高压氧联合替莫唑胺对胶质瘤U251细胞的影响

目的研究高压氧(Hyperbaric Oxygen,HBO)联合替莫唑胺(Temozolomide)对人神经胶质瘤U251细胞株的的影响及其机制。方法实验分为4组:A组高压氧联合替莫唑胺组、B组高压氧组、C组替莫唑胺组、D组对照组。通过体外模拟缺氧微环境,用四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)、碘化丙啶(PI)染色法、流式细胞仪分别检测细胞生长抑制率、细胞死亡率、细胞凋亡率。Elisa法检测缺氧诱导因子1-α(HIF1-α)和多药耐药相关蛋白-1(MRP-1)的表达情况。结果 1高压氧联合替莫唑胺组在细胞生长抑制率、细胞死亡率和细胞凋亡率上明显高于其他组,数值均有统计学意义(P<0.05)。2高压氧联合替莫唑胺组与高压氧组在HIF1-α和MRP-1上无统计学意义(P>0.05),与其他组有统计学意义(P<0.05)。结论高压氧够增强替莫唑胺化疗效果,高压氧纠正了肿瘤的缺氧环境,下调了HIF1-α和MRP-1的表达,这可能是治疗作用的关键所在。     

替莫唑胺通过TFRC抑制U87胶质瘤细胞增殖和侵袭

目的 探讨转铁蛋白受体（TFRC）在替莫唑胺抑制U87胶质瘤细胞增殖和侵袭中的作用。方法 体外培养U87胶质瘤细胞,加入50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L替莫唑胺作用;构建control siRNA、siTFRC转染U87细胞沉默TFRC表达,构建pcDNA3.1空载体、pcDNA3.1/TFRC转染U87细胞过表达TFRC;利用CCK-8方法检测U87细胞增殖;利用Transwell小室实验检测U87细胞侵袭能力;实时荧光定量PCR和免疫印迹法检查U87细胞TFRC mRNA和蛋白表达。结果 与空白组相比,替莫唑胺处理后,U87细胞的增殖和侵袭能力显著下降（P<0.05）,TFRC mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,当替莫唑胺浓度为200 μmol/L时,对U87细胞的抑制能力最强（P<0.05）。当利用pcDNA3.1/TFRC过表达U87细胞TFRC处理后,替莫唑胺对U87细胞增殖和侵袭的抑制能力显著下降（P<0.05）;而当利用siTFRC沉默U87细胞TFRC表达后,替莫唑胺对U87细胞增殖和侵袭的抑制能力显著增强（P<0.05）。结论 替莫唑胺可能通过抑制TFRC的表达而抑制U87胶质瘤细胞的增殖和侵袭。     

KU-55933抑制替莫唑胺诱导的U87胶质瘤细胞自噬

目的研究KU-55933对替莫唑胺(TMZ)诱导的U87细胞自噬及TMZ毒性的影响及机制。方法 U87细胞分别给予5、10、15、20μmol/L KU-55933作用72 h,或10μmol/L KU-55933作用24、48、72、96 h,MTT法检测细胞增殖。U87细胞分别给予DMSO、100μmol/L TMZ、10μmol/L KU-55933、100μmol/L TMZ+10μmol/L KU-55933作用72 h,流式细胞术检测自噬小体,Western blot检测相关蛋白的表达。结果 KU-55933抑制U87细胞的增殖,并呈剂量及时间依赖性;KU-55933抑制TMZ诱导的共济失调突变蛋白(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)、自噬激活激酶(unc-51 like autophagy activating kinase1,ULK1)、P53蛋白磷酸化,降低微管相关蛋白(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta,LC3B)裂解,减少自噬小体的生成,增加TMZ敏感细胞组蛋白亚型γH2AX的形成,但对细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase 1,Chk1)、细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase 2,Chk2)蛋白磷酸化无影响。结论 KU-55933可抑制TMZ诱导的胶质瘤细胞自噬,并且增强TMZ对敏感胶质瘤的细胞毒性。     

替莫唑胺对人脑胶质瘤细胞生物活性的影响

目的：探讨替莫唑胺（Temozolomide ,TMZ）及其衍生物对人脑胶质瘤细胞生物活性的影响,为人脑胶质瘤的治疗提供理论指导。方法制备TMZ衍生物2‐替莫唑胺‐8‐羧酸聚乙二醇脂（2T‐P400、2T‐P600）,观察不同浓度 TMZ及其衍生物在胶质瘤细胞系SHG‐44体外抑瘤中的作用。结果随着终浓度的上升,TMZ、PEG400、PEG600对细胞生长的抑制率呈上升趋势,相同终浓度TMZ对细胞生长的抑制率均显著高于PEG400及PEG600（P＜0.05）;随着终浓度的上升,2T‐P400、2 T‐P600对细胞生长的抑制率呈上升趋势,相同终浓度2 T‐P400与2 T‐P600对细胞体外生长的抑制率差异无统计学意义（ P＞0.05）;2T‐P400、2T‐P600的IC50略高于TMZ ,但差异无统计学意义（P＞0.05）,PEG400、PEG600的IC50均显著高于其他3种药物。结论 TMZ能够显著降低人脑胶质瘤细胞的生物活性,其衍生物2 T‐P400、2 T‐P600具有相似的抑瘤效应和更高的水溶性,为降低患者治疗过程中胃肠道不良反应、延长其生存预期提供了方向。     

替莫唑胺对人胶质瘤细胞系U251细胞miR125b的影响

目的探讨替莫唑胺(TMZ)对人胶质瘤细胞系U251细胞的miRNA125b的表达影响。方法将人胶质瘤细胞系U251细胞分成空白对照组、TMZ组,TMZ组设10、25、50、100、200、400、600μmol/L组。各组分别作用于24、48、72 h后进行实时定量PCR(Real-time PCR)检测miRNA-125b的表达水平;用MTT比色法检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果荧光定量PCR检测结果显示:替莫唑胺作用24 h后,miRNA125b表达变化不明显;48 h后对miR-125b表现出抑制作用,miR-125b对U251细胞的抑制率呈良好的时间-剂量效应关系,其Ic50为76μmol,初始抑制浓度为50μmol;流式细胞仪检测显示,U251细胞经TMZ作用后出现G2/M期阻滞,但促凋亡作用并不显著。结论在TMZ对胶质瘤细胞治疗过程中,hsa-miR-125b的表达随着治疗剂量而被抑制,miR-125b可以作为TMZ在用药过程中效果的检测以及抗药性反应的参考依据。     

塞来昔布联合替莫唑胺对胶质瘤U251细胞作用研究

目的探讨环氧合酶抑制剂塞来昔布联合抗肿瘤药物替莫唑胺对神经胶质瘤细胞系U251细胞的体外抗瘤效应及其可能机制。方法分别使用塞来昔布、替莫唑胺和两者联合用药干预U251细胞;显微镜下观察细胞形态学变化;以甲基噻唑基四唑比色法检测药物对U251细胞增殖的影响;细胞划痕实验观察药物对U251细胞迁移能力的影响;采用膜联蛋白Ⅴ-碘化丙啶双染色通过流式细胞仪检测药物对肿瘤细胞凋亡的影响;Western Blot法检测药物对U251细胞中Bcl-2和Bax表达的影响。结果药物处理后,U251细胞出现明显的形态学改变,以联合用药组细胞最为显著;当塞来昔布与替莫唑胺联合应用时,显著增强替莫唑胺对U251细胞增殖的抑制效应,抑制细胞迁移,并促进其凋亡;塞来昔布和替莫唑胺联合作用后,U251细胞Bax表达增高、Bcl-2表达降低。结论塞来昔布和替莫唑胺联合应用可以协同抑制肿瘤细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡;其促进细胞凋亡的机制可能与Bax表达的上调以及Bcl-2表达的下调有关。     

替莫唑胺衍生物治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的 观察替莫唑胺(TMZ)类水溶性衍生物2T-P400、2T-P600对人脑胶质瘤的抑制效应.方法 体外抑瘤实验:以MTT法测定2T-P400、2T-P600、PEG400、PEG600、TMZ相对于空白对照组对胶质瘤细胞SHG-44的抑制率.体内抑瘤实验:制备荷SHG44人脑胶质瘤裸小鼠模型,将荷瘤鼠随机分为TMZ组、2T-P400组、2T-P600组、聚乙二醇(PEG)组及生理盐水组,TMZ口服给药,其他药物均为鼠尾静脉注射给药,每4天测量肿瘤体积.结果 体外抑瘤效应:2T-P400和2T-P600对SHG44细胞的杀伤效果与TMZ相近,均明显优于PEG400和PEG600 (P ＜0.01).体内抑瘤效应:TMZ组、2T-P400组和2T-P600组抑瘤率亦明显高于PEG组及生理盐水组(P＜0.05),未见明显药物不良反应.结论 2T-P400、2T-P600保留TMZ的抑瘤活性,为胶质瘤病人在术后TMZ类药物化疗提供新的药物及用药途径选择.     

过表达miR-21通过PI3K-AKT 通路抑制替莫唑胺对胶质瘤U87细胞的增殖抑制作用

目的 探讨miR-21 过表达在替莫唑胺(TMZ)诱导胶质瘤U87 细胞增殖中的作用及其机制,明确miR-21 过表达在替莫唑胺临床治疗胶质瘤耐药中的作用.方法 Pre-miR-21 过表达载体转染U87 细胞,通过形态学观察,噻唑蓝(MTT)试验检测细胞增殖情况.Western 印迹验证Akt 和p-Akt 表达及检测PI3K 活性.结果 替莫唑胺可显著抑制U87 细胞生长,下调Akt 和p-Akt 表达及抑制PI3K 活性.U87 细胞预转染pre-miR-21 过表达载体后,替莫唑胺的这种效应可部分被miR-21 过表达所抑制.结论 miR-21 过表达可通过活化PI3K-AKT 通路部分抑制替莫唑胺诱导的U87 细胞凋亡,提示胶质瘤中miR-21 过表达可能是替莫唑胺临床治疗胶质瘤药物抵抗的一大新的因素.     

TIMP-2对人脑胶质瘤U87体外侵袭力的抑制作用

目的 探讨TIMP-2对人脑胶质瘤细胞体外侵袭力的抑制作用。方法 用携带TIMP-2基因的重组腺病毒载体AdTIMP-2，体外转染人胶质瘤细胞系U87，用Western blotting检测目的蛋白的表达。通过Boyden小室法检测U87转染前后细胞体外侵袭力的变化，同时采用胶原酶谱法分析MMP-2、MMP-9活性改变。结果 D转染AdTIMP-2病毒后的U87细胞目的蛋白表达上调，转染后U87细胞的MMP-2、MMP-9明显下降，同时体外侵袭力受到明显抑制。结论 重组腺病毒载体介导的TIMP-2基因治疗，是一种有效的抗胶质瘤方法。     

慢病毒介导的RNAi下调miR-221抑制U87胶质瘤细胞生长的研究

目的 探讨下调miR-221对U87胶质瘤细胞生长的影响及可能的作用机制.方法 构建靶向miR-221的siRNA慢病毒表达载体并感染U87胶质瘤细胞,应用原位杂交、定量PCR和Western blot法检测干扰后细胞内miR-221及p27蛋白表达变化,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化,Transwell法检测细胞侵袭力改变.结果 成功构建了靶向miR221的siRNA慢病毒表达载体,该载体能有效抑制内源性miR-221的表达,同时上调p27蛋白的表达,同时抑制细胞生长,诱导凋亡,降低细胞的侵袭力.结论 成功构建靶向miR-221的RNAi慢病毒表达载体,该载体能够有效抑制miR-221的表达并抑制U87胶质瘤细胞的生长,为以miR-221为靶点的胶质瘤基因治疗的后续研究奠定基础.     

华蟾素诱导人胶质瘤U87细胞凋亡的作用机制研究

目的 探讨华蟾素(Cinobufacini)对人胶质瘤U87细胞凋亡的促进作用及其机制。方法 将体外培养的胶质瘤U87细胞分为对照组、华蟾素组(依华蟾素水平不同分为3个亚组),MTT法测定细胞增殖率,流式细胞仪测定细胞凋亡率,Hoechst 33258核染色法观察细胞核凋亡,透射电镜观察细胞形态学的变化,Western blot法检测胶质瘤U87细胞内Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的蛋白表达水平。结果 华蟾素对胶质瘤U87细胞增殖有抑制作用; 流式细胞仪及Hoechst 33258核染色法的检测显示,随着华蟾素作用浓度的递增,胶质瘤U87细胞凋亡率呈剂量依赖性递增; 华蟾素作用后可使Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达水平升高。结论 华蟾素通过改变Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达水平来抑制胶质瘤U87细胞增殖并促进其凋亡。     

反义hTR治疗联合Tamoxifen增强对人胶质瘤细胞生长的抑制作用

目的探讨Tamoxifen单独或联合端粒酶反义RNA（hTR）治疗对胶质瘤细胞生长的抑制作用；方法Tamoxifen单独或联合hTR反义cDNA作用于人胶质瘤细胞系TJ905细胞．用MTT法、TRAP法、TUNEL法、免疫组化法等检测效果。结果Tamoxifen、反义hTR治疗都能抑制TJ905细胞生长，7d后细胞生存率分别为38．6％（TAM浓度为15mM）、52．8％，以二者联合应用抑制作用最强，细胞生存率为20．6％；凋亡指数明显增加，胶质瘤细胞内端粒酶活性、PKC和IGF-1的表达被抑制。结论hTR反义治疗联合Tamoxifen能通过抑制PKC和IGF-1表达增强对胶质瘤细胞生长的抑制作用。     

反义miR-21抑制异种移植U87人脑胶质瘤生长的体内研究

目的 探讨敲低miR-21表达抑制裸鼠皮下荷U87人脑胶质瘤生长的疗效和机制.方法 原位注射miR-21反义寡聚核苷酸(AS-miR-21)治疗裸鼠皮下荷U87人脑胶质瘤.定时测量肿瘤大小评估原位注射AS-miR-21的治疗效果.使用RT-PCR和原位杂交方法 鉴定治疗后miR-21表达水平,采用HE染色和免疫组织化学染色(增殖细胞核抗原、细胞周期抑制因子-21、基质金属蛋白酶-9和隔蛋白-7)评价治疗后肿瘤生物学性状的变化,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡. 结果 肿瘤生长曲线显示AS-miR-21治疗组肿瘤生长速度及体积明显小于对照组与无义序列治疗组,差异有统计学意义(F=6.056,P=0.007);RT-PCR检测显示AS-miR-21治疗组miR-21表达下调为对照组的(0.031±0.008)%;原位杂交显示AS-miR-21治疗组miR-21表达水平较对照组与无义序列治疗组下调:组织病理学检测表明AS-miR-21治疗后肿瘤恶性度降低;TUNEL法检测可见AS-miR-21治疗组细胞凋亡数明显高于对照组与无义序列治疗组,差异有统计学意义(F=141.021,P=0.000). 结论 以miR-21作为靶点治疗异种移植U87人脑胶质瘤效果令人满意,miR-21可作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.     

白藜芦醇对脑胶质瘤U87细胞及干细胞凋亡诱导作用

目的比较研究白黎芦醇(Res)对人脑胶质瘤U87细胞及其胶质瘤干细胞(GSC)的作用。方法膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)和碘化丙啶(PI)染色法测定细胞凋亡;CD133标记、CD133与AnnexinⅤ/PI共标记检测GSC相对含量及GSC的凋亡;实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测mdr1基因mRNA表达,流式细胞术(FCM)测定P-糖蛋白(P-gp)的表达;集落形成法(CFU)检测细胞的自我更新和增殖能力。结果不同浓度的Res显著诱导U87细胞凋亡,抑制U87细胞集落的形成。40～160μmol/L Res作用后U87细胞群体中CD133+GSC相对含量显著增高、GSC凋亡细胞数量增加,但GSC对Res的敏感性低于U87群体细胞。Res诱导后U87细胞群体中高表达mdr1/P-gp的细胞显著增高,并与GSC含量的增高基本相一致。结论白黎芦醇可诱导脑恶性胶质瘤U87群体细胞及其干细胞凋亡。     

pEGFP-ING4抑制裸鼠皮下人U87移植瘤生长及肿瘤血管生成

目的 探讨pEGFP-ING4对裸鼠体内人U87细胞移植瘤生长及对肿瘤血管生成的影响.方法 将成功构建的18只人U87细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为pEGFP-ING4和pEGFP-C2转染组及PBS空白对照组3组,测量各组肿瘤的体积变化,荧光显微镜观察转染瘤体内绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达情况,免疫组织化学SABC法检测微血管密度(microvessel density,MVD).结果 荧光显微镜下pEGFP-ING4 组和pEGFP-C2组均观察到GFP表达,接种后第21d、28d、35d各组皮下肿瘤体积(mm3)为:PBS 组(201.8±19.3,418.9±26.4,622.1±51.3),pEGFP-C2 组(197.6±18.9,398.4±20.4,593.7±48.7),pEGFP-ING4 组(138.9±8.4,198.7±21.5,293.2±31.6),肿瘤接种后在同一时间点内,pEGFP-ING4 组肿瘤体积明显小于另外两组(P<0.05);MVD检测(个/mm2):PBS 组(15.83±0.98),pEGFP-C2 组(15.83±1.62),pEGFP-ING4 组(4.17±1.17),与另外两组比较,pEGFP-ING4 组MVD明显降低(P<0.01).结论 ING4基因能够明显抑制人U87细胞裸鼠皮下移植瘤的生长,抑制胶质瘤血管的生成可能是其抗肿瘤的重要机理之一.     

胶质瘤U87细胞中AKT2基因表达对化疗药物替尼泊苷敏感性的影响

目的探讨脑胶质瘤U87细胞中AKT2基因表达对替尼泊苷（VM-26）敏感性的影响。方法体外将慢病毒介导的AKT2-shRNA表达载体转染胶质瘤U87细胞,作为实验组;转染GFP—shRNA的U87细胞作为阴性对照组,未转染的U87细胞作为空白对照组。应用RT—PCR、Westernblot检测3组U87细胞中AKT2mRNA和蛋白的表达变化。应用MTT法检测3组U87细胞对VM-26敏感性的变化。结果与阴性对照组和空白对照组比较,实验组转染后的U87细胞AKT2mRNA和蛋白的表达水平明显下降（P〈0．01）。实验组VM-26对U87细胞的半数抑制量（IC50）为（6．46±0．42）μg／ml,阴性对照组为（1．16±0．25）μg／ml,空白对照组为（1．15±0．22）μg／ml,实验组与两对照组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AKT2-shRNA抑制AKT2基因表达,能增加人脑胶质瘤U87细胞株对化疗药物VM-26的敏感性。     

姜黄素诱导自噬抑制脑胶质瘤U87细胞增殖的研究

目的研究姜黄素对脑胶质瘤U87细胞增殖的抑制作用及机制。方法采用10、20、40、60、80μmol/L姜黄素分别处理U87细胞72h后,MTT法检测姜黄素对U87细胞增殖的影响。流式细胞术检测40μmol/L姜黄素处理前后U87细胞周期和凋亡变化。提取40μmol/L姜黄素处理前后不同时间点U87细胞总蛋白,Westernblot检测自噬相关蛋白LC3的表达。结果姜黄素呈剂量依赖性抑制U87细胞增殖(P0.05),半数抑制浓度(IC50)为42.44μmol/L。姜黄素诱导G2-M期细胞周期阻滞,实验组G2-M期细胞比例为(47.71±2.67)%,对照组为(17.96±0.88)%(P0.01);实验组细胞凋亡率为(3.93±0.82)%,对照组为(1.80±0.65)%,两组差异无统计学意义(P0.05)。姜黄素给药12、24、48h,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别为(0.89±0.004)、(0.93±0.01)、(1.09±0.02),高于对照组(0.76±0.04)(P0.05);3-MA能减弱姜黄素对U87细胞增殖的抑制作用。结论姜黄素通过诱导自噬抑制脑胶质瘤U87细胞的增殖。     

Notch受体阻断剂MW167抑制U87胶质瘤细胞增殖的作用研究

目的 探讨Notch受体阻断剂MW167对胶质瘤细胞系U87增殖及凋亡的影响.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测MW167对体外培养的胶质瘤细胞系U87的增殖抑制作用.流式细胞仪AnnexinV-FITC和PI双染检测凋亡率.结果 MTT法检测显示MW167能明显抑制U87细胞的增殖并呈剂量依赖关系:流式细胞仪检测显示MW167可诱导U87胶质瘤细胞发生凋亡并呈剂量依赖关系.结论 MW167明显抑制U87胶质瘤细胞的增殖并诱导其发生凋亡,提示Noah受体阻断剂MW167对人脑胶质瘤的治疗具有潜在的临床应用价值.