一种简便实用的原位杂交变性方法

变性是指ＤＮＡ双螺旋链之间的氢键断裂 ,形成单链的过程。进行杂交反应时 ,探针和靶核酸序列都必须是单链的。加热是ＤＮＡ变性的最常用方法 ,我们经过反复探索 ,利用ＰＣＲ扩增仪进行原位杂交ＤＮＡ变性 ,取得了满意的效果。1　材料和方法1 1　材　料①标本 :收集本院经组织学证实为宫颈尖锐湿疣或宫颈表皮内瘤变Ⅰ～Ⅱ级 (ＣＩＮⅠ～Ⅱ级 )标本共 43例连续性病例 ,其中宫颈尖锐湿疣 30例 ,ＣＩＮⅠ～Ⅱ级 13例。②试剂 :ＨＰＶ6 / 11ＤＮＡ探针和ＩＳＨ检测试剂盒均为美国Ｍａｘｉｍ公司产品。③设备 :ＰＣＲ扩增仪和原位载板 (型号为Ｐ…     

非放射性反义RNA探针的原位杂交技术探讨

以自制的反义ＲＮＡ探针研究了非放射性标记原位杂交技术。结果表明：①以小柱装置提取质粒ＤＮＡ，方法快速、简便、且纯度好；②以线性化的质粒ＤＮＡ为模板进行体外转录，加Ｂｉｏ－１４－ＣＴＰ标记，需用ｐＨ８．０的转录缓冲液；③实验中需防止Ｒｎａｓｅ污染，但也可应用ＲＮａｓｅ作为实验对照和减低背景；④杂交液中以不加硫酸葡聚糖为宜，杂交温度以４２℃为佳。     

地高辛素标记DNA探针原位杂交的简便方法

原位杂交是将重组核酸分子杂交技术与组织细胞化学及免疫组织化学技术结合起来,在组织细胞原位显示某种特定基因、mRNA及其产物(特异蛋白质)的表达进行定位和定量检测的一项新技术。该方法用于组织和细胞学研究27年来[1],不论是对细胞内的DNA,还是mRNA已有大量成功的报告[2,3]。其中,DNA探针一般比RNA探针敏感,使用较方便,能选用各种标记方法,且杂交适宜温度的范围较宽。但操作程序较复杂,不易驾驭。     

DNA探针非同位素标记的研究进展

DNA探针技术对基础研究及临床各种传染病、遗传病、肿瘤等疾病的诊断越来越显示出其独有的优势.在使用的各种同位素中,Durrant等人发现35S标记的探针在分解性和敏感性方面优于3H和32P,而33P相似于35S,较35S又有反应背景干净的优点,只是曝光时间及半衰期较35S短[1].     

一种简便的非放射性原位杂交法检测胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA

目的 检测大鼠组织中胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mPNA的表达.方法 根据大鼠胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶基因序列合成两端含有相邻胸腺嘧啶结构的单链DNA探针,完成杂交后利用抗胸腺嘧啶二聚体抗体与抗原化的单链DNA探针进行反应,再运用免疫组织化学方法从而检出组织中目标mRNA的表达.结果 大鼠胰腺组织的外分泌腺细胞的细胞质被特异性染色,其他的组织细胞均显示阴性.结论 本试验中采用的原位杂交方法操作简便安全、无放射性,并且具有很高的灵敏度和特异性.实验结果提示大鼠胰腺外分泌腺细胞特异性表达胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA,而其他组织细胞不表达.     

非放射性反义RNA探针的原位杂交技术探讨

以自制的反义ＲＮＡ探针研究了非放射性标记原位杂交技术。结果表明：①以小柱装置（ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎ）提取质粒ＤＮＡ，方法快速、简便、且纯度好；②以线性化的质粒ＤＮＡ为模板进行体外转录，加Ｂｉｏ－１４－ＣＴＰ标记，需用ｐＨ８．０的转录缓冲液；③实验中需防止ＲＮａｓｅ污染，但也可应用ＲＮａｓｅ作为实验对照和减低背景；④杂交液中以不加硫酸葡聚糖为宜，杂交温度以４２℃为佳。     

同一细胞非放射性双原位杂交信号显示技术

目的：探讨同一细胞内双原位杂交信号的显示技术。方法：以地高辛标记的polβ探针加生物素标记的表皮生长因子受体(EGFR)探针或生物素标记的wtp53探针对人食管癌Eca-109细胞同时进行原位杂交后,以anti-Dig-AP孵育,以AP-Red为底物显色,杂交信号呈桔红色或桔黄色细颗粒。继之以SA-AP孵育后以NBT／BCIP底物显色,杂交信号呈蓝紫色颗粒。结果：在同一细胞内可见桔黄色和蓝紫色颗粒双杂交信号。结论：应用非放射性双杂交信号的原位杂交技术可观察单个细胞内2种基因共表达的情况。     

用链亲和素—胶体金原位杂交方法检测白血病多药耐药基因的表达

目的：检测白血病患者骨髓单个细胞多药耐药基因（ＭＤＲ１）的表达。方法：链亲和素－胶体金原位杂交（ＳＡＧ－ＩＳＨ）。结果：５２例患者中２４例（４６．２％）ＭＤＲ１呈阳性表达，其中初治组阳性１０／２８＝３５．７％，复发难治组１２／１８＝６６．７％，两组相差显著（Ｐ〈０．０５）。持续完全缓解组１／４＝２５．０％。结论：ＳＡＧ－ＩＳＨ检测ＭＤＲ１方法简便，敏感且特异，并能准确定位，可预测白血病对化疗的敏感     

DNA抽提与基因探针标记的几种方法比较

比较了苯酚—氯仿、NP—40和盐酸胍3种不同的 DNA 抽提方法,并对基因探针标记同位素掺入法(缺口平移法和随机引物法)和非同位素掺入法在单拷贝基因检测中的应用进行了探讨。     

100例自然流产或死胎组织的染色体FISH检测

目的 1.探讨中国孕妇妊娠前三个月、中三个月、后三个月自然流产或死胎死产胎儿组织细胞中染色体异常总发生率及异常种类和各种异常发生率;2.为完善中国产前诊断与遗传咨询指南提供理论依据。方法对95例自然流产绒毛及5例死胎肌肉标本利用FISH检测13、16、18、21、22、X、Y染色体数目异常。结果检出异常病例44例,异常率为44%,其中阳性病例占20.45%,包括16号染色体三体,X染色体单体及47,XXY,分别占异常病例的2.27%,13.64%,4.55%。孕妇前、中、后三个月自然流产或死胎死产的发生率分别为77%,20%,3%;染色体异常率分别为66.67%,33.33%,0。结论染色体异常是导致自然流产的重要因素之一,FISH检测是进行染色体检查的一项有效方法,对自然流产的病因、诊断及再次妊娠具有重要的指导意义。     

荧光原位杂交法对血培养常见菌的快速鉴定

目的 建立快速鉴定阳性血培养的荧光原位杂交法。方法 针对血培养中的常见病原菌，以细菌16S rRNA和真菌18S rRNA为靶序列，设计种属特异性的寡核苷酸探针。BacT／ALERT仪器报警后，取阳性血培养液15μl于玻片上，50℃杂交1h，然后50℃下洗涤缓冲液洗涤10min，荧光显微镜下检测鉴定结果。同时对临床标本进行常规培养鉴定。结果 118份阳性血培养标本中，116份标本杂交法检测为阳性，敏感率为98．3％。除少数阴性杆菌，阳性杆菌不能鉴定至种属的水平外，92．5％的病原体可于2h内鉴定至种或属的水平。结论 荧光原位杂交法可快速鉴定血培养中的常见菌，为临床细菌和真菌感染的早期用药提供可靠的科学依据。     

4878例准分子激光角膜原位磨镶术治疗近视疗效观察

目的观察应用准分子激光原位角膜磨镶术治疗近视的效果。方法使用美国VISX STAR S4准分子激光仪对4878例（9718只眼）近视患者行准分子激光角膜原位磨镶术矫治。术前球镜屈光度为-1．00～-14．00DS散光0— -4．50DC，按术前屈光度分为：1．组-1．00～-6．00DS。4328眼。2．组-6．25～-10．00DS，3616眼 3组-10．25～-14．00DS，1774眼。对三组术后的裸眼视力进行比较分析及术后裸眼视力和术前最佳矫正视力进行比较分析。结果 I组49．6％视力超过1．2，16．5％术后裸眼视力低于术前最佳矫正视力。II组1．9％裸眼视力超过1．2，6．9％低于术前最佳矫正视力。Ⅲ组34．3％裸眼视力超过1．2，16．5％低于术前最佳矫正视力。结论应用准分子激光原住磨镶术治疗近视可获得良好的治疗效果，并发症少，手术预见性和稳定性好，安全性高。     

间期细胞原位PCR检测B细胞系恶性淋巴瘤

目的：应用原位PCR技术检测B细胞系恶性淋巴瘤。方法：采用免疫球蛋白重链（IgH)基因第三互补决定区（CDR－Ⅲ）的引物，dig-11-dUTP标记物，应用直接原位PCR技术检测Ⅲ-Ⅳ级恶性淋巴瘤的间期淋巴细胞，结果：在初诊的15例恶性淋巴瘤患中，12例检测到IgH基因重排；4例临床表现呈现淋巴瘤性白血病患，治疗后骨髓完全缓解，2例间期细胞原位PCR仍显示有IgH基因重排，6个月复发，结论：间期细胞原位PCR技术能敏感、准确地检测Ⅲ级以上的恶性淋巴瘤，并帮助预测复发，为一有效的基因诊断方法。     

食管癌及癌旁组织端粒酶活性的原位检测

目的 :研究端粒酶活性在食管癌、癌旁组织、正常粘膜中的定位表达情况。方法 :应用原位杂交技术 ,检测端粒酶的mRNA。结果 :食管癌组织中端粒酶阳性表达率为 (2 8/ 30 ) ,明显高于癌旁组织 (4/ 30 )和正常粘膜(0 / 30 )。结论 :原位杂交检测是一种特异、灵敏、简单、准确的端粒酶检测方法 ,端粒酶活性的原位表达是食管癌的一项有用的诊断指标。     

压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞中bcl-2、bax及p53mRNA表达的影响

目的通过检测不同压力下纯化培养的大鼠视网膜神经节细胞(Retinal ganglioncells,RGCs)中bcl-2,bax,p53mRNA表达情况,了解压力对视网膜神经节细胞凋亡的影响.方法用SD系大鼠脑源性星型胶质细胞同化培养液双界面法[1]培养羊抗鼠Thy1.1单克隆抗体纯化的SD系大鼠RGCs;在纯化培养的RGCs上分别施加0,20mmHg,40mmHg,60mmHg和80mmHg气压,培养24h及48h后TUNEL法检测各组细胞的凋亡,原位杂交检测细胞中bcl-2,bax及p53mRNA的表达.结果纯化的RGCs培养12h及24h用羊抗鼠FITC-Thy-1.1单克隆抗体进行鉴定阳性,纯度为97%.传三代后星型胶质细胞用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体标记和鉴定阳性.培养24h组TUNEL法检测对照组极少数细胞凋亡,20mmHg组见较多细胞凋亡,随着压力的增高细胞凋亡数增多,凋亡指数增高;与对照组相比差异均有显著性.培养48h组压力≥20mmHg各组较相同压力培养24h组凋亡指数增高,差异有显著性(P＜0.05).压力≥40mmHg时bcl-2 mRNA表达逐渐减少,压力≥20mmHg时bax及p53 mRNA表达则逐渐增加;与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05).结论高于20mmHg压力时间超过24h可激活体外培养的视网膜神经节细胞的相关凋亡基因导致细胞的凋亡.     

PTTG基因表达在原发性肝细胞癌发生中的作用及其机制的初步研究

目的研究PTTG基因表达在原发性肝细胞癌(HCC)发生发展中的作用.方法应用原位杂交(DNA-RNA)技术与免疫组化SP法分别检测61例原发性肝细胞癌及癌旁肝组织中PTTG mRNA和PTTG蛋白及c-myc mRNA和c-myc蛋白的表达.结果在原发性肝细胞癌(HCC)中,PTTG mRNA和PTTG蛋白阳性细胞呈弥漫性、小巢状或散在分布,在胞浆内呈全浆型、膜下型表达.PTTG mRNA和PTTG蛋白在HCC中表达率分别为72.1%(44/61)和78.7%(48/61),在癌旁肝组织中分别为93.4%(57/61)和91.8%(56/61),在HCC中表达明显低于癌旁组织(P＜0.005,P＜0.05).相关性检验显示癌及癌旁PTTG基因表达与c-myc基因表达呈正相关(P＜0.005).结论PTTG基因过度表达参与了肝细胞癌发生发展,过度表达的PTTG可能通过激活癌基因c-myc来参与肝细胞恶性转化和肝细胞癌的发生发展过程.     

针刺胃脘下俞和足三里穴对糖尿病家兔血糖及血浆胰高血糖素的影响

为中药白鹤粉治疗慢性肾小球肾炎提供实验依据。方法：采用Ｂｏｒｄｅｒ的方法,用阳离子化牛血清白蛋白制作家兔原位免疫复合物肾炎模型,随机分成治疗组和对照组,治疗组给予中药白鹤粉治疗５周。结果：治疗组尿蛋白量明显减少,血肌酐水平明显降低;免疫荧光查发现对照组肾小球内ＩｇＧ沉积明显,光镜和电镜下示肾组织病理改变明显,治疗组病变程度较轻。结论：中药白鹤粉治疗家兔原位免疫复合物肾小球肾炎模型有效,可能成为治疗     

37例膀胱肿瘤患者肿瘤组织学与细胞遗传异常关联的FISH研究

【目的】通过荧光原位杂交技术分析膀胱肿瘤染色体的改变及其与膀胱分级、分期间的联系。【方法】对37例膀胱肿瘤进行分级、分期,并使用7、8、9、17号染色体及9p21、9q34特异探针进行荧光原位杂交分析。【结果】在1-2级肿瘤中,35.3%的患者以9号染色体上的遗传物质丢失为特征表现,17.6%的患者出现异倍体,而47.1%的患者检测不到异常表现。在3级和pT1-T4期肿瘤中,多倍体的频率出现较多。9p21、9q34、9号染色体的丢失与肿瘤分期分级无显著性联系。在1-2级肿瘤与3级肿瘤之间,pTa与pT1-T4肿瘤之间,7.8.9,17号染色体多倍体频率出现有显著性差异。【结论】9号染色体遗传物质的丢失与肿瘤分期、分级无关,但其是低级别肿瘤仅有的异常表现。pT1期肿瘤在遗传上更类似于浸润性肿瘤。多倍体的出现与肿瘤的高分级、高分期相关。     

VEGFmRNA和bFGF mRNA在原发性肝癌中的表达及意义

目的 :探讨血管内皮细胞生长因子 (VEGFmRNA)和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGFmRNA)在原发性肝癌中的表达及其意义。方法 :应用原位杂交技术检测 38例原发性肝癌VEGFmRNA和bFGFmRNA的表达情况。结果 :VEGFmRNA和bFGFmRNA阳性率与原发性肝癌门静脉和 /或胆管癌栓形成有关 ,伴癌栓病例VEGFmRNA和bFGFmRNA阳性率分别为 84 .6 %和 88.5 % ,不伴癌栓病例阳性率分别为 33.3%和2 5 .0 % ,两者比较均有显著差异 (P <0 .0 5 )。结论 :VEGFmRNA和bFGFmRNA可作为原发性肝癌的预后指标 ,可望为抑制原发性肝癌血管生成治疗提供实验依据和新线索