糖基化终产物对大鼠肾系膜细胞结缔组织生长因子作用的研究

目的：探讨糖基化终产物（AGEs）对大鼠肾系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF) mRNA表达及细胞外基质（ECM）合成的影响。方法： 在培养的大鼠肾系膜细胞中，分别加入不同浓度的糖化牛血清白蛋白(AGE-BSA)及牛血清白蛋白(BSA)进行刺激，ELISA法检测培养上清中的纤连蛋白（FN）及Ⅳ型胶原（ColⅣ）含量，RT-PCR检测细胞CTGF mRNA表达。结果： 与加入BSA组比较，AGE-BSA组CTGF mRNA表达明显增强（P<0.01），上清中FN及ColⅣ合成增加（P<0.01）， 与CTGF mRNA表达量之间呈正相关（r=0.83）。 结论： AGEs能明显诱导大鼠肾系膜细胞CTGF mRNA的表达，提示AGEs可能通过上调CTGF mRNA的表达引起ECM积聚。     

糖基化终产物对人单核细胞源树突状细胞糖基化终产物受体表达的研究

目的：探讨糖基化终产物 (AGEs）)对人单核细胞源树突状细胞（MDCs）糖基化终产物受体（RAGE） 表达的影响。 方法： 用免疫磁珠分离人外周血CD14+单核细胞，经含rhGM-CSF（100 μg/L）和rhIL-4（50 μg/L）的RPMI-1640培养，使其分化为MDCs，采用RT-PCR和Western blotting法，观察糖基化-白蛋白（AGE-BSA）对MDCs RAGE mRNA和蛋白表达的影响，同时检测培养液上清中IFN-γ和IL-12的浓度。 结果： AGE-BSA诱导DCs RAGE mRNA和蛋白的表达（P＜0.05），高于空白对照组，并且明显促进了DCs IFN-γ和IL-12的分泌（P＜0.05）。BSA干预组与空白对照组相比差异无显著（P＞0.05）。 结论： AGEs能够上调DCs RAGE的表达，并且促进了DCs IFN-γ和IL-12的分泌，这可能是糖尿病通过DCs促进动脉粥样硬化发生的重要机制之一。     

糖基化终产物诱导心肌细胞炎症反应的研究

目的： 探讨糖基化终产物(AGEs)对乳鼠正常心肌细胞和胰岛素抵抗心肌细胞炎症反应的影响。方法: 原代培养乳鼠心肌细胞并建立胰岛素抵抗心肌细胞模型，用不同浓度葡萄糖孵育的糖化白蛋白（AGE-BSA）干预24 h，采用RT-PCR、免疫细胞化学染色和透射电镜法，观察AGE-BSA对细胞TNF-α mRNA和PPAR-γ mRNA表达、NF-κB活化以及细胞超微结构的影响。结果: AGE-BSA可诱导心肌细胞TNF-α mRNA表达和NF-κB活化,并可抑制PPAR-γ mRNA表达，与对照组及BSA组比较有显著差异（P<0.05）。BSA组与空白对照组比较差异无显著（P>0.05）。随着孵育葡萄糖浓度的增加，各AGE-BSA组间比较有显著差异（P<0.05）。AGE-BSA干预后胞内线粒体和滑面内质网增多、扩大。结论: AGEs能上调心肌细胞TNF-α mRNA表达和NF-κB活化，并可抑制PPAR-γ mRNA表达，提示AGEs在糖尿病心肌病的发生中可能有重要的作用。     

糖基化终末产物对大鼠肾系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物-1表达韵影响

目的：观察糖基化终末产物（AGEs）对大鼠肾系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）表达的影响及其与细胞外基质（ECM）成分含量的关系。方法：体外培养正常大鼠肾系膜细胞，分别用糖化牛血清白蛋白（AGEs）及未经糖化的牛血清白蛋白（BSA）处理，以常规培养的肾系膜细胞作为对照，检测不同时间、不同浓度AGEs对纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原、PAI-1表达的影响。MTT法检测AGEs对系膜细胞增殖的作用，ELISA测定条件培养基中FN、Ⅳ型胶原及PAI-1蛋白含量，逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）检测系膜细胞PAI-1 mRNA的表达。结果：与相应浓度的BSA比较，AGEs（0—200mg／L）对系膜细胞增殖无明显影响，但可不同程度地刺激系膜细胞FN、Ⅳ型胶原、PAI-1蛋白的产生。RT—PCR检测显示，给予AGEs（100mg／L）的系膜细胞PAI-1 mRNA的表达明显增加（P〈0．01）。结论：AGEs促进系膜细胞PAI—1的表达，提示AGEs通过上调PAI-1的表达而减少细胞外基质降解，可能是糖尿病肾病细胞外基质积聚的原因之一。     

氨基胍对糖基化终产物干预下人肾系膜细胞β1-整合素及胞外基质成分表达的影响

目的观察氨基胍（AG）对糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）干预的人肾系膜细胞（human renal mesangial cell,HRMC）β1-整合素表达以及胞外基质（extracellular matrix,ECM）成分层粘连蛋白（Laminin,LN）分泌的影响。方法用葡萄糖和牛血清白蛋白制备糖基化终产物（AGE-BSA）,用不同浓度的AG和AGE-BSA共同以及AGE—BSA单独干预体外培养的HRMC。RT—PCR法测定细胞β1-整合素mRNA水平;Western Blot法检测β1-整合素蛋白表达;放射免疫分析法测定细胞培养上清LN含量。结果各浓度氨基胍组均能下调由AGE—BSA诱导的HRMC β1-整合素mRNA和蛋白表达的升高并抑制培养上清LN的分泌,与AGE—BSA组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论氨基胍通过抑制AGEs引起的上述改变,发挥一定的肾脏保护作用。     

糖基化终末产物对大鼠肾系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物-1表达的影响

目的:观察糖基化终末产物(AGEs)对大鼠肾系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)表达的影响及其与细胞外基质(ECM)成分含量的关系。方法:体外培养正常大鼠肾系膜细胞,分别用糖化牛血清白蛋白(AGEs)及未经糖化的牛血清白蛋白(BSA)处理,以常规培养的肾系膜细胞作为对照,检测不同时间、不同浓度AGEs对纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原、PAI-1表达的影响。MTT法检测AGEs对系膜细胞增殖的作用,ELISA测定条件培养基中FN、Ⅳ型胶原及PAI-1蛋白含量,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测系膜细胞PAI-1mRNA的表达。结果:与相应浓度的BSA比较,AGEs(0-200mg/L)对系膜细胞增殖无明显影响,但可不同程度地刺激系膜细胞FN、Ⅳ型胶原、PAI-1蛋白的产生。RT-PCR检测显示,给予AGEs(100mg/L)的系膜细胞PAI-1mRNA的表达明显增加(P<0.01)。结论:AGEs促进系膜细胞PAI-1的表达,提示AGEs通过上调PAI-1的表达而减少细胞外基质降解,可能是糖尿病肾病细胞外基质积聚的原因之一。     

糖基化终产物对人肾系膜细胞Fractalkine分泌的影响

目的 既往实验已观察到糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)可增加人肾系膜细胞(human renal mesangial cell,HRMC) Fractalkine (FKN) mRNA和蛋白的表达,现进一步探讨AGEs对HRMC FKN的趋化功能及分泌的影响.方法 运用体外制备的糖基化修饰的牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin,AGE- BSA)干预HRMC,用Transwall小室装置检测HRMC趋化单核细胞的功能,用ELISA法检测HRMC上清液中FKN的蛋白含量.结果 1. AGE-BSA组HRMC趋化单核细胞数显著高于对照组,FKN中和抗体组HRMC趋化单核细胞数较AGE-BSA组显著减少;2. 随着AGE-BSA浓度的增高及干预时间的延长,细胞的FKN蛋白分泌水平随之增高,且显著高于对照组(P<0.01).结论 AGE-BSA可增强HRMC趋化单核细胞的功能,此效应可被FKN中和抗体部分抑制,且AGE-BSA呈时间和浓度依赖性增加HRMC FKN的蛋白分泌,提示AGEs可能部分通过FKN途径参与糖尿病肾病的发生发展.     

晚期糖基化终产物对人脂肪间充质干细胞功能影响的体外研究*

 目的：探讨晚期糖基化终产物（AGEs）对人脂肪来源的间充质干细胞（hADSCs）促进创伤修复功能的影响。方法：体外培养hADSCs,实验分为牛血清白蛋白（BSA）对照组、低浓度糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）效应组和高浓度AGE-BSA效应组。采用WST法和Transwell迁移实验检测各组细胞增殖和迁移情况。应用实时定量PCR和ELISA检测各组细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）和胰岛素样生长因子1（IGF-1）的表达。结果：与对照组相比, AGE-BSA组增殖能力和迁移能力明显下降（P<0.05）,VEGF、HGF和IGF-1 mRNA及蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论：AGEs能损伤hADSCs的促进创伤修复功能,因而能够影响hADSCs治疗糖尿病皮肤溃疡病的治疗效果。     

盐酸氨基胍对糖基化终产物诱导的人肾小球系膜细胞调节活化蛋白表达的影响

目的探讨盐酸氨基胍对糖基化终产物（AGEs）促进人肾系膜细胞（HRMC）趋化因子RANTES表达和分泌的干预效应。方法常规方法制备糖基化终产物（AGEs-BSA）和盐酸氨基胍干预体外培养的HRMC,收集培养上清和细胞,ELISA法检测上清中RANTES浓度,实时定量RT-PCR检测RANTES mRNA表达水平,western blot检测RANTES蛋白表达。结果盐酸氨基胍干预组HRMC RANTES的mRNA和蛋白表达以及蛋白分泌明显低于AGE-BSA组（P〈0.05）;且降低水平呈浓度依赖性。结论盐酸氨基胍能抑制AGEs诱导的HRMC RANTES的表达和分泌。     

晚期糖基化终产物通过mTORC1/uPAR途径促进足细胞移动

 目的:足细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1（mTORC1）活化是糖尿病肾病的重要发病机制。我们前期在db/db小鼠中观察到调控足细胞活动度的尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）表达增加。本研究旨在研究晚期糖基化处理的牛血清白蛋白（AGE-BSA）对mTORC1、uPAR和足细胞活动度的影响并初步探索其可能的分子联系。方法: 体外培养小鼠肾小球足细胞,MTT法和免疫荧光分析各刺激物及干预剂对足细胞存活率及细胞骨架的影响。Western blotting检测正常对照组、对照BSA组及AGE-BSA处理组mTORC1的活性及uPAR的表达水平,划痕实验检测足细胞的活动度。进一步采用雷帕霉素抑制AGE-BSA组mTORC1的活性,观察uPAR和细胞活动性的改变。结果: 在预设浓度及干预时间下各刺激物及干预剂对细胞存活率及细胞骨架无明显影响。AGE-BSA 可上调足细胞mTORC1的活性和uPAR的水平,并促进足细胞移动。雷帕霉素能抑制AGE-BSA引起的uPAR表达水平的上调和细胞活动性的增强。结论: AGE-BSA 可能通过mTORC1/uPAR途径导致足细胞移动性增强。     

AGEs对肾小管上皮细胞转分化、1型胶原合成及smad信号通路的影响

目的:观察终末期糖基化终产物(AGEs)对正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E ）转分化、collagenⅠ合成及Smads信号通路的影响。 方法:应用自制的AGEs（AGE-BSA）刺激NRK52E细胞，采用免疫细胞化学方法检测pmad2/3核表达情况；ELISA方法检测细胞培养上清TGF-β₁的浓度；RT-PCR检测TGF-β₁、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达；Western印迹检测α-平滑肌肌动蛋白（SMA）、E-钙粘着糖蛋白（cadherin）和1型胶原（collagenⅠ）蛋白的表达。 结果: AGE-BSA刺激15 min后pSmad2/3核表达明显增加，于30 min（68%）和24 h（76%）出现两个高峰，与刺激前及时间匹配的BSA对照组比较均有显著差异（P<0.05）；AGE-BSA以时间依赖方式上调TGF-β₁、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达；NRK52E细胞α-SMA和collagenⅠ蛋白表达高于对照组（P<0.01），E-cadherin蛋白表达低于对照组（P<0.01），细胞上清液TGF-β₁的浓度高于对照组（P<0.01）。 结论:AGEs可诱导肾小管上皮细胞Smads信号通路活化，促进肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质collagenⅠ的合成。     

心肌细胞结缔组织生长因子的表达及TGF-β1对其表达的影响

目的： 研究纯化的心肌细胞中结缔组织生长因子（CTGF）基因及蛋白的表达，并探讨转化生长因子β1（TGF-β₁）对其表达的影响。方法: 分离培养乳鼠心肌细胞，48 h后用流式分选方法（FACS）分选纯化心肌细胞，纯化的心肌细胞继续培养48 h。分为对照组（空白纯化心肌细胞组）和TGF-β₁刺激组，用RT-PCR方法测定两组细胞中TGF-β₁、CTGF、纤维连接蛋白（FN） mRNA的含量， 用Western blotting法检测两组细胞胞浆蛋白中CTGF、FN含量。结果: 心肌细胞中有较低水平的CTGF表达，在予以 TGF-β₁刺激后细胞内CTGF mRNA与蛋白含量分别提高 2.49 倍(P<0.01) 和3.63 倍（P<0.01），FN mRNA与蛋白含量分别提高 1倍(P<0.01)和4.18倍（P<0.01），而TGF-β1mRNA水平减少34%（P<0.01）。结论: 纯化的心肌细胞有CTGF的基础表达，并且TGF-β1可以明显上调其表达，提示心肌细胞主动参与了心肌纤维化过程。     

大鼠心肌细胞结缔组织生长因子的诱导表达及RNA干扰研究

目的： 探讨心肌细胞对结缔组织生长因子（CTGF）的基础表达及转化生长因子β1（TGF-β1）对其分泌的诱导作用,并进一步研究以RNA干扰(RNAi)技术靶向抑制CTGF对下游纤维化因子的影响。方法: 实验分为以下5组： 组Ⅰ：单纯心肌细胞组;组Ⅱ：TGF-β1诱导组;组Ⅲ：阴性质粒组;组Ⅳ：RNAi组;组Ⅴ：脂质体组。分离培养Sprague Dawley（SD）大鼠乳鼠心肌细胞,以5 μg/L终浓度的TGF-β1对培养的心肌细胞进行诱导,再通过脂质体法将靶向大鼠CTGF的短发夹RNA(shRNA)干扰质粒转染入心肌细胞,流式细胞技术分选出成功转染的细胞。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹（Western blotting）技术进一步研究各实验组心肌细胞CTGF、纤维连接蛋白（FN）mRNA及蛋白的表达水平。结果: 单纯心肌细胞组对CTGF、FN均有低水平的基础分泌,在予以TGF-β1诱导后表达水平显著升高（P＜0.01）;而在靶向特异性RNAi后,上述因子的表达均被显著抑制（P＜0.01）;并且纤维化因子FN的表达水平与促纤维化因子CTGF的表达显著相关。结论: 心肌细胞可自主低水平分泌或诱导后高表达CTGF及下游纤维化因子FN,提示心肌细胞主动参与了心肌纤维化及心脏重塑过程;而通过RNAi靶向抑制CTGF后可阻抑心肌细胞分泌下游纤维化因子,进一步提示CTGF是促心肌纤维化的关键性细胞因子,而RNAi是一种特异高效的很有前途的干预手段。     

转染结缔组织生长因子基因的大鼠肾系膜细胞纤连蛋白和Ⅳ型胶原表达的改变

目的观察大鼠肾系膜细胞（MsC）转染结缔组织生长因子（CTGF）基因转染阳性细胞克隆中纤连蛋白（FN）和Ⅳ型胶原（ColⅣ）表达的改变,探讨CTGF在肾小球硬化发生中的作用。方法经脂质体介导将含有CTGF的重组表达质粒转染至大鼠MsC,用G418筛选及Western blot和半定量逆转录聚合酶链反应作鉴定;检测阳性克隆FN、ColⅣ蛋白及其mRNA表达的改变。结果成功建立高表达CTGF的阳性MsC克隆（MCT-1,2）,并证实其与对照组相比,阳性MsC克隆FN、ColⅣ的表达均有上调,其FN蛋白及其mRNA表达分别增高2．9倍和3．2倍,ColⅣ蛋白和mRNA表达分别增高为2．4倍和3．8倍。结论CTGF可促进MsC的FN、ColⅣ的表达。表明其在肾小球硬化发生中起促进作用。     

Advanced glycation end products (AGEs) and their receptor (RAGE) induce apoptosis of periodontal ligament fibroblasts

Diabetics have an increased prevalence of periodontitis, and diabetes is one of the causative factors of severe periodontitis. Apoptosis is thought to be involved in this pathogenic relationship. The aim of this study was to investigate apoptosis in human periodontal ligament (PDL) fibroblasts induced by advanced glycation end products (AGEs) and their receptor (RAGE). We examined the roles of apoptosis, AGEs, and RAGE during periodontitis in diabetes mellitus using cultured PDL fibroblasts that were treated by AGE-modified bovine serum albumin (AGE-BSA), bovine serum albumin (BSA) alone, or given no treatment (control). Microscopy and real-time quantitative PCR indicated that PDL fibroblasts treated with AGE-BSA were deformed and expressed higher levels of RAGE and caspase 3. Cell viability assays and flow cytometry indicated that AGE-BSA reduced cell viability (69.80±5.50%, P<0.01) and increased apoptosis (11.31±1.73%, P<0.05). Hoechst 33258 staining and terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling revealed that AGE-BSA significantly increased apoptosis of PDL fibroblasts. The results showed that the changes in PDL fibroblasts induced by AGE-BSA may explain how AGE-RAGE participates in and exacerbates periodontium destruction.     

AGEs对人主动脉内皮细胞线粒体融合蛋白表达的影响

目的:明确晚期糖基化终产物(AGEs)是否可引起内皮细胞线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2表达水平的变化。方法:AGEs用糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)代替。将购买的原代人主动脉内皮细胞株进行体外扩增、传代、分组,进行AGEs干预,分为对照组,不同浓度梯度的AGEs干预组(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L)和干预不同时间组(分别是100 mg/L的AGEs干预人主动脉内皮细胞6 h、12 h、24 h和48 h)。采用实时荧光定量PCR方法对AGEs干预后的人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的mRNA表达水平进行检测;采用Western blot法对AGEs干预后的人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的蛋白表达水平进行检测。结果:不同浓度AGEs干预人主动脉内皮细胞24 h可引起Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平显著降低;100 mg/L AGEs干预人主动脉内皮细胞6 h,Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平与对照组相比无显著变化,而干预12 h、24 h和48 h均引起人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平显著降低。结论:AGEs干预体外培养的人主动脉内皮细胞12 h后其线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2的表达水平降低,提示AGEs可能引起内皮细胞线粒体动力学的改变,并可能通过这一途径引起内皮细胞线粒体功能异常,而导致内皮细胞的功能异常。