膜来源成骨细胞的分离培养与生物学特性

背景:胚胎骨来源成骨细胞因其低免疫原性和高增殖与成骨活性有可能成为适用于骨组织工程方法异体骨组织缺损修复的种子细胞.冻存复苏后的牛物学特点是台能进行进一步临床应用研究有待证实.目的:建立人胚胎骨骨膜来源成骨细胞的分离培养、保存方法,观察骨膜来源成骨细胞生物学特点.设计、时间及地点:细胞形态学与生物学特性实验研究,于2005-04/2006-05在天津市口腔医院细胞与组织工程实验室完成.材料:细胞来源为5月龄自然流产胎儿,产妇及家属知情同意,无菌条件下取长骨骨膜组织.方法:采用组织块法对成骨细胞进行原代培养,传代培养细胞液氮冻存3～6个月后,选择不同代次细胞复苏培养.主要观察指标:通过形态学、超微结构,细胞增殖曲线,钙结节Von kossa法染色以及细胞内碱性磷酸酶定量检测与钙钴法染色确定其增殖与成骨活性.结果:组织块法培养骨膜来源成骨细胞第6天即可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性.苏木精-伊红染色密集融合的成骨细胞与细胞外基质显示转化为脊样骨组织结构排列.经统计学分析定量榆测成骨细胞碱性磷酸酶活性与细胞密度有线性正相关关系.液氮冷冻保存后复苏培养复层成骨细胞钙钴法碱性磷酸酶染色阳性率在45%以上,超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞.结论:胚胎骨骨膜来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性.深低温液氮冻存成骨细胞复苏后仍能连续传代增殖并具有良好的成骨代谢活性,能够体外借助细胞外基质形成骨样结构.     

人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性

背景：建立一种既可以大量制备,又能保存并保持较高活性的饲养层是胚胎干细胞培养研究不可缺少的环节。目的：体外分离培养、冻存复苏ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性。方法：取ICR小鼠13.5d胚胎,用胰蛋白酶分步消化法分离培养小鼠成纤维细胞,对冻存复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞形态、生长曲线、贴壁率、细胞化学染色及支持人胚胎干细胞生长特性等进行观察。结果与结论：复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞在体外传代30min时80%以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性,能长期支持人胚胎干细胞传代生长。提示此方法所获得的小鼠胚胎成纤维细胞复苏后有较高的生物学活性,可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

冻存脐带间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：在骨组织工程中,脐带间充质干细胞是的一种新兴的种子细胞。目前认为低温冻存是长期保存细胞的有效方法。目的：探究冻存的脐带间充质干细胞能否被诱导分化成成骨细胞。方法：采用组织块贴壁法从脐带的华尔通氏胶组织中分离出间充质干细胞。然后,用倒置显微镜观察原代细胞的细胞形态。脐带间充质干细胞的免疫表型和细胞周期用流式细胞仪检测。在冻存6个月后,复苏第2代脐带问充质干细胞进行冻存复苏,并传代培养至12代。对第12代的脐带间充质干细胞进行成骨诱导,它的成骨能力分别通过碱性磷酸酶活性检测,骨钙素和骨涎蛋白的免疫荧光检测以及茜素红染色检测来确定。结果与结论：原代脐带间充质干细胞呈现典型的成纤维细胞样形态。流式细胞仪显示培养的细胞高表达间充质干细胞的表面标志CD73、CDl05和CD90,但是不表达造血细胞的表面标志CD34和CD45。复苏后细胞的存活率是90％。细胞周期显示P8的细胞有75％处于Go／G1期,25％处于S＋G2M期。经成骨诱导液处理的第12代细胞显示出比对照组更高的碱性磷酸酶活性（P〈0．01）。此外,在成骨诱导液中诱导的细胞对骨钙素和骨涎蛋白的染色呈阳性,并形成矿化了结节。冻存后的脐带间充质干细胞仍保持了它们的生物学特性,并且在成骨诱导液中能被诱导分化成成骨细胞。     

不同条件下人骨髓基质细胞体外培养及诱导分化中的影响因素

目的：体外培养人骨髓基质细胞(human mesenchymal stem cells．hMSCs)，传代、扩增、冻存复苏并诱导分化，为细胞移植及组织工程骨的构建奠定基础。方法：用酶消化-细胞单层培养法行细胞原代培养，传代扩增并冻存复苏，采用胰岛素和地塞米松进行诱导分化，碱性磷酸酶和钙化结节检测。结果：hMSCs可在体外培养，传代扩增并冻存复苏，并可诱导分化为成骨细胞。结论：可在体外分化为成骨细胞并钙化，可作为细胞移植及组织工程骨构建可靠的细胞来源。     

人脐带间充质干细胞冻存复苏后细胞表面标志物分子学变化

背景：间充质干细胞是具有自我更新能力且能够多向分化的干细胞。脐带属于胚胎外组织,是胎儿分娩后的废弃物,来源广泛,无伦理学限制,因此有望作为间充质干细胞来源的第一选择。目的：检测人脐带间充质干细胞冻存复苏前后细胞表面分子CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90、CD34、CD45、CD271标志变化情况。方法：通过从人的脐带中分离培养间充质干细胞,分别观察原代细胞、P4、P8代细胞和冻存复苏后P2、P4、P8代细胞形态;通过流式细胞仪检测原代细胞、P4、P8代细胞和冻存复苏后P2、P4、P8代细胞表面分子标志CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90、CD34、CD45、CD271。结果与结论：人脐带间充质干细胞冻存前与原代复苏后不同代数下细胞均表现出相同的表型,CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90阳性,CD34、CD45、CD271阴性,提示人脐带间充质干细胞原代低温冻存复苏后细胞表面标志性分子无变化。     

酶解组织块法原代培养人牙周膜干细胞和牙髓干细胞

背景:酶解组织法是一种高效的原代细胞培养方法,利用该法可提高牙周膜干细胞和牙髓干细胞的培养成功率。目的:比较牙周膜干细胞和牙髓干细胞的原代培养成功率、细胞形态、生长特征,并对其进行多种细胞标志的鉴定。方法:取因正畸需要拔除健康牙20颗,其中16颗用于牙周膜干细胞原代培养,4颗用于牙髓干细胞培养。酶解组织块法培养两种细胞,MTT法检测两种细胞的生长曲线,利用RT-PCR法、细胞免疫组化法、细胞免疫荧光法鉴定两种细胞的标志。结果与结论:牙髓干细胞的原代培养成功率明显高于牙周膜干细胞,显示更快的生长能力。通过酶解组织法分离纯化的两种干细胞均显示正常的细胞形态和生长特征,表达相应的细胞标志CD105,CD73,波形丝蛋白vimitin,Stro-1,不表达角蛋白CK-17和CD45。提示酶解组织块法是一种高效的原代培养牙周膜干细胞和牙髓干细胞的方法。     

人卵巢组织冷冻保存及其评价方式的研究与进展

背景：如何保存有生育需求的患者的卵巢功能使其能获得一定的生育能力,具有重要的意义及广阔的应用前景。目的：综合近年来卵巢组织冷冻的相关研究,对保存及评价方法作以综述,以探讨如何建立最佳的卵巢组织冷冻方案。方法：由第一作者检索1994年1月至2014年1月PubMed数据及万方数据库相关文献。英文检索词为ovariantissue,ovariantissuecryopreservation,freezingfactors;中文检索词为卵巢组织,卵巢组织冷冻,冷冻影响因素。纳入与卵巢组织冷冻技术、影响冷冻化效果的因素、冷冻组织复苏及人卵巢组织移植相关的文献59篇进行分析。结果与结论：目前,卵巢组织冷冻主要分为慢速冷冻、快速冷冻及玻璃化冷冻技术,而不同的患者、组织切片的大小、冷冻保护剂种类、渗透时间及冷冻载体的不同,都会影响到冷冻效果。卵巢组织复苏后,主要通过组织学显微镜下观察卵泡及颗粒细胞的形态并进行计数,观察亚细胞结构的改变评价冻融效果;凋亡信号的检测;免疫组织化学分析检测复苏后增殖及凋亡相关的信息;体外培养检测内分泌水平的变化;基因水平的检测等。近年来,卵巢组织冷冻后的临床应用是将冷冻复苏后的组织进行移植,使患者恢复生殖内分泌功能,或获取成熟的生殖细胞,从而保存女性生育能力。然而,卵巢组织冷冻仍存在一些问题尚需进一步研究。     

新生昆明小鼠胰腺干细胞体外分离、培养及自然分化的潜能

背景：关于胰腺干细胞在胰腺组织中的分布情况,以及如何有效的将其分离、体外优化培养,目前仍有一定的困难。目的：从新生昆明小鼠胰腺组织中分离出胰腺干细胞,在体外条件下培养观察其形态学和生物学特征,并进行初步鉴定。方法：取新生SPF级昆明小鼠的胰腺组织,使用Ⅴ型胶原酶消化,采用Percoll不连续密度梯度离心,使胰腺组织内、外分泌部细胞分离,分布在3个不同的密度界面;收集各界面的细胞,以无血清、添加碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的DMEM培养基培养。结果与结论：通过细胞形态学和细胞生长特性的观察,结合双硫腙染色证实：采用Percoll不连续密度梯度离心,第一、二密度界面的细胞来源于胰腺内分泌部;第三密度界面细胞来源于胰腺外分泌部。分别从胰腺内、外分泌部获取胰腺组织细胞,在体外培养观察发现均存在一类大、圆、单个核的细胞,呈集落样附壁生长,具有较活跃的分裂增殖能力,碱性磷酸酶染色阳性,表达胰腺干细胞的特异性标志巢蛋白,即为胰腺干细胞;随着体外培养时间的延长,分别表达PDX-1和CK-19,呈现向胰腺内分泌部细胞和外分泌部细胞分化的趋势。     

人脐带间充质干细胞冻存复苏后细胞表面标志物分子学变化

背景:间充质干细胞是具有自我更新能力且能够多向分化的干细胞.脐带属于胚胎外组织,是胎儿分娩后的废弃物,来源广泛,无伦理学限制,因此有望作为间充质干细胞来源的第一选择.目的:检测人脐带间充质干细胞冻存复苏前后细胞表面分子CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90、CD34、CD45、CD271标志变化情况.方法:通过从人的脐带中分离培养间充质干细胞,分别观察原代细胞、P4、P8代细胞和冻存复苏后P2、P4、P8代细胞形态;通过流式细胞仪检测原代细胞、P4、P8代细胞和冻存复苏后P2、P4、P8代细胞表面分子标志CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90、CD34、CD45、CD271.结果与结论:人脐带间充质干细胞冻存前与原代复苏后不同代数下细胞均表现出相同的表型,CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90阳性,CD34、CD45、CD271阴性,提示人脐带间充质干细胞原代低温冻存复苏后细胞表面标志性分子无变化.

Abstract：

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells are the stem cells that possess the capability for self-renewal and multi-directional differentiation. Umbilical cord is the tissue outside the embryos and would be fallen off after parturition. In addition, it has wide source and no ethical restriction, so it is promising to be the first choice for mesenchymal stem cells. OBJECTIVE: To detect the surface markers CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD34, CD45, and CD271 of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUCMSCs) prior to and after cryopreservation and resuscitation. METHODS: After isolation and culture, morphology of the primary, P4 and P8 hUCMSCs was observed prior to cryopreservation and after resuscitation. Surface markers CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD34, CD45, and CD271 of primary, P4, and P8 hUCMSCs were detected through the use of flow cytometry prior to cryopreservation and after resuscitation RESULTS AND CONCLUSION: hUCMSCs prior to cryopreservation and hUCMSCs of different passages after resuscitation present the same phenotype, i.e., positive for CD29, CD44, CD49e, CD73, and CD90, and negative for CD34, CD45, CD271. These findings suggest that primary hUCMSCs do not present changes in surface markers after cryopreservation and resuscitation.     

小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法的建立

背景：组织块培养睾丸生殖细胞对污染不容易控制,胰蛋白酶消化接种培养睾丸生殖细胞可能损伤细胞。目的：建立一种切实可行的小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法。方法：小鼠睾丸间质细胞的分离采用胶原酶消化法,纯化采用Percoll等密度梯度离心法,活率鉴定采用锥虫蓝拒染法,纯度鉴定采用3β-羟基固醇脱氢酶染色方法。结果与结论：小鼠睾丸间质细胞纯度达可达90%以上;体外培养的细胞形态完整、增殖速度快、贴壁生长状态良好。说明实验成功建立了小鼠睾丸间质细胞的体外原代培养模型。     

一种改良人骨髓间充质干细胞分离培养的方法

背景：分离培养鼠、兔骨髓间充质干细胞的科研实践较多,而组织工程临床实践人多以同种属种子细胞的科研为基础。目的：建立一种稳定、高效,满足临床和实验审需要的人骨髓问充质干细胞分离培养方法。方法：使用骨穿针于人髂前上棘处抽取骨髓和松质侣’,用15mL培养体系冲洗松质骨并收集冲洗液,采用直接培养法,利用细胞贴壁性能初筛细胞;流式细胞仪枪测细胞表面抗原（CD29、CD34、CD44、CD45、CDl05）,分别进行成骨、成脂肪诱导分化,在诱导过程中进行细胞形态学观察对干细胞进行初步豁定。结果与结论：松质骨冲洗液直接培养法在培养第5天的时候出现细胞集落,细胞稳定表达CD29、CD44、CDl05,不表达CD34、CD45。成骨诱导20d后出现明显钙结节,茜素红染色呈红色结节。成脂诱导7d后脂滴明显形成,油红素O染色见大量脂质沉淀。结果可见采用松质骨冲洗液直接培养法可以从人松质骨中短时间内获得大量间充质干细胞,其具有良好的细胞形态,稳定表达的细胞抗原及成骨、成脂分化能力。     

大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难,获得的成骨细胞的纯度不一。目的：建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法,观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。方法：采用二次酶消化法对SD大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养,扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色、超微结构以及细胞增殖曲线,确定其增殖与成骨活性。结果与结论：二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞,细胞增殖曲线显示细胞生长活跃。提示,新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性,能连续传代增殖,纯度高,细胞生物学特征稳定,适用于做体外实验研究。     

脂肪干细胞与自体富血小板血浆载体复合物体内构建血管化组织工程脂肪

背景：血运重建机制是组织工程化脂肪组织成功构建的决定性因素。目的：观察脂肪干细胞与自体富血小板血浆和纤维蛋白胶载体复合物在体内构建血管化组织工程脂肪的可行性。方法：从健康成年人吸脂术后的脂肪组织中分离脂肪干细胞并行原代及传代培养,将第3代经BrdU标记的脂肪十细胞向脂肪细胞定向诱导2周后,制成浓度为5×10^10L^-1。细胞悬液。由0．5mL细胞悬液、100μL富血小板血浆工作液或DMEM培养基与0.5mL纤维蛋白胶组成实验组和对照组移植物,分别植入裸鼠背部皮下。结果与结论：植入后8周取材：①实验组可见血管明显增生并长入材料,呈轻度纤维包裹;列照组有少量血管长入材料中,也有轻度纤维包裹现象。实验组新生组织湿质量大予对照组（P〈0．01）。②苏木精一伊红染色均可见移植物中有新生脂肪组织形成和不同程度的微血管长入;实验组微血管数多于对照组（P〈0．01）。⑧新生组织免疫荧光染色示,两组新生脂肪细胞的胞核及部分微血管内皮细胞的胞核呈现绿色荧光。说明脂肪干细胞与自体富血小板血浆和纤维蛋白胶载体复合物在体内可构建血管化组织工程脂肪,脂肪于细胞与自体富血小板血浆共同参与新生脂肪组织的血管化过程,自体富血小板血浆能促进组织工程构建物的血运重建,保证更多种子细胞的成活。