DNA甲基化检测方法

DNA甲基化是真核细胞基因组重要修饰方式之一 ,参与基因的表达调控。目前 ,DNA甲基化检测的方法主要有 :酶切、限制性酶切 - PCR(restriction enzym e PCR)、甲基化特异性 PCR(methylation- specific PCR,MS PCR)、Southern印迹亚硫酸盐测序 (bisulfite DNA sequencing)、变性高效液相色谱 (denature high- perform ance liquid chrom atography,DHPL C)、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸 (m ethylation- sensitive single nucleotide prim er extensio,MS- SNu PE)、PCR荧光变性曲线分析(PCR and fluorescence m elting curve analysis)、亚硫酸盐 PCR- SSCP(bisulfite- PCR- SSCP)、COBRA(combined bisulfite re-striction analysis)和 Methy L ight     

广州地区小儿无症状乙肝病毒携带者的基因型研究

目的：扩增HBV DNA S基因，建立HBV DNA的分型方法，研究广州地区小儿无症状乙肝病毒携带者（AsC）的基因型。方法：利用PCR－RFLP基因分型方法，扩增HBV DNA S基因，以限制性内切酶AvaⅡ、MboI酶切分型。结果：60份AsC血清样本，B型37份（62．7％），C型20份（33．3％），B、C混合型2份（3．3％），未分型1份（1．7％），经序列分析证明为C型，C型共35％。结论：PCR－RELP分型方法经济实用，分型率达98．3％，广州地区小儿乙肝病毒的基因型以B型和C型为主，其中携带者中B型占优势。     

脆性X综合征FMR1基因CpG岛的甲基化程度分析

目的 建立用甲基化敏感性限制性内切酶定量聚合酶链反应(methylation-sensitiverestriction enzymes-based quantitative PCR,MSRE-qPCR)分析FMR1基因CpG岛甲基化程度的方法,并探讨其对脆性X综合征的诊断价值.方法 以常规PCR初筛存在FMR1基因5′(CGG)n异常扩增的30例智力低下男童和20名母亲作为研究对象,用Eag Ⅰ酶消化DNA样品,针对FMR1基因CpG岛设计引物,定量PCR扩增Eag Ⅰ酶切前、后DNA,用2-△△Ct法计算CpG岛甲基化程度;以Southern印迹杂交确诊的3例患儿和正常体检男、女各30例DNA样品为质控样本,从而建立优化的MSRE-qPCR方法.结果 确立了正常甲基化、部分异常甲基化、全甲基化的区间值,并明确30例常规PCR初筛异常患儿中3例存在部分甲基化,27例为全甲基化,其中3例经Southern印迹杂交验证;13例母亲处于正常甲基化,7例存在异常甲基化.结论 MSRE-qPCR可以对FMR1基因CpG岛的甲基化程度进行快速可靠分析,为脆性X综合征的分子诊断提供新的策略.     

PCR-RFLP检测拉米夫定抗HBV感染中聚合酶YMDD变异

目的 建立用PCR－限制性片段长度多态性技术（PCR－RFLP），分析拉米夫定抗HBV感染中聚合酶YMDD变异方法。方法 在拉米夫定抗HBV治疗过程中HBV DNA由阴性再次转为阳性患者及HBV DNA始终保持阳性的血清达1年或1年以上，用3对引物扩增HBV P基因的C区，扩增产物分别用3个限制性内切酶分析，酶切结果用8.4%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。检测HBV YMDD变异，同时血清用全自动测序仪检测YMDD变异。分析比较两者结果。结果 35例病人，包括33例HBV DNA再次阳性患者，2例用药1年HBV DNA未转阴。14例病人出现YMDD变异。PCR－RFLP结果为6例YVDD变异、4例YIDD、1例YI／MDD、21例YMDD与测序一致。另3例PCR－RFLP结果为YI／VDD，即混合变异，测序报告为2例YIDD、1例YVDD，分析相应的测序图，存在混合变异。并把YIDD与YVDD变异的血清混合，行PCR－RFLP，结果与YI／VDD一致。结论 用PCR－RFLP能快速、简便、灵敏地检测YMDD变异。     

人乳头瘤病毒11型DNA中CpG基序甲基化状态分析及生物活性的研究

目的　对人乳头瘤病毒 11型全核苷酸序列的CpG基序 (CpGmotifs)进行分析 ,为阐明尖锐湿疣的发病机制和提高DNA疫苗的效能奠定理论基础。方法　对从pBR32 2 HPV11重组质粒上酶切下来的HPV11全长DNA进行计算机分析 ,包括分类、计数和定位 ;并用限制性内切酶PCR法分析HPV11DNA中CpG基序的甲基化状态 ,即分别用甲基化敏感的限制性内切酶AccⅡ、HaeⅡ和HpaⅡ对HPV11DNA进行酶切消化 ,再以HpaⅡ切割位点侧翼序列为引物 ,以HpaⅡ酶切产物为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增HPV11DNA片断 ,并用HPV11DNA刺激表达有pCIneo TLR9的HEK2 93细胞 ,ELISA法检测TNF al pha、IFN alpha和IL 12的分泌。结果　CpG的“C”的侧翼为两个嘌呤 ,“G”的侧翼为两个嘧啶 ,在HPV11中共 14个。HPV11全基因组被AccⅡ切成 2个片断、被HaeⅡ切成 3个片断、被HpaⅡ切成 5个片断 ,而且以HpaⅡ酶切产物为模板进行PCR扩增 ,未能得到相应的片断。HPV 11DNA刺激有人TLR9表达的HEK2 93细胞后能检测到TNF alpha、IFN alpha和IL 12的分泌。结论　乳头瘤病毒 11型DNA中含有GACGTT等非甲基化的CpG基序 ,而且具有免疫原性     

急性白血病p53基因P1启动子区域DNA甲基化研究

目的：通过检测急性白血病（AL）中p53基因P1启动子异常甲基化，探讨p53基因异常甲基化在急性白血病中的意义。方法:分别使用限制性内切酶MspⅠ、HpaⅡ、EcoRⅡ、BstNⅠ酶切提取基因组DNA，然后分别使用酶切后产物及基因组DNA为模板进行PCR扩增。产物电泳后在凝胶成像分析系统内观测电泳条带及摄像；部分标本的电泳条带经凝胶回收纯化后进行测序。结果:急性白血病患者p53基因第一启动子甲基化阳性率为38.7％，而急性淋巴细胞白血病（ALL）与急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者分别为45.5％、35.0％。正常对照标本中未检测到p53基因的异常甲基化。p53基因甲基化情况在急性白血病病人与正常人之间经过统计学检验，P<0.05；但急性淋巴细胞白血病与急性非淋巴细胞白血病患者之间无显著差异，P>0.05。分析急性白血病患者p53基因甲基化与患者临床资料之间的关系，其中，p53基因异常甲基化与肝脾淋巴结是否肿大之间的关系经统计学分析P<0.05。结论:①部分急性白血病患者存在p53基因第一启动子异常甲基化，正常对照中未检测到p53基因的甲基化；②p53基因第一启动子在急性淋巴细胞白血病与急性非淋巴细胞白血病均可发生异常甲基化，两者之间发生甲基化的概率无统计学差异；③p53基因异常甲基化与肝脾淋巴结肿大有显著差异，但p53基因异常甲基化与急性白血病治疗效果及预后的关系尚不能确定，须进一步研究确定。     

三种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变的酶切分析方法及其应用

目的：建立三种乙型肝炎（乙肝）病毒拉米夫定耐药突变的酶切分析方法，了解这三种耐药突变在拉米夫定治疗患者中的发生情况。方法：设计3对HBV P基因引物进行聚合酶链反应（PCR）扩增，应用Nde I和Nla Ⅲ两种限制性内切酶对PCR产物进行酶切，酶切产物用电泳加以分析。应用此方法检测70例拉米夫定治疗的慢性乙肝患者中3种拉米夫定耐药突变的发生情况。结果：Nde I和NlaⅢ两种限制性内切酶对PCR产物进行酶切可有效区分HBV野株和YMDD（酪氨酸－蛋氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸）变异株，并确定是YI（异亮氨酸）DD或YV（缬氨酸）DD变异。用Nla Ⅲ内切酶对PCR扩增产物酶切可有效区分HBV野株和L526M（第526位氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸）变异株。利用此方法发现11例患者在服用拉米夫定过程中出现耐药突变，其中YIDD变异6种，YVDD变异5例，后者有1例伴有L526M点突变。结论：本方法只需应用常规PCR和酶切技术，既可有效筛检出YMDD变异株标本，还可以确定属于YIDD还是YVDD变异，或是否伴有L526M点突变等，均可作为临床监测拉米夫定耐药性的参考。     

孕妇血清CMV—DNA与CMV—IgM的检测与分析

应用聚合酶链式反应（PCR）及酶联免疫吸附实验（ELISA）两种方法．同时对100例门诊优生咨询孕妇进行了血清CMV－DNA及CMV－IgM的检测，结果PCR法的阳性检出率为12％，而ELISA法的阳性检出率为6％，PCR法敏感性较ELISA法高，两者差异显著。     

母胎间差异甲基化片段在无创性产前诊断中的应用价值

目的探讨HLCS、RASSF1A片段在母胎间甲基化状态的差异并评估其在无创性产前诊断中的应用价值。方法收集388例孕妇血浆,其中126例同时收集外周血细胞及胎盘（或绒毛）组织,采用甲基化敏感性限制性酶切联合荧光定量PCR（MSRE＋PCR）技术,检测母胎间HLCS基因、RASSF1A基因甲基化状态的差异,分析其影响因素,并根据孕妇血浆中胎源性HLCS/RASSF1A浓度比值判断胎儿21号染色体数目。结果研究证实HLCS及RASSF1A在胎盘或绒毛组织中均呈高甲基化状态,而在母体外周血细胞呈现低甲基化状态,且这种甲基化差异不受孕妇年龄、孕周、胎儿性别的影响。采用MSRE＋PCR技术对孕妇血浆中HLCS、RASSF1A片段的检出率分别为97.4%和96.9%。计算274例正常妊娠孕妇血浆中胎源性HLCS/RASSF1A比值,确定其95%的参考值范围为0.34～2.02,以此为标准判断102例胎儿21号染色体数目,其中98例二倍体妊娠的准确率为95.9%（94/98）,4例21三体综合征妊娠均获正确诊断。结论高甲基化HLCS、RASSF1A基因可作为孕妇血浆中胎源DNA的标志物,且有望根据孕妇血浆中甲基化HLCS/RASSF1A浓度比值进行21三体综合征的无创性产前诊断。     

慢加急性肝衰竭患者外周血肿瘤坏死因子-α基因启动子甲基化状态的研究

目的探讨肿瘤坏死因子-仅及表观遗传调控在慢加急性肝衰竭发病机制中的可能作用。方法ELISA法检测外周血TNF-α的表达,并与患者的肝功能进行相关性分析。同时提取外周血单个核细胞DNA,重亚硫酸盐处理后,用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链反应（PCR）。根据修饰后DNA序列的不同,运用在线MethPrimer软件设计引物,甲基化特异性聚合酶链反应（Methylationspecificpolymerasechainreaction,MSP）检测标本中TNF-α扩增产物,分析TNF-α启动子甲基化与血清TNF-α表达的相关性,并分析甲基化与病情严重程度的相关性。采用SPSS16．0软件进行统计分析。结果慢加急性肝衰竭患者组外周血TNF-α蛋白水平（44．9260±26．48523）均高于慢性乙型病毒性肝炎患者组（18．92505±9．04461）和健康对照组（11．9172±5．04612）,且各组间比较差异均具有统计学意义（P〈0．05）。慢加急性肝衰竭患者组外周血清TNF—a水平与血清TBIL及终末期肝脏病模型（MELD）评分之间呈明显的正相关,与PTA呈明显的负相关。慢加急性肝衰竭组、慢性乙型病毒性肝炎患者组、健康对照组TNF-α启动子甲基化状态的差别有统计学意义。慢加急性肝衰竭患者与慢性乙型病毒性肝炎患者及健康对照甲基化组血清TNF-α水平均明显低于非甲基化组（P〈0．05）。结论TNF-α与肝炎活动及肝细胞损害有密切关系,DNA甲基化在慢加急肝衰竭患者中参与调控细胞因子的表达中。     

启动子区5′CpG岛去甲基化对人结肠癌细胞生物学表型的影响

目的：探讨DNA启动子区5′CpG岛甲基化状态与人结肠癌RKO细胞增殖凋亡等生物学特征的关系。方法： 应用特异性DNA甲基转移酶（DNMTs）抑制剂-5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR）处理肠癌RKO细胞72 h，甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）及DNA测序法分析p16/CDKN2基因CpG岛甲基化状态；MTT、FCM、荧光染色及透射电镜检测启动子区去甲基化后细胞生长、形态和细胞周期凋亡的影响。 结果： DNMTs抑制剂能较好地逆转启动子区胞嘧啶甲基化状态；CpG岛去甲基化后能明显地抑制肠癌细胞的生长，增加细胞群体倍增时间（P<0.01），诱导肠癌细胞凋亡，影响肠癌细胞周期分布，并具有良好的量效依赖关系。 结论： 通过逆转CpG岛高甲基化能有效地抑制肠癌细胞增殖，为临床治疗大肠癌提供新的作用靶点。     

联合应用PCR—酶切法和STR检测腓骨肌萎缩症IA型17p11.2—p12 的基因重复

目的 研究临床简化诊断腓骨肌萎缩症1A（CMT1A）型17p11.2-p12基因重复的有效方法。方法 利用聚合酶链反应（PCR）加双酶切方法,检测CMT1患者组及对照组的特异性连接片段,同时应用短串联重复序列（STR）作为遗传标记检测相同的患者,结果 22例CMT1患者中,特异性连接片段检出率为54．5％（12／22）,STR分析共检出基因重复14例,占63．6％,其它均未检测到特异性连接片段,联合应用PCR－双酶切和STR分析,基因重复出率为77．3％（17／22）,结论 PCR－双酶切法检测CMT1A基因重复具有快速,简洁,特异性好等优点,适于临床推广应用,联合应用PCR－双酶切和STR分析,可提高CMT1A患者基因重复检出率。     

BRCA1基因启动子复杂甲基化模式

应用体外甲基化酶M－SssI处理和甲基化敏感单链构象分析法（Methylation-Sensitive single-strand ccnformation analysis,MS-SSCA)及DNA测序技术，研究正常人乳腺癌易感基因1（breast cancer1,BRCA1)启动子区5’端CpG岛13个CG二核苷酸位点的甲基化模式。对甲基化酶处理时间不同得到的8种有差异MS0SSCA迁移带型进行测序，证实为8种不同的甲基化模式，结果将为研究临床乳腺癌标本BRCA1基因甲基化模式提供参考。     

AIRE基因在21-三体综合征无创性产前诊断中应用的可行性研究

目的利用AIRE基因母、胎间差异甲基化,探讨其在无创性产前诊断21-三体综合征患儿中的应用价值。方法随机选择健康的孕妇、非妊娠妇女、21-三体妊娠的孕妇血浆、血细胞、绒毛和胎盘组织,利用甲基化敏感限制性内切酶法,酶切后进行常规PCR检测目的基因AIRE的甲基化模式,分析其影响因素。结果AIRE基因在非妊娠妇女的血细胞和血浆中及妊娠妇女的血细胞中均未甲基化,而在孕妇血浆中高甲基化,且与孕妇绒毛组织和胎盘组织AIRE基因甲基化状态相同,两组间甲基化率差异显著有统计学意义（P〈0．0001）。且母胎间差异甲基化不受孕妇年龄、孕周和胎儿性别的影响。孕早、中、晚期孕妇血浆中甲基化检出率分别为87％、97％、97％稍有不同,但无统计学意义。21-三体妊娠妇女血浆中游离胎儿DNA浓度约为正常孕妇血浆中游离胎儿DNA的2倍。结论在母体和胎儿DNA中AIRE基因甲基化有显著差异,可作为孕妇血浆中胎儿游离DNA表观遗传学标记,有望进行21-三体综合征的无创性产前诊断。     

parkin基因的一个新的点突变

目的：研究parkin基因外显子2-10点突变与散发性早发帕金森病发病的关系。方法：应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR）、琼脂糖电泳、单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、DNA测序及限制性核酸内切酶酶切方法，检测了60例散发性早发帕金森病患者以及120名正常人外周血白细胞DNA的parkin基因外显子2-10点突变。结果：发现1例患者的parkin基因外显子2存在纯合突变（G237→C），限制性内切酶酶切证实，其它外显子未见突变，120名正常对照也未见突变。结论：parkin基因外显子存在点突变，可能与部分散发性早发帕金森病发病有关。     

Alu序列甲基化水平与两种乳腺癌细胞系转移能力高度相关

目的 探讨Alu序列甲基化与乳腺癌转移潜能的关系.方法 用亚硫酸氢盐修饰联合限制性内切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)、亚硫酸氢盐修饰结合直接测序法(bisulfite sequencing,BSP)检测两株转移能力不同的乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-435S中Alu甲基化状态,每个样品挑取10个克隆测序.结果 MCF7和MDA-MB-435S中Alu甲基化水平均明显低于报道的正常人体细胞Alu甲基化水平,但MCF7中Alu的甲基化水平明显高于MDA-MB-435S.同时,Alu甲基化位点在基因组中分布不均匀.结论 乳腺癌的转移潜能可能与Alu序列的去甲基化以及去甲基化位点的分布相关,值得进一步探讨.     

限制酶切指纹-单链构象多态性--一种有效的大片段中突变的检测方法

目的；建立一种简便、价廉、有效地在大片段中检测突变的限制酶切指纹-单链构象多态性（restriction endonuclease fingerprinting-single strand conformation polymorphis，REF-SSCP）方法。方法：以耳聋患者基因组DNA为模板，扩增Cx26基因片段，通过对扩增产物进行单链构象多态性、限制酶切指纹-单链构象多态性和DNA测序，比较REF-SSCP技术对大片段中突变的检出效率。结果：长度为724bp的扩增产物SSCP结果未显示差异，REF-SSCP显示3种不同带型，经测序发现该基因中的79G→A突变，突变情况与REF-SSCP带型完全吻合，检出率为100%。结论：所建立的REF-SSCP技术适用于大样本量地检测大片段DNA中的突变。     

掌纤维瘤病的克隆性分析

目的通过人雄激素受体（HUMARA）基因位点克隆性分析技术确定掌纤维瘤病是否为肿瘤性增生。方法收集12例女性掌纤维瘤病患者的组织蜡块,连续切片、HE染色后,采用激光显微切割技术获取梭形细胞丰富的区域,1例女性直肠腺癌组织蜡块作为阳性对照。酚-氯仿抽提DNA后,经甲基化敏感的HpaⅡ限制性内切酶消化,聚合酶链反应（PCR）扩增HUMARA基因,PCR产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,凝胶成像系统分析。结果作为阳性对照的直肠腺癌被验证是单克隆起源的,说明了本实验的克隆性分析方法的有效性。12例掌纤维瘤病石蜡组织标本中,3例标本未扩增成功;1例标本的HUMARA基因为纯合子,不适于克隆性分析;其余8例标本在HpaⅡ酶切前后均显示2条条带,经凝胶成像系统软件分析2条条带的亮度相近,说明掌纤维瘤病是多克隆性增生。结论掌纤维瘤病是多克隆性增生,属于非肿瘤性增生。