全反式维甲酸诱导K562细胞分化过程中线粒体铁蛋白表达的研究

目的 研究K562白血病细胞在全反式维甲酸(ATRA)诱导分化过程中线粒体铁蛋白(MtF)、运铁蛋白受体1(TfR1)和铁蛋白(Fn)mRNA表达水平的变化情况,探讨MtF在白血病细胞增殖和铁代谢方面的作用.方法 K562细胞加入ATRA(终浓度1 μmol/L)中诱导培养,分别于第1、3、5 d收集细胞,分别进行:①瑞士染色观察各时间点的细胞形态;流式细胞学检测细胞表面分化抗原CD13的表达;②Trizol法提取各时间点细胞的RNA,通过半定量RT-PCR方法 检测各时点MtF、TfR1和Fn基因的表达水平.同时设未用ATRA诱导培养的K562细胞为对照组.结果 1 μmol/L的ATRA可诱导K562细胞向粒系细胞分化,诱导培养第5 d,细胞表面CD13的表达水平增加,诱导分化率为21.2%,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).诱导分化前K562细胞即有MtF mRNA表达,但随细胞诱导时间的延长,MtF和TfR1 mRNA表达呈下降趋势,诱导分化第5 d的表达水平分别为诱导分化前的86.5%和79.2%;而Fn mRNA的表达呈上调趋势,诱导分化第5 d表达水平为诱导分化前的1.21倍.结论 ATRA诱导K562细胞向粒系细胞分化过程中,MtF和TfR1 mRNA表达下调,而Fn mRNA表达上调,这种协调变化有助于降低细胞通过TfR1介导的铁摄取,从而抑制或影响细胞增殖潜能.     

滑菇多糖对K562白血病细胞增殖的抑制及Caspase-3基因表达的影响

目的:研究滑菇多糖(PNP)的抗肿瘤作用及诱导K562细胞凋亡的机制.方法:采用MTT法检测PNP对K562细胞增殖的抑制作用;绘制生长曲线;Hochest 33258染色计算凋亡率;RT-PCR法、Western Blot方法检测凋亡相关基因Caspase-3的表达.结果:MTT分析表明,PNP作用48 h后可明显抑制K562细胞的增殖;Hochest染色结果显示,PNP能诱导K562细胞出现典型的凋亡形态,且凋亡率随多糖浓度增加而增大,经PNP 100,200,400 mg/L的处理后,凋亡率分别是对照组的3.15,6.55和8.62倍.PNP能诱导凋亡相关基因Caspase-3在mRNA水平上的表达;Western Blot显示PNP能诱导Caspase-3编码蛋白的表达,且随多糖浓度的增加表达量增加.结论:PNP对K562细胞增殖有抑制作用, 并能促进其凋亡;PNP通过诱导凋亡相关基因Caspase-3表达促进细胞凋亡.     

转铁蛋白受体基因表达及其抗体诊断肝癌的研究

目的　研究肝癌转铁蛋白受体(TfR)的基因表达及其单克隆抗体免疫诊断肝癌的价值。方法　对20例肝癌手术标本包括癌巢组织、癌旁组织及周围正常组织进行Northern blot分析,了解三种组织TfR mRNA表达情况;通过间接免疫荧光及免疫组织化学ABC法了解肝癌细胞和正常肝细胞膜上TfR表达情况。结果　 TfR mRNA表达癌组织最高,癌旁组织次之,周围正常组织最低,后两者间无显著差异;肝癌细胞膜转铁蛋白受体荧光阳性率明显高于正常肝细胞,两者有显著差异。免疫组织化学ABC法中19例强阳性染色,1例阴性。结论　转铁蛋白受体的基因表达在肝癌组织中明显增高,其单克隆抗体有希望成为肝癌免疫诊断的理想载体。     

苦参碱诱导K562细胞合成γ珠蛋白

目的 体外研究苦参碱对K562细胞γ珠蛋白合成的影响.方法 以K562细胞为体外模型,采用联苯胺染色方法确定苦参碱诱导K562细胞血红蛋白表达增加的剂量效应和时间效应,进一步应用Western blotting技术检测血红蛋白F(αγ2)水平.结果 0.1mg/ml苦参碱作用于K562细胞,在96h联苯胺染色阳性细胞率达到15.67%;Western blotting检测到血红蛋白F表达增加.结论 苦参碱在体外可诱导K562细胞γ珠蛋白合成增加,从而使血红蛋白F增加.苦参碱具有与阳性对照丁酸钠相似的诱导γ珠蛋白合成增加的作用.     

丙氧鸟苷对K562细胞抑制增殖和诱导分化作用

目的研究丙氧鸟苷(GCV)抑制K562细胞增殖作用和机制。方法细胞培养、集落培养、联苯胺染色。结果0.625～40μmol浓度的GCV对K562细胞有明显的抑制增殖作用,作用4d时的半数抑制量(IC50)为2.99μmol,作用7d后克隆形成抑制率达43%,联苯胺染色阳性细胞百分率随药物剂量的增加和培养时间的延长而逐渐增加。结论GCV体外抑制K562细胞增殖并能诱导其向红系分化。     

丙氧鸟苷对K562细胞抑制增殖和诱导分化作用

目的　研究丙氧鸟苷 (GCV)抑制K562 细胞增殖作用和机制。方法　细胞培养、集落培养、联苯胺染色。结果　 0 .6 2 5～ 40 μmol浓度的GCV对K562 细胞有明显的抑制增殖作用 ,作用 4d时的半数抑制量 (IC50 )为 2 .99μmol,作用 7d后克隆形成抑制率达 43% ,联苯胺染色阳性细胞百分率随药物剂量的增加和培养时间的延长而逐渐增加。结论　GCV体外抑制K562 细胞增殖并能诱导其向红系分化     

维生素E对不同糖浓度培养LO2细胞铁代谢相关蛋白表达的影响

目的探讨维生素E对不同浓度葡萄糖培养下LO2肝细胞株铁调节蛋白1(IRP1)、转铁蛋白受体1(TfR1)、转铁蛋白受体2(TfR2)、铁调素(hepcidin)表达的影响。方法 LO2细胞培养基分为5.5,15,25 mmol/L三种葡萄糖浓度。分别在这三种葡萄糖浓度培养中,再分别加入0,0.1,1 mg/L和10 mg/L维生素E。其中0 mg/L维生素E剂量组作为相同葡萄糖浓度组中的对照组。各组培养时间均为24 h。用荧光染色法检测各组细胞活性氧(ROS)水平,用蛋白免疫印迹法检测IRP1、TfR1、TfR2、hepcidin的表达量。结果①相同葡萄糖浓度组与0 mg/L维生素E对照组相比,5.5 mmol/L组添加各剂量维生素E后细胞ROS水平、IRP1、TfR1和TfR2表达没有显著差异(P>0.05);15 mmol/L组和25 mmol/L组中1 mg/L和10 mg/L维生素E组分别与其对照组相比,细胞ROS水平、IRP1、TfR1和TfR2表达分别下降(P<0.01);15 mmol/L和25 mmol/L组中0.1 mg/L维生素E组与相应对照组相比细胞ROS水平、IRP1、TfR1和TfR2表达没有显著差异(P>0.05)。②相同剂量维生素E组内:LO2细胞ROS水平、IRP1、TfR1、TfR2表达量分别随葡萄糖浓度的升高而逐渐升高(P<0.01)。③在各葡萄糖浓度组内,各剂量维生素E组间细胞的hepcidin表达没有显著性差异(P>0.05)。在各剂量维生素E组中,15 mmol/L和25mmol/L葡萄糖组与相应5.5 mmol/L葡萄糖组相比,hepcidin表达显著升高(P<0.01),而15 mmol/L和25 mmol/L组间hep-cidin表达没有显著差异(P>0.05)。结论维生素E能够降低高糖培养下细胞活性氧的含量,缓解IRP1、TfR1、TfR2蛋白表达增加的幅度。hepcidin表达变化并没有受维生素E的影响,提示hepcidin在高糖环境下的表达增加可能不是或不仅仅是受过量ROS的影响。     

阿糖胞苷通过自噬途径影响K562细胞增殖凋亡的实验研究

目的 探讨阿糖胞苷(Ara-C)通过自噬途径影响人红白血病K562细胞株增殖、凋亡的作用及可能的机制.方法 采用CCK-8法检测不同浓度的Ara-C作用24 h和48 h后细胞增殖抑制率;流式细胞术(FCM)检测凋亡率和周期;Hoechest染色观察细胞核染色质的形态,吖啶橙染色观察细胞酸性自噬小泡;Western blot检测p38和p-p38蛋白表达变化;RT-PCR和免疫荧光检测自噬凋亡相关基因和蛋白的表达水平.结果 CCK-8检测发现不同浓度的Ara-C均能抑制K562细胞增殖,并呈浓度和时间依赖性;FCM检测显示Ara-C能增加细胞的凋亡和将细胞周期阻滞在S期;Hoechest染色发现Ara-C处理K562细胞后呈凋亡形态改变;吖啶橙染色发现Ara-C组细胞绿色荧光增强,细胞出现大量的酸性自噬小泡;RT-PCR检测发现Ara-C上调自噬关键基因Beclin-1、LC3A和LC3B表达;Western blot检测发现Ara-C增加磷酸化p38表达;免疫荧光检测发现Ara-C增加LC3表达.结论 Ara-C能够激活p-p38介导的K562细胞发生自噬,进而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡作用.     

白血病细胞株耐药与核因子κB蛋白质诱导表达的关系

目的:探讨慢性粒细胞性白血病细胞K562与其耐药株K562/ADR细胞中IκB-α和NF-κB的表达,以及三氧化二砷(As2O3)诱导白血病细胞凋亡的关系.方法:应用不同浓度的As2O3诱导K562和K562/ADR细胞凋亡,以Western-blot免疫印迹电泳检测NF-κB、IκB-α的表达,流式细胞术检测细胞凋亡及分析IκB-α的阳性表达率变化.结果:As2O3诱导K562/ADR细胞凋亡率明显低于K562细胞,当As2O3浓度为1 μmol/L时,两种细胞凋亡率分别是(6.33±1.51)%、(13.25±1.83)%,当As2O3浓度增高到4 μmol/L时,细胞凋亡率则分别为(8.00±1.47)%、(50.56±8.62)%(P＜0.05).在K562细胞胞浆中,IκB-α阳性表达率则由(88.07±0.99)%减少到(49.21±0.95)%(P＜0.01),胞核中P65量逐渐增加;而K562/ADR细胞中无明显变化.结论:As2O3可诱导K562细胞凋亡,伴有IκB-α的降解及NF-κB的激活;K562/ADR细胞NF-κB表达增加,对As2O3诱导的反应无明显改变.     

大麻受体激动剂WIN对白血病K562细胞增殖和诱导凋亡作用的研究

目的探讨大麻受体激动剂W／N-55,212-2（WIN）对白血病K562细胞增殖和凋亡的作用及机制。方法将细胞分成对照组和不同剂量大麻受体激动剂wIN用药组。CCK-8测定WIN对K562细胞增殖的影响;DAPI染色观察细胞核形态变化;JC-1分析线粒体膜电位变化;分光光度法检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性;流式细胞仪分析细胞凋亡率变化;Western印迹法分析Bax、Bcl-2及C-myc蛋白的表达。结果与对照组相比较,5、10、20μmol／L的WIN处理K562细胞24、48h后,增殖抑制作用明显且具有剂量依赖性,差异有统计学意义（P〈0．05）。DAPI染色和线粒体膜电位检测结果显示,K562细胞发生凋亡。流式细胞仪检测结果显示,细胞凋亡率升高。WIN处理24h后,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性均增加（P〈0．05）。Western印迹法显示,Bax蛋白表达增加,C-myc、Bcl-2蛋白表达下降。结论大麻受体激动剂WIN能抑制白血病K562细胞增殖,并诱导凋亡,其机制可能通过上调Bax蛋白表达,下调C-myc、Bcl-2蛋白表达,以及促使线粒体跨膜电位下降。激活Caspase．3、Caspase-8、Caspase-9蛋白而实现。     

自分泌IL-4对K562细胞诱导的CTL杀伤活性的影响

探讨ＩＬ－４基因修饰对Ｋ５６２细胞诱导的肿瘤特异性ＣＴＬ杀伤活性的促进作用及可能机理。采用逆转录病毒体ＬＸＳＮ将ＩＬ－４ ｃＤＮＡ导入Ｋ５６２细胞,经Ｇ４１８筛选后获得表达ＩＬ－４蛋白的Ｋ５６２克隆。以野生型和载体修饰的相应细胞为对照,检测了ＩＬ－４基因修饰Ｋ５６２细胞诱导的Ｔ细胞增殖反应,用＾５１铬（＾５１Ｃｒ）释放法检测ＣＴＬ杀伤活性。结果发现ＩＬ－４基因修饰的Ｋ５６２细胞诱导的Ｔ细胞增殖反应     

野生型p53基因对白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:建立携野生型p53基因的K562细胞株,研究该细胞内野生型p53基因的表达并观察其生物学特性。方法:构建重组人p53逆转录病毒载体,导入PA317细胞中进行包装,经过病毒滴度测定,筛选高滴度的产病毒细胞克隆。收集培养上清液中的重组人p53逆转录病毒颗粒,感染K562靶细胞,建立携野生型p53基因的K562细胞株。观察该细胞株的生长方式、形态学和生长速度。SP免疫组化染色法检测p53蛋白表达。进一步用流式细胞仪检测p53蛋白表达率和细胞周期变化;双层软琼脂培养实验检测细胞的增殖潜能改变。以pBabe空载体同时实验,作为各阶段的对照。结果:成功地构建了重组逆转录病毒载体pBabe/p53;获得逆转录病毒生产PA317/p53细胞系,最高病毒滴度为4.64×105CFU/m l;获稳定表达p53基因的K562/p53靶细胞,免疫组化结果证实该细胞内有野生型P53蛋白表达,流式细胞仪检测到野生型P53蛋白表达率为1.32%;与对照K562/pBabe细胞比较,K562/p53靶细胞的生长速度下降;软琼脂集落生成的下降率为27.14±4.49%(P<0.05);增殖指数下降,S期比例下降(P均<0.01)。结论:制备了携p53基因的高滴度逆转录病毒,建立携野生型p53基因的K562/p53细胞株,证实表达的野生型p53蛋白对该细胞有抑制作用。     

氨基甾体H42648对K562白血病细胞系的抑制增殖和诱导分化作用

目的：探讨氨基甾体H42648对K562白血病细胞的抑制增殖和诱导分化作用。方法：采用液体培养实验,MTT实验,集落培养实验观察H42648对K562细胞增殖能力的影响,采用Wright-Gi-emsa染色,联苯胺染色和流式细胞术观察H42648对K562细胞的诱导分化作用。结果：H42648作用K562细胞1～5d后,细胞计数和集落计数明显减少,第5d处理组的MTT值显著低于对照组,并呈剂量依赖关系;联苯胺染色OD值升高,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）,形态学观察其趋向成熟分化。流式细胞术检测药物处理4d后K562细胞膜上CD71表面标记表达阳性率为89．19％。结论：氨基甾体H42648可抑制K562细胞增殖并诱导其向红系分化,提示该药可作为一种新型慢粒白血病细胞的诱导分化剂。     

CML自体树突状细胞对CML白血病细胞作用的研究

目的　研究慢性粒细胞白血病 (CML)自体树突状细胞 (DC)对费城 (Ph)染色体细胞的作用。方法　采用液体培养法从 4例 CML 慢性期患者外周血单个核细胞 (PBMNC)中培养出 DC及 T细胞 ,而后将 DC加 IL- 2或 IL- 2激活的 T细胞 ,分别与自体 PBMNC及 K5 6 2细胞共同孵育 6 h,行常规染色体测定 ,分析自体及 K5 6 2 Ph+染色体细胞残存率。结果　从 4例 CML 患者 PBMNC中培养出约 3× 10 5～ 2× 10 6 PBMNC的自体 DC;DC加 IL-2激活的 T细胞比单用 IL- 2激活的 T细胞对自体 Ph+染色体细胞的杀伤作用强 (P<0 .0 0 1) ;DC激活的自体 T细胞对自体 Ph+染色体细胞的杀伤作用强于对 K5 6 2 Ph+染色体细胞的杀伤作用 (P<0 .0 0 1)。结论　 DC激活的 T细胞能有效抑制 Ph+染色体细胞 ;CML 患者 DC激活的自体 T细胞对自体 Ph+染色体细胞特异性的杀伤作用可能受到主要组织相容性 (MHC)的限制     

塞来昔布对K562白血病细胞的细胞毒作用及与伊马替尼的协同效应

目的 研究塞来昔布（Celecoxib）对K562细胞增殖、早期凋亡的影响及Rb蛋白质（PRb）、P27^Kip蛋白质表达变化,观察Celecoxib和伊马替尼联用对K562细胞增殖抑制和凋亡诱导是否具有协同效应.方法将K562细胞用不同浓度的Celecoxib（0、10、20、40、80及160μmol/L）作用36 h,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）测定细胞活力;磷脂结合蛋白Ⅴ分析检测K562细胞早期凋亡;Western印迹检测不同浓度Celecoxib对K562细胞PRb和P27^Kip蛋白质表达的影响;用40 μmol/L Celecoxib、0.2μmol/L伊马替尼分别或联合作用K562细胞,观察药物对细胞活力和凋亡诱导是否具有协同作用.结果Celecoxib能明显抑制细胞活力,并呈药物剂量依赖性：随着Celecoxib浓度增高,K562细胞凋亡百分率相应增高,在160μmol/L浓度,凋亡率达25.92%,蛋白质印迹结果显示,Celecoxib可使K562细胞PRb蛋白质表达呈浓度依赖性下调;P27^Kip蛋白质呈浓度依赖性上调.Celecoxib与伊马替尼联用,抑制K562细胞活力为对照组的27.68%.结论Celecoxib能以浓度依赖性方式抑制K562细胞增殖,诱导细胞凋亡;其抗增殖效应可能与PRb表达下调及P27^Kip表达上调有关.Celecoxib与伊马替尼联用,在抗白血病细胞增殖作用上具有显著的协同效应.     

亚砷酸对白血病K562/A02细胞的作用及机制

目的研究亚砷酸对白血病多药耐药细胞株K562/A02细胞的作用及对多药耐药基因1（mdr1）、P糖蛋白（P-gp）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响,探讨亚砷酸逆转白血病多药耐药（MDR）的作用机制。方法将K562/A02细胞与不同浓度的亚砷酸（0、0.5、2.0、5.0μmol/L）共同孵育,分别在24、48、72h时,用Wrights染色法观察K562/A02细胞形态,流式细胞术（FCM）检测凋亡细胞,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR法检测mdr1mRNA的表达,免疫组织化学法观察P-gp表达,并用ELISA法检测VEGF的浓度。结果随着亚砷酸作用浓度和时间的增加,K562/A02细胞的数目减少,并出现凋亡形态学改变,FCM显示随着作用浓度和时间的增加,细胞凋亡率逐渐上升;从作用48h组开始,mdr1mRNA及P-gp的表达出现显著降低（P〈0.05）,mdr1mRNA条带颜色较空白对照组明显变浅,mdrl/GAPDH灰度比值下降,此时,P-gp的灰度值上升,且随亚砷酸作用浓度和时间的增加,mdr1mRNA条带颜色进一步变浅,表达水平进一步下降;ELISA法检测表明从0.5μmol/L作用24h组开始,VEGF浓度即下降至405.02pg/mL（P〈0.05）,相同作用时间下以5.0μmol/L组较其它浓度组下调VEGF的作用最为显著。结论亚砷酸呈药物浓度-时间依赖性抑制K562/A02细胞增殖,诱导其凋亡,下调VEGF表达,有效抑制了mdrlmRNA的产生和P-gp的合成。     

1,25-(OH)2D3对白血病细胞株K562和SHI-1 ppGalNAcTs表达的影响

目的：探讨在维生素D3的作用下,白血病细胞株K562与SHI-1 ppGalNAcTs表达的变化。方法：应用RT-PCR法研究在不同浓度维生素D3的作用下,白血病细胞株K562与SHI-1 ppGalNAcTs表达的变化。结果1,25-(OH)2D3(10^-6～10^-8mol／L)可分别上调K562细胞株ppGalNAcT2、T4、T5的表达。但在SHI-I细胞株,随着1,25-(OH)2D3浓度的增加ppGalNAcT1表达增加、1、3表达没有变化、T4表达减少。结论：白血病细胞株K562与SHI-1 pp-GalNAcTs的表达不同。在不同浓度维生素D3的作用下,白血病细胞株K562与SHI-1ppGalNAcTs表达的变化也不同,说明不同ppGalNAcTs对1,25-(OH)2D3的反应不同。     

K562细胞红系诱导分化方法的实验研究

目的建立一种高效K562细胞红系诱导分化方法。方法比较不同方法对K562细胞红系诱导分化的效果,优化诱导剂成分组合和剂量组合,建立一种高效的红系诱导,鉴定指标选用细胞形态学、联苯胺染色阳性率计数及RT-PCR测定红系细胞标志物膜带3蛋白(band3)的表达。结果多因素协同诱导K562细胞红系分化120 h后,显微镜下观察细胞形态呈红系中、晚期特征,联苯胺染色阳性率可达(52.7±8.2)%,红系标志物band3在mRNA水平明显高于对照组(P<0.01)。结论多条信号途径协同参与K562细胞红系分化的过程,多因素共同诱导可显著提高K562细胞的红系分化。     

不同浓度重组人促红细胞生成素对高氧暴露下人肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的影响研究

目的　探讨不同浓度重组人促红细胞生成素（rhEPO）对高氧暴露下人肺泡Ⅱ型上皮细胞（A549细胞）功能的影响。方法　2017年1—12月,培养A549细胞,取对数生长期的A549细胞,将其随机分为对照组（将细胞置于37 ℃恒温的50 ml/L CO2培养箱中进行培养）、高氧组（以3 L/min速度通过900 ml/L O2和50 ml/L CO2高纯混合气,持续通气10 min,之后进行密闭培养）及10、20、50、100 U/ml rhEPO组（分别将细胞加入含10、20、50、100 U/ml rhEPO的培养基,之后预处理24 h,再用高氧诱导）,每组中包含8个复孔。24 h后,采用倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化,细胞增殖实验检测细胞增殖水平,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果　高氧组细胞间空隙较大,细胞受损明显,活细胞数量显著降低,悬浮细胞明显增多;10、20、50、100 U/ml rhEPO组细胞损伤改善,50、100 U/ml rhEPO组细胞形态学变化与对照组较为相似。高氧组及10、20 U/ml rhEPO组细胞增殖水平小于对照组（P<0.05）;10、20、50、100 U/ml rhEPO组细胞增殖水平大于高氧组（P<0.05）;50、100 U/ml rhEPO组细胞增殖水平大于10、20 U/ml rhEPO组（P<0.05）;100 U/ml rhEPO组细胞增殖水平大于50 U/ml rhEPO组（P<0.05）。高氧组及10、20 U/ml rhEPO组细胞凋亡率大于对照组（P<0.05）;10、20、50、100 U/ml rhEPO组细胞凋亡率小于高氧组（P<0.05）;50、100 U/ml rhEPO组细胞凋亡率小于10、20 U/ml rhEPO组（P<0.05）;100 U/ml rhEPO组细胞凋亡率小于50 U/ml rhEPO组（P<0.05）。结论　高氧抑制A549细胞增殖、促进A549细胞凋亡,而rhEPO可减轻这种作用,且50、100 U/ml rhEPO能有效抑制A549细胞发生损伤。