虫草提取物对高糖诱导的脐静脉内皮细胞损伤模型的保护作用

目的研究虫草提取物对人脐静脉内皮细胞损伤模型的影响,探讨其保护内皮功能的机制。方法原代培养人脐静脉内皮细胞,高糖(40mmol/L)孵育,建立细胞损伤模型。实验分组:空白组、高糖组、冬虫夏草组、蛹虫草组。MTT法检测细胞增殖;SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法检测SA-β-gal染色阳性率;流式细胞术测定细胞周期及细胞内活性氧;实时荧光定量PCR检测衰老相关的p16、p21、沉默信息调节因子1(SIRT1)、Bcl-2mRNA表达水平。结果与空白组比较,高糖组细胞增殖明显下降,细胞内活性氧增加(P<0.05)。与高糖组比较,蛹虫草组及冬虫夏草组细胞增殖增加,S期细胞明显增多,SIRT1mRNA水平显著升高,细胞内活性氧和p21mRNA水平均显著降低(P<0.05)。结论虫草提取物对损伤内皮具有保护作用,其机制可能与促进SIRT1mRNA表达,减轻细胞氧化应激损伤,抑制p21mRNA表达,促进内皮细胞生长增殖有关。     

阿司匹林抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用

目的 探讨阿司匹林是否具有抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用及其机制。方法 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分别于正常糖浓度培养液 （5.5 mmol/L）、高糖培养液和高糖（33 mmol/L）＋阿司匹林（0.01、0.1、1及3 mmol/L）培养液中培养48 h,观察细胞形态、采用β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞,PCR-ELISA检测端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期和细胞内活性氧水平。结果 高糖培养液作用HUVEC 48 h后,细胞呈现衰老状态,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数明显增加,端粒酶活性明显减低,细胞周期停滞于G0/G1期,S期显著减少,细胞内活性氧水平显著增加。0.01、0.1和1 mmol/L阿司匹林作用后细胞形态改善,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数显著减少,端粒酶活性增强,S期细胞显著增加,细胞内活性氧水平降低（P<0.05）。而3 mmol/L阿司匹林作用后与高糖组相比差异无显著性。结论 高糖环境下阿司匹林（0.01、0.1和1 mmol/L）具有抗内皮细胞衰老的作用,其作用机制可能与氧化应激有关。     

MicroRNA-181b 对衰老内皮细胞血管新生功能的影响

目的研究microRNA-181b（miR-181b）对衰老内皮细胞增殖、迁移和管腔形成等血管新生功能的影响。方法原代培养人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）,通过传代培养计算细胞群体倍增水平（Population doublings,PDL）,建立HUVECs衰老模型（PDL44）。在PDL44HUVECs中过表达或抑制miR-181b,分刖用MTS法、划痕实验及成管实验检测内皮细胞增殖、迁移和成管功能,结果过表达miR-181b可抑制PDL44内皮细胞的增殖功能18％（P〈O．001）,减少内皮细胞迁移率40％（P=O．032）;反之,给于miR-181b抑制刹可硅著改善PDL44内皮细胞的迁移和增殖：给了血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）刺激,术观察到miR-181b对PDL44内皮细胞成管功能的调控作用。结论抑制miR＋181b可提高衰老内皮细胞的增殖和迁移能力,提示它可作为一个新的靶点,调节内皮细胞的损伤修复和血管新生。     

动脉粥样硬化病变相关的内皮细胞衰老及抗衰老机制

内皮细胞衰老引起内皮功能障碍,与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关。许多因素可以造成内皮细胞衰老,主要是通过细胞复制性衰老和应激诱发的细胞早衰两种机制。该文主要就动脉粥样硬化病变处内皮细胞衰老的机制以及近期研究发现的抗衰老机制作一综述。     

转染血红素加氧酶1基因对高糖和高脂诱导内皮细胞损伤的影响

目的探讨血红素加氧酶1对高浓度软脂酸和葡萄糖诱导的内皮细胞损伤的影响.方法利用逆转录病毒介导的基因转染技术将血红素加氧酶1基因转染入人脐静脉内皮细胞(ECV304细胞).应用逆转录-聚合酶链反应检测转染细胞血红素加氧酶1mRNA表达水平.将未转染和转染血红素加氧酶1基因的内皮细胞分别培养于含不同浓度的葡萄糖和/或软脂酸的培养基中,培养48h后,检测细胞存活率、乳酸脱氢酶释放率和细胞脂质过氧化产物丙二醛的含量.结果血红素加氧酶1基因在转染内皮细胞的表达显著升高;未转染细胞在20mmol/L 葡萄糖和不同浓度软脂酸共同培养后存活率明显下降,乳酸脱氢酶释放率和丙二醛含量增高;而转染细胞存活率较相同处理因素的未转染细胞提高,乳酸脱氢酶释放率和丙二醛含量下降;应用血红素加氧酶1抑制剂锌原卟啉后,上述保护作用消失.结论血红素加氧酶1基因的表达上调可减轻高糖和高脂对内皮细胞的损伤,其机制与抑制细胞内氧化应激反应有关.     

C肽和胰岛素对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响

高糖可导致人脐静脉内皮细胞凋亡,不同浓度的C肽和胰岛素对高糖诱导的内皮细胞凋亡影响程度不同。合理应用C肽可能对糖尿病大血管病变的防治起到有益的作用。     

血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞衰老的形态学研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞衰老与细胞凋亡的关系。方法制备血管紧张素ⅡRPMI1640培养基培养人脐静脉内皮细胞,采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定内皮细胞存活率,β-半乳糖苷酶染色、细胞周期分析鉴定细胞衰老;通过Hoechst33258荧光染色观察细胞形态学的变化,透射电子显微镜观察衰老细胞的超微结构。结果血管紧张素Ⅱ诱导组存活的细胞数为对照组的81.9%±0.04%(P<0.01),约80%的细胞呈现β-半乳糖苷酶阳性染色,流式细胞仪检测细胞周期停滞于G0-G1,荧光显微镜可见明显的细胞凋亡(P<0.05),透射电子显微镜可见血管紧张素Ⅱ诱导组细胞核染色质浓缩和凝聚。结论血管紧张素Ⅱ可诱导体外培养的内皮细胞衰老,衰老的内皮细胞发生凋亡,提示细胞凋亡参与了血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞衰老的过程。     

阿司匹林抗高糖诱导的内皮细胞衰老过程中对DDAH-ADMA系统及Caveolin-1蛋白的影响

目的观察阿司匹对高糖诱导的内皮细胞衰老模型二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)-非对称性二甲基精氨酸(ADMA)系统和Caveolin-1蛋白表达的影响,探讨阿司匹林抗高糖诱导内皮细胞衰老的机制。方法人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分别培养于正常糖浓度培养液(5.5 mmol/L)、高糖培养液(33 mmol/L)、高糖+阿司匹林(0.01~1 mmol/L)培养液以及含L-NAME(300μmol/L)培养液,48 h后采用β-半乳糖苷酶(β-gal)染色鉴定衰老细胞,流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平,Western blot分析Caveolin-1蛋白表达,液质联用仪检测细胞上清液中ADMA的含量并计算DDAH的活性。结果高糖作用内皮细胞48 h后,细胞β-gal染色阳性细胞数明显增多,ROS、ADMA水平以及Caveolin-1蛋白表达升高,DDAH活性降低。0.01~1 mmol/L阿司匹林剂量依赖性地降低β-gal染色阳性细胞数、ROS和ADMA水平以及Caveolin-1蛋白表达,同时升高细胞DDAH活性(P均0.05)。L-NAME(NOS的抑制剂)能完全抑制阿司匹林的上述作用(P0.05)。结论高糖环境下阿司匹林(0.01~1mmol/L)能抑制Caveolin-1表达,改善DDAH-ADMA系统的活性而进一步发挥抗氧化损伤、抗细胞衰老的作用。     

血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞衰老及对细胞骨架的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)衰老及对细胞骨架的影响。方法体外培养HUVEC,采用CCK-8法检测细胞存活率,用AngⅡ干预,分为对照组、10mol/LAngⅡ诱导组(AngⅡ组)。主要观察衰老相关β-半乳糖苷酶活性和细胞的增殖能力。β-半乳糖苷酶活性采用免疫化学染色方法,流式细胞术检测细胞增殖能力;考马斯亮蓝染色显示内皮细胞骨架,利用Western blot印迹法分析波形蛋白表达的变化。结果与10~(-6)mol/L AngⅡ细胞存活率(77.15±6.83)%比较,10~(-5)mol/L AngⅡ存活率(55.61±7.92)%明显降低(P<0.01);AngⅡ组β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数目明显增加(P<0.001),流式细胞仪检测细胞周期停滞于G0/G1期[(80.11±7.92)%];AngⅡ组细胞骨架及波形蛋白较对照组明显降解。结论 AngⅡ可以诱导HUVEC衰老,其分子机制可能与细胞骨架蛋白裂解有关。     

阿司匹林抗高糖诱导内皮细胞衰老过程中对一氧化氮-一氧化氮合酶系统的影响

目的 探讨阿司匹林是否通过影响一氧化氮（NO）-一氧化氮合酶（NOS）系统发挥抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用. 方法 人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）分别于正常糖浓度培养液（5.5 mmol/L）、高糖培养液（33 mmol/L）、含阿司匹林（0.01～1mmol/L）培养液及含L-NAME（300 μmol/L）培养液中培养48 h.采用β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色鉴定衰老细胞,流式细胞仪检测细胞内活性氧簇（ROS）水平.Griess法检测细胞总NO水平,荧光酶标仪检测细胞内NOS活性.Westernblot分析eNOS蛋白及eNOS人丝氨酸（Ser-1177）蛋白表达. 结果 高糖作用内皮细胞48 h后与正常糖浓度相比,SA-β-gal阳性细胞数明显增多.阿司匹林剂量依赖性地减少SA-β-gal阳性细胞数,降低ROS的水平,升高NO的水平、总NOS活性和eNOS Ser-1177蛋白表达（P＜0.05）.L-NAME（NOS的抑制剂）能完全抑制高糖环境下阿司匹林的上述作用（P＜0.05）.各组间eNOS总蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）. 结论 高糖环境下阿司匹林通过提高细胞NOS活性而升高NO水平,降低氧化应激反应而发挥抗衰老作用.     

艾塞那肽抑制高糖诱导内皮细胞凋亡的作用机制

在正常糖浓度(5.5 mmol/L)和高糖(33 mmol/L)培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分别加入不同浓度的艾塞那肽并干预不同时间后,噻唑蓝(MTF)法检测细胞活力,应用流式细胞仪检测细胞早期凋亡率,Western印迹法检测蛋白激酶B(Akt)磷酸化、Bcl-2和Bax蛋白表达水平.结果显示,HUVECs经高糖培养48和72 h后,细胞活力明显下降(P＜0.01).经1、10和100 nmol/L艾塞那肽干预48 h后,细胞活力明显增加,并呈浓度依赖性(P＜0.01).与正常糖浓度组比较,高糖组细胞凋亡率升高,Akt磷酸化和Bcl-2蛋白表达水平下降,Bax蛋白表达增加,Bcl-2/Bax比值降低(P＜0.01).艾塞那肽干预后,细胞凋亡率下降,Akt磷酸化和Bcl-2蛋白表达增加,Bax蛋白表达下降,Bcl-2/Bax比值升高(P＜0.01),而艾塞那肽的作用可被磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002所对抗(P＜0.01).提示艾塞那肽可通过PI3 k/Akt信号通路调节Bcl-2/Bax蛋白表达来抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡,起到保护内皮细胞的作用.     

高糖上调内皮细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1表达的作用机制

目的探讨高糖上调内皮细胞间黏附分子1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)表达的作用机制。方法高浓度葡萄糖(20mmol/L)处理分离培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs),以2′-7′-二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)标记流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)。Western blot分析细胞内抑制性蛋白κB(IκB)和核转录因子-κB(NF-κB)蛋白表达和磷酸化水平。免疫荧光法检测NF-κB的活化。结果高糖处理HUVECs后,伴随ROS的显著升高,IκB蛋白明显下调,磷酸化的IκB和NF-κB均增多,使NF-κB移位至细胞核内,导致ICAM-1、VCAM-1的表达明显增强。结论高糖通过刺激ROS的产生和NF-κB的活化上调内皮细胞ICAM-1和VCAM-1黏附因子的表达。     

Premature senescence of human endothelial cells induced by inhibition of glutaminase

Cellular senescence is now recognized as an important mechanism of tumor suppression, and the accumulation of senescent cells may contribute to the aging of various human tissues. Alterations of the cellular energy metabolism are considered key events in tumorigenesis and are also known to play an important role for aging processes in lower eukaryotic model systems. In this study, we addressed senescence-associated changes in the energy metabolism of human endothelial cells, using the HUVEC model of in vitro senescence. We observed a drastic reduction in cellular ATP levels in senescent endothelial cells. Although consumption of glucose and production of lactate significantly increased in senescent cells, no correlation was found between both metabolite conversion rates, neither in young endothelial cells nor in the senescent cells, which indicates that glycolysis is not the main energy source in HUVEC. On the other hand, glutamine consumption was increased in senescent HUVEC and inhibition of glutaminolysis by DON, a specific inhibitor of glutaminase, led to a significant reduction in the proliferative capacity of both early passage and late passage cells. Moreover, inhibition of glutaminase activity induced a senescent-like phenotype in young HUVEC within two passages. Together, the data indicate that glutaminolysis is an important energy source in endothelial cells and that alterations in this pathway play a role in endothelial cell senescence.     

Pigment epithelium-derived factor inhibits TNF-alpha-induced interleukin-6 expression in endothelial cells by suppressing NADPH oxidase-mediated reactive oxygen species generation

Pigment epithelium-derived factor (PEDF) has recently been shown to be involved in the pathogenesis of proliferative diabetic retinopathy. Atherosclerosis is an inflammatory-fibroproliferative disease as well. Oxidative stress plays a major role in retinopathy and atherosclerosis. Accordingly, we investigated effects of PEDF on reactive oxygen species (ROS) generation, NF-kappaB activation and interleukin (IL)-6 expression in TNF-alpha-exposed HUVEC. TNF-alpha significantly increased intracellular ROS generation, which was completely blocked by PEDF or diphenylene iodonium, an inhibitor of NADPH oxidase. Further, PEDF completely prevented the TNF-alpha-induced increase in NADPH oxidase activity. PEDF or an antioxidant, N-acetylcysteine, significantly inhibited the TNF-alpha-induced NF-kappaB activation. PEDF inhibited TNF-alpha-induced expression of IL-6 at both mRNA and protein levels. Moreover, TNF-alpha downregulated PEDF mRNA levels. Ligand blot analysis revealed that HUVEC possessed a membrane protein with binding affinity for PEDF. The results demonstrated that PEDF inhibited TNF-alpha-induced NF-kappaB activation and subsequent IL-6 overexpression in HUVEC by suppressing NADPH oxidase-mediated ROS generation. Our present study suggests that PEDF may play an important role in the development and progression of atherosclerosis.     

热休克蛋白27磷酸化在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

目的研究热休克蛋白27磷酸化在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用。方法取健康剖腹产孕妇的脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行培养,选择2～3代细胞进行实验。①检测高糖对内皮细胞中热休克蛋白27(HSP-27)蛋白活性的影响:实验分正常细胞组与高糖组。正常细胞组不做处理直接提取细胞总蛋白,高糖组为30.5mmol/L高糖分别干预细胞24、48、72h后提取总蛋白。②检测槲皮素对高糖诱导的内皮细胞中HSP-27活性的影响:实验分为正常细胞组,高糖组和高糖+槲皮素组。正常细胞组不做处理,高糖组为30.5mmol/L高糖干预细胞;高糖+槲皮素组为槲皮素(10μmol/L)先与细胞孵育1h后再加入刺激物高糖(30.5mmol/L),各细胞组培养48h后提取总蛋白。①与②中细胞总蛋白均采用特异性Phospho-HSP27抗体的蛋白免疫印迹法检测HSP-27的活性;采用Annexin-Ⅴ-PI染色流式细胞技术检测人脐静脉内皮细胞凋亡。分组及干预情况同②,比较各组间细胞的凋亡率。结果高糖呈时间依赖性诱导人脐静脉内皮细胞中HSP-27磷酸化,30.5mmol/L高糖作用24、48、72h,HSP-27磷酸化水平较正常对照组分别提高了100%(P<0.05),182.5%(P<0.01),117%(P<0.05)。而HSP-27选择性阻断剂槲皮素(10μmol/L)作用48h可以抑制高糖诱导的HSP-27磷酸化,与高糖组相比槲皮素组HSP-27磷酸化水平降低了52.6%(P<0.01),与此同时,可使凋亡增加,内皮细胞凋亡率较高糖组增高了37.6%(P<0.01)。结论 HSP-27磷酸化可能在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中起保护作用。     

Biphasic response of endothelial progenitor cell proliferation induced by high glucose and its relationship with reactive oxygen species

In this study, the effect of high glucose (HG) on endothelial progenitor cell (EPC) proliferation and its relationship with cyclins and reactive oxygen species (ROS) were investigated. Mouse EPCs were isolated from bone marrow using a magnetic activated cell-sorting system and cultured in the presence or absence of HG (30 mmol/l). We found that in the early stage of incubation (3 days), HG promoted cell proliferation, and increased the expressions of cdk2 and cyclin E, while in the late stage of culture (7 days) it inhibited cell proliferation and decreased the expressions of cdk2, cyclin E, and proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Moreover, on the third day after incubation, HG significantly inhibited the apoptosis of EPCs, while in the late stage it markedly activated caspase-3 and promoted apoptosis. ROS generation in cells and maleic dialdehyde level in medium were significantly increased in HG group on the seventh day, whereas the expressions of superoxide dismutase and glutathione levels decreased. Tempol, a membrane-permeable radical scavenger, significantly inhibited ROS production in EPCs and partially reversed the HG-mediated inhibition of EPCs proliferation on the seventh day. We hypothesize that in the HG environment, the biphasic response of EPC proliferation may be related to the generation of ROS, which causes modulation of cyclins and cell cycle effect.     

硫化氢对内皮祖细胞数量和功能的影响

目的：观察不同浓度的硫化氢（H2s）对体外培养内皮祖细胞（EPCs）数量和功能的影响。方法：以密度梯度离心法获取脐血单个核细胞,培养6d后收集贴壁细胞。用流式细胞仪检测细胞表达CD34、CD133、血管内皮生长因子受体（VEGFR）2、VE—Cadherin,并用荧光显微镜观察细胞吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac—LDL）和异硫氰酸荧光素-荆豆凝集素-1（FITC—UEA-1）来鉴定EPCs。以不同浓度的H2S（0、10μM、50μM、100μM或500μM）孵育EPCs（每天1h）,分别培养4d观察细胞集落及6dEPCs数量。结果：与正常对照组相比,H2S在一定浓度下（〈100μM）呈浓度依赖性促进EPCs增殖及细胞集落形成（P〈0．05）。结论：一定浓度的硫化氢可能通过抗氧化发挥对内皮祖细胞的影响。     

银杏叶提取物对活性氧诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察银杏叶提取物（EGB）对活性氧诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响。方法用含100 g/L小牛血清的DMEM体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞,用不同浓度的过氧化氢（H2O2）作为外源性活性氧刺激VSMC增殖,应用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR）掺入和细胞周期时相测定等方法观察给予不同浓度的EGB预处理后,EGB对H2O2作用后VSMC的增殖的影响。结果H2O2对VSMC的增殖活性具有剂量依赖性促进作用,EGB可以抑制H2O2诱导的VSMC增殖,且具有剂量依赖性。结论EGB对于动脉粥样硬化形成及经皮腔内冠状动脉介入治疗后再狭窄的防治可能具有应用前景。