人丙氨酸氨基转移酶基因(ALT1)的克隆、表达、纯化及酶活性的鉴定

目的克隆、表达、纯化重组人丙氨酸氨基转移酶(ALT1),并测定该酶活性,为建立特异性的ALT分型检测方法奠定基础。方法通过RT-PCR从肝癌细胞中扩增丙氨酸氨基转移酶(ALT1)基因,并将其克隆至pET-28 a表达载体中。重组表达质粒pET28 a-ALT1,转化大肠杆菌BL21,经1.0mmol.L-1IPTG诱导,表达可溶性重组融合蛋白,通过硫酸铵沉淀、镍离子柱亲和色谱及QHP柱色谱3步纯化,并检测融合蛋白活性。结果经过表达条件的优化增加了可溶性蛋白的表达,纯化后目的蛋白纯度达到85%,经测定重组蛋白具有很高的丙氨酸氨基转移酶活性(200 U.mg-1)。结论通过基因克隆及大肠杆菌表达,能得到活性较高的丙氨酸氨基转移酶蛋白。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础     

内皮抑素融合蛋白的发酵与纯化

目的对内皮抑素融合蛋白的发酵和纯化工艺进行研究。方法利用 5L发酵罐 ,设定了溶氧、搅拌速度、补液量、补液时机和补液速度等发酵条件 ;用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤、离子交换色谱等方法纯化目的蛋白质。结果工程菌目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的 2 0 % ;纯化后纯度达 95 %以上。结论研讨了大肠杆菌高效表达内皮抑素融合蛋白发酵及纯化工艺 ,为实际应用奠定了基础。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。     

抗HBsAg单链抗体特异性单克隆抗体的制备及应用

目的获得抗HBsAg单链抗体(HBScFv)的单克隆抗体,并初步研究其在抗HBsAg类小分子抗体及其融合蛋白质的纯化、活性鉴定方面的应用。方法利用杂交瘤技术,以大肠杆菌表达的重组抗HBScFv为抗原,免疫Balb/c小鼠,再将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。通过ELISA法、Western-blot鉴定特异性单克隆抗体,通过免疫双扩散法鉴定单抗亚型,并将筛选到的高效价单抗用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及ELISA鉴定。结果建立了9株能够稳定分泌抗HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株,其细胞上清效价为1∶160~1∶12 800,腹水效价为1∶50 000~1∶400 000;单克隆抗体的亚类分析结果显示有6株为IgG1,其余3株为IgG2a。初步应用结果表明制备的单克隆抗体14F7可用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及活性鉴定。结论成功建立了能够稳定分泌HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株。     

胸腺肽β4分离与纯化工艺的研究

目的:以小牛胸腺为原料,研究其中的活性多肽胸腺肽β4的分离和纯化工艺.方法:采用硫酸铵沉淀法制得胸腺素5粗提品,然后利用阴阳离子交换色谱纯化得到胸腺肽β4产品,并采用SDS-PAGE和HPLC法进行分析鉴定.结果:分离纯化得到了纯度为90.1%的产品.结论:本实验采用低压离子交换色谱分离得到了纯度为90.1%的产品,可用于进一步的工业化研究.     

中华真地鳖抗肿瘤蛋白纯化、鉴定及活性研究

目的分离纯化中华真地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker)中抗肿瘤活性成分并研究其活性。方法采用硫酸铵沉淀、超滤、CM-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF及Q-Sepharose HP离子交换、Butyl Sepharose HP疏水色谱以及Superdex 75凝胶过滤色谱等技术分离纯化抗肿瘤组分;SDS-PAGE及MALDI-TOF质谱进行鉴定;采用MTT法考察其抗肿瘤活性。结果分离纯化得到一分子质量约为72 kD的抗肿瘤蛋白(EPS72)。该蛋白对肝癌Bel-7402细胞、肺癌A549细胞等多种人癌细胞株表现出较强的增殖抑制作用,并呈浓度依赖性。结论纯化的蛋白具有潜在的抗肿瘤作用。     

心肌肌钙蛋白Ⅰ的融合表达和分离纯化

目的研究人心肌肌钙蛋白(cTnⅠ)在大肠杆菌中稳定高效的融合表达和分离纯化,以满足临床诊断的需要。方法人cTnⅠDNA序列由pdf 5-cTnⅠ质粒经PCR亚克隆而得,然后将其插入pET32a(+)载体,构建成pET32a(+)-cTnⅠ表达质粒,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌,在IPTG诱导下进行表达。结果硫氧还蛋白(TrxA)-cTnⅠ融合蛋白得到高效表达,并经金属螯合亲和色谱一步纯化得到目的蛋白质。试剂盒检测结果表明该重组蛋白质具有cTnⅠ免疫原活性。结论构建了pET32a(+)-cTnⅠ重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达,为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础。     

转基因羊奶中促红细胞生成素的提纯

目的从pBLG-hEPO转基因母山羊的羊乳中提纯促红细胞生成素(EPO)。方法经过酸沉淀预处理、SPSepharose FF阳离子交换树脂、butyl FF 16/10疏水交换树脂、Superdex 75 26/60分子筛色谱4步分离,从转基因羊乳中纯化出EPO。结果经SDS-PAGE检测,得到的EPO相对分子质量约为32 000,全程回收率为10.1%,ELISA和蛋白质印迹实验证明其具有天然EPO抗原性。结论此工艺可用于快速分离转基因羊乳中EPO。     

原癌基因Pokemon的克隆原核表达及纯化

目的克隆小鼠Pokemon(POKeryhroidmyeloidontogenicfactor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化。方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Westernblotting检测其特异性。结果限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Westernblotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性。结论采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础。     

重组汉坦病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达重组汉滩型病毒(Hantaan virus,HTNV)核蛋白(recombinant HTNV nuclearprotein,rHTNNP)和重组汉城型病毒(Seoul virus,SEOV)核蛋白(recombinant SEOV nuclear protein,rSEONP),并进行纯化.方法 从HTNV PS-6株和SEOV L-99株灭活病毒液中提取总RNA,依据病毒S片段多变区基因序列两端保守序列设计引物,用逆转录PCR法扩增此S基因片段,构建原核表达质粒pET-Trx-his-HTNNP和pET-Trx-his-SEONP,并在大肠埃希菌中诱导表达.表达产物经凝胶电泳初步鉴定和镍柱亲和层析纯化后,用双向免疫扩散试验检测其抗原特异性.结果 重组表达质粒经菌落PCR分析和测序证明构建正确.表达的rHTNNP和rSEONP相对分子质量约为26 000,表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％,主要以可溶性形式表达,且纯度可达约70％.双向免疫扩散试验证实,这2种重组蛋白具有较好的抗原性.结论 成功构建了表达rHTNNP和rSEONP的原核表达质粒,并获得了较高纯度的rHTNNP和rSEONP,为汉坦病毒型别鉴定试剂盒的开发奠定了基础.     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

Ⅰ型单纯疱疹病毒gG基因片段的高效表达、纯化

目的 获得具有优势抗原表位的Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G的表达抗原并纯化鉴定。方法 用PCR技术扩增经分析筛选出的HSVl-gG蛋白中优势抗原决定簇较集中的基因片段。将该段基因克隆至PGEX-4T-2表达载体内，转化大肠杆菌TGl，对重组体进行诱导表达，表达产物主要以可溶性形式存在，使用硫酸铵沉淀后采用Sephamse阴离子交换层析进行纯化。纯化的蛋白抗原包被酶联板分别对抗HSVl-IgM阳性血清和正常人血清标本进行检测。结果 在原核表达载体中成功地克隆了HSVl-gG，电泳分析表明在相对分子质量43．5kD处有HSVl-gG／GST融合蛋白的高效表达，并纯化获得了纯度达90％的表达蛋白。ELISA分析初步证实表达产物具有较好的抗原性和特异性。结论 成功地克隆、表达了高纯度的具有良好免疫原性的HSVl-gG蛋白，为研制高质量的HSV-1免疫学诊断试剂提供了有利条件。     

人肿瘤抑素(tumstatin)的基因克隆及其原核表达

目的克隆人肿瘤抑素(tumstatin)基因,并进行其在大肠杆菌表达的研究。方法用RT-PCR技术从人肾癌旁组织中扩增出肿瘤抑素的cDNA,构建原核表达载体pQE-tum,IPTG诱导重组蛋白质的表达,并利用Ni-NTAHis-Bind树脂纯化该重组蛋白质。结果经PCR扩增成功获得742 bp的人肿瘤抑素基因,测序正确。在大肠杆菌中目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的10%,SDS-PAGE及Western blot分析显示,其相对分子质量为28 000,纯化后的6×His-tumstatin纯度可达92%。结论tumstatin基因克隆、表达及纯化的成功,为其今后的肿瘤抗血管生成治疗研究奠定了基础。     

胸腺素α1—硫氧还蛋白融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究

胸腺素α1（thymosin alpha1,Tα1)作为一种免疫增强剂,临床用途广泛。为了大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子用人工方法合成Tα1基因,克隆于pUC19的EcoRi和PstI位点,经测序证明序列正确后,串联为4串体（Tα1（4））,经再次确认后克隆入pThioHisA的EcoRI t PstI位点,转化大肠杆菌TOP10菌种,酶切鉴定证明正确后,经1mmol/L IPTG诱导4h,获得硫氧还蛋白与Tα1（4）的融合表达,并经Western blot分析证实,用离子交换柱层可纯化出硫氧还蛋白与Tα1（4）融合蛋白,利用3H－TdR掺入法证实,该融合蛋白具有刺激小鼠脾淋巴细胞的活性。α     

应用中空纤维柱和凝胶色谱纯化鸡胚流感病毒

目的研究鸡胚尿囊腔培养流感病毒的纯化方法。方法采用中空纤维柱超滤、病毒裂解和两次Seph-arose 4FF凝胶色谱纯化流感病毒。结果通过中空纤维柱超滤可去除76.53%～93.66%卵清蛋白,再通过两次Sepharose 4FF凝胶色谱纯化,流感病毒样品总蛋白含量与血凝素含量比值小于4.5,卵清蛋白含量小于500 ng/mL,SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹的电泳条带和血凝素特异性条带与英国国家生物制品检定所(NIBSC)的标准品一致。结论该工艺纯化的流感病毒的纯度符合《中国药典》2010版的要求。     

野生型金黄色葡萄球菌肠毒素C2在E.coli中的表达和纯化研究

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因在E.coli重组表达,纯化重组SEC2(rSEC2)并进行生物学活性分析。方法PCR获得正确编码SEC2的基因片断,构建表达质粒pET-28a-sec2在E.coliBL21中表达。利用离子交换和分子筛色谱纯化rSEC2,四甲基偶氮唑盐(MTT)法对rSEC2和天然SEC2(nSEC2)生物学活性进行分析和比较。结果可溶性rSEC2占菌体总蛋白质的40%,两步纯化后蛋白质纯度约达95%,rSEC2和nSEC2均具有显著的超抗原活性。结论成功获得与nSEC2有着类似活性的高纯度rSEC2,为进一步研究该蛋白质的抗肿瘤机理奠定物质基础。     

重组人血管内皮生长因子(hVEGF121)工程菌的发酵及表达产物的分离纯化

该研究优化了重组人血管内皮生长因子hVEGF121工程菌的发酵条件，考察乳糖诱导浓度和时间对目的蛋白表达量的影响。经乳糖诱导，目的蛋白以包涵体形式存在。通过菌体裂解、包涵体洗涤、裂解等初步纯化后，再经过DEAECellulose离子交换柱纯化和复性，经SDS-PAGE分析显示得到电泳纯的hVEGF121。