5和5/F35型腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞转染效率的比较

背景:在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要.目的:对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率.设计、时间及地点:对比观察,于2008-03/10在解放军北京军区总医院血液科实验室完成.材料:骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者,均无造血系统疾病.方法:采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代后用流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞表型;按1×104/孔密度接种于24孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以碱性磷酸酶、油红O染色检测其分化特性.用不同滴度编码增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数转染体外培养的人骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察.主要观察指标:流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白阳性表达率,并用锥虫蓝拒染法检测不同病毒滴度感染后人骨髓间充质干细胞活细胞比例.结果:人骨髓间充质干细胞表面CD166、CD29、CD73、CD31、CD45、CD34和CD14阳性率分别为95.08%、99.53%、72.26%,1.50%,2.02%,3.80%和4.94%.人骨髓间充质干细胞成骨诱导后14 d碱性磷酸酶染色为阳性,成脂诱导后14 d油红O染色均为阳性.Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad51F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数分别感染人骨髓间充质干细胞,2 d后前者增强型绿色荧光蛋白阳性牢分别为(0.72±0.14)%,(4.97±0.46)%,(9.80±3.43)%和(45.53±6.32)%:后者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(24.31±10.55)%,(55.19±13.73)%,(87.68±9.5)%和(96.57±5.64)%.在5,20,100的感染复数,各组细胞存活率均在95%以上.在400的感染复数,细胞存活率明显降低,在90%以下.结论:Ad5/F35对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率明显优于Ad5载体.     

Ad5F35嵌合腺病毒载体介导的突变性IκBα对白血病细胞凋亡的诱导作用

多种不同类型的白血病均存在持续活化的核转录因子κB(NF-κB),而抑制NF-κB活化诱导细胞凋亡有可能成为治疗白血病新的方法。本研究探讨修饰的5型腺病毒载体即Ad5F35嵌合腺病毒载体(Ad5F35 Vec)介导的突变性IκBα(IκBαDN)对白血病细胞凋亡的作用。将携带缺失5’端1-70个氨基酸编码序列的人IκBαAd5F35-IκBαDN Vec转染HL-60细胞。采用流式细胞术、DNA结合试验、实时定量PCR和Western blot技术分别检测细胞凋亡、NF-κB DNA结合活性、IκBα,cIAP-2和xIAP的表达。结果显示,转染48小时后,转染Ad5F35-IκBαDN Vec细胞、空白载体Ad5F35-EGFP Vec细胞以及未转染细胞的凋亡率分别为(22.53±2.999)%,(6.08±2.464)%和(4.86±1.366)%,其差异具有显著意义(Ad5F35-IκBαDN Vec vs未转染:p<0.001;Ad5F35-IκBαDNVec vs Ad5F35-EGFP Vec:p<0.001,p<0.002)。同时,NF-κB DNA结合活性降低,IκBα表达增加,但cIAP-2和xIAP mRNA的表达降低。结论:Ad5F35 Vec能够有效介导IκBαDN cDNA在HL-60细胞的表达,IκBαDN可抑制HL-60细胞NF-κB DNA结合活性并诱导其凋亡。     

Lentivirus载体对许旺细胞的转染效率

背景：近年来研究较多的LV载体,因其强大的转染能力以及较高的转染效率等特点,在基因转染的实验中应用越来越广泛。目的：进一步验证Lentivirus载体在体外对原代许旺细胞的转染效率。方法：以Lentivirus三质粒系统构建病毒载体,在体外分别以MOI值为1,5,10,20,40对原代大鼠许旺细胞进行转染,转染后第1,3,5,7,9天在荧光显微镜下观察Lentivirus携带的荧光表达情况,并在显微镜的计数方格内计算细胞的转染情况。发出绿色荧光的为转染成功的许旺细胞,否则认为没有转染病毒载体的,从而算出转染效率。结果与结论：在病毒转染3 d后,在各不同MOI值的培养孔中,均能观察到极少量的荧光反应,在第5天时,荧光数量较前明显增多。第7天时达到高峰,第9天的荧光数量与第7天变化不明显。从细胞转染效率来看,不同的MOI值明显不同,MOI值为1时的转染效率约为45%,MOI值为5时为80%,MOI值为10时为90%,MOI值为20时为78%,MOI值为40时转染效率为70%。     

人SPK1基因的重组腺病毒载体感染效率及表达特性研究

目的研究重组腺病毒载体感染小鼠神经瘤细胞(N2a)的感染效率及重组腺病毒介导的人鞘氨醇激酶-1(sphingosinekinase-1,SPK1)基因在N2a细胞表达特性.方法用流式细胞仪检测感染效率,用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的表达;用 Westernblot方法检测SPK1蛋白的表达.结果 N2a细胞的感染效率和绿色荧光蛋白表达量在一定范围内随着病毒感染复数(Multiplicityofinfection,MOI)的增加而增高,MOI为100时感染效率达峰值为(99.57±0.133)%.以 MOI为25的重组腺病毒感染N2a细胞,感染效率随时间变化(0-72h)而增高,72h峰值为(98.03±0.721)%,到96h有所降低(P<0.05).SPK1蛋白的表达量较感染空病毒组和未感染病毒组明显升高.结论重组腺病毒在适宜的 MOI下,在N2a细胞中96小时内均有较高的感染效率,且重组腺病毒介导的人SPK1基因在体外能够得到有效的表达.     

携带人可溶性TRAIL基因的重组腺病毒在肺癌细胞中的转染效率及表达特性研究

目的研究重组腺病毒感染肺腺癌细胞A549的转染效率及重组腺病毒介导的人可溶性肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(hTRAIL95-281)基因的体外表达。方法用不同感染滴度(MOI)(0-10 000 VP/cell)的重组腺病毒Ad-CMV-EGFP转染A549细胞后48 h收集细胞,经流式细胞仪检测其转染效率,并在共聚焦荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;用MOI为5 000 VP/cell的Ad-CMV-EGFP感染肿瘤细胞后不同时间(24 h、48 h、72 h和96 h)收集细胞,经流式细胞仪检测其转染效率;用重组腺病毒Ad-CMV-hTRAIL95-281感染293T细胞后不同时间收集培养物用ELISA方法检测上清中的TRAIL表达。结果重组腺病毒载体对A549细胞的转染效率和绿色荧光蛋白表达在一定范围内随着MOI的增加而增高,MOI为5 000 VP/cell时转染效率达峰值,MOI为10 000 VP/cell时转染效率反而降低。重组腺病毒转染A549细胞后72 h内转染效率随时间的变化而增高,峰值为98%,96 h有所降低(P0.05)。转染重组腺病毒Ad-CMV-hTRAIL95-281的293T细胞在转染后24 h表达量最高(P0.001),达到131.45 pg/ml,48 h时TRAIL蛋白表达量明显降低(P0.01),72小时也有继续降低的趋势。结论重组腺病毒在适宜的MOI值下,在A549细胞中96小时内均有较高的转染效率,且重组腺病毒介导的可溶性hTRAIL基因在体外能够有效表达。     

提高腺病毒载体转染造血细胞效率的研究进展

重组腺病毒作为基因转移的载体已经广泛应用于基因治疗的基础研究和临床试验，但造血细胞由于缺乏腺病毒特异性受体柯萨奇-腺病毒受体(coxsacke virus and adenovirus receptor，CAR)导致转染效率较低，从而限制了腺病毒载体在造血系统的应用。多种策略可以提高腺病毒转染造血细胞的效率，这些策略包括腺病毒本身的改造、造血细胞CAR表达的提高等。本文就这一领域的主要研究进展作一综述。     

2型重组腺相关病毒对人脐血CD34+造血干/祖细胞的转导效率研究

为探讨 2型重组腺相关病毒 (rAAV 2 )载体能否有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,采用rAAV 2 /GFP感染经免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果显示 ,转导 19小时后感染复数 (MOI)为 2× 10 5时 ,CD34+细胞GFP基因的表达率为 4 3%。结论 :rAAV 2能有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞。     

小鼠骨髓内皮细胞条件培养液体外扩增胚胎及成体造血干/祖细胞的差异及其机制探讨

本研究比较小鼠骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)联合FL和TPO对卵黄囊和骨髓造血干／祖细胞体外生长的影响，并对其机制进行探讨。取卵黄囊和骨髓单细胞悬液，对照组中加入含10％FBS的DMEM，实验组分别加入10％mBMEC-CM，FL(5ng/ml)和TPO(2ng／ml)，10％mBMEC-CM复合FL和TPO培养24小时后进行集落培养，计数CFU-GM和HPP-CFC的集落数。应用Atlas cDNA Expression Array对卵黄囊和骨髓造血细胞表达的细胞因子受体进行检测。结果表明：mBMEC-CM能扩增卵黄囊和骨髓CFU-GM和HPP-CFC，其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强；mBMEC-CM扩增骨髓CFU-GM和HPP-CFC的能力明显强于其扩增卵黄囊CFU-GM和HPP-CFC的能力。检测到小鼠卵黄囊及骨髓造血细胞存在差异表达的细胞因子受体；卵黄囊造血细胞表达PDGF-Rβ，PDGF-Ra和促肾上腺皮质激素释放因子受体，而在骨髓造血细胞中未检测到上述受体的表达；在骨髓造血细胞中表达的IFN-γR，GM-CSFR，多巴胺D2受体和卵泡刺激素受体则未在卵黄囊造血细胞中检测到mRNA的表达。结论：mBMEC-CM能支持卵黄囊和骨髓造血祖细胞的体外扩增，其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强；mBMEC-CM对骨髓造血祖细胞表现出更强的扩增作用。检测到卵黄囊和骨髓造血细胞之问存在差异表达的细胞因子受体，提示mBMEC-CM对胚胎及成体造血细胞扩增中存在的差异可能与两种造血细胞存在差异表达的细胞因子受体有关。