乙型肝炎病毒preS2蛋白在转基因小鼠肝脏中的表达

目的：分析乙型肝炎病毒preS2蛋白在3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠肝脏中的分布及其病理学作用。方法：采用原核显微注射法将质粒pcDNA3.1-preS/S^t注射入小鼠受精卵雄原核，制备转基因小鼠。PCR法在基因组小平筛选3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠首建者（founder）及后代；免疫组织化学法在蛋白水平检测preS2蛋白在这些小鼠中的表达；H－E染色分析转基因小鼠肝组织的病理学变化。结果：以原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，共出生15只新生小鼠，其中存活7只，经PCR检测后获得2只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(preS/S^t）SMMU。免疫组织化学检测发现转基因小鼠肝细胞质中有preS2蛋白表达，H－E染色发现转基因小鼠肝组织中央静脉周围有淋巴细胞聚集。将这2只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F2代。结论：本研究成功建立了稳定遗传3’末端缺失的preS/S基因并表达preS2蛋白的转基因小鼠C57－TgN(preS/S^t)SMMU，它将是体内研究3’末端缺失的preS/S基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间关系的理想动物模型。     

HBV基因疫苗诱导正常及HBV转基因小鼠产生体液免疫应答

目的:用乙型肝炎病毒(HBV)蛋白基因真核表达载体诱导正常小鼠及HBV转基因小鼠产生特异性体液免疫应答,以探讨其预防及治疗HBV慢性感染的可行性.方法:将HBV S2.S基因的真核表达载体pCMV-S2.S(PS)和相应的空载体pcDNA3.0分别免疫正常C57BL/6小鼠及同一品系HBV转基因小鼠(n=5).每只小鼠肌内注射纯化质粒100 μg.用ELISA方法检测小鼠血清抗HBs和抗preS2效价及HBV转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg的水平.注射基因疫苗后第8周,活检取转基因小鼠肝脏组织,制备石蜡切片并行H-E染色,光镜下观察其病理改变.结果:PS诱导正常及转基因小鼠产生了抗HBs及抗preS2,并且抗preS2的出现早于抗HBs约1～2周.PS免疫8 周后,转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg为阴性.注射基因疫苗后第8周病理检查转基因小鼠肝脏组织,肝细胞出现程度不同的广泛浊肿和水样变性,而相应的对照组无明显改变.免疫前后肝组织内单个核淋巴细胞数量无显著变化.结论:研究表明HBV中蛋白基因疫苗能够有效诱导HBsAg特异性的体液免疫应答,能够清除转基因小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;初步的实验结果为研制治疗HBV慢性感染的基因疫苗提供了依据.     

乙型肝炎病毒(adr亚型)preS2-S基因转基因小鼠的建立

目的：建立可表达乙型肝炎病毒（adr亚型）包膜中蛋白的转基因小鼠品质。方法：通过原核显微注射法制备带有乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因的转基因小鼠。应用PCR方法筛选乙型肝炎病毒preS2-S基因转基因首建者（founder）小鼠，再以免疫组织化学法分析乙型肝炎病毒蛋白在这些小鼠中的表达特性，PCR和免疫组化均阳性的转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配用于传代培育，并用PCR法检测其子代小鼠。结果：共注射受精卵69枚。选取存活受精卵58枚分别植入4只假孕小鼠，产仔并存活23只。经尾组织DNA PCR筛选得到5只整合preS2-S基因的founder小鼠，免疫组织化学法发现其中3只小鼠的肝脏中表达HBsAg，进而对其中表达较强的阳性鼠进行保种。结论：所建立的乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因转基因小鼠品系具有表达乙肝病毒中蛋白的生物学特性，这一品系的建立为中蛋的相关研究提供了技术平台。     

HBV基因在第20代HBV转基因小鼠中的复制和表达

目的研究HBV基因在已传20代BALB／c-TgN（HBV D型1．3）SWS458小鼠中复制和表达情况。方法采用PCR荧光定量检测法、ELISA检测和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的复制和表达情况。结果F20代BALB／c-TgN（HBVD型1．3）SWB458小鼠血清HBVDNA为（104—106）copy／mL，HBsAg表达量为（124．41±33．46）ng/mL，preS1和HBcAg的OD值分别为0．248±0．076和0．635±0．338。肝组织有HBsAg和HBcAg表达，且HBsAg为胞浆型，HBcAg为核型。结论经过筛选和培育，本转基因小鼠传至20代时HBV基因复制表达稳定，表明我们已经获得一个传代表达稳定的HBV转基因小鼠品系。     

乙肝核酸疫苗对荷瘤小鼠免疫保护作用的实验研究

目的 观察乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)核酸疫苗pCMV-S2S免疫小鼠后的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答, 及对表达HBV preS2S抗原的SP2/0-S2S肿瘤细胞攻击的保护作用.方法 将BALB/c小鼠随机分为3组, 于0、4及8周分别接种pCMV-S2S(实验组)、乙肝表面抗原蛋白疫苗(HBsAg,对照组1)、空载质粒( pCMV,对照组2 )各3次.末次免疫后4周,每组各取3只小鼠,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL活性.各组其它小鼠均用于肿瘤细胞攻击实验:分别于一侧胁部皮下种植SP2/0-S2S细胞,同时于另一侧种植不表达HBV preS2S抗原的SP2/0-CMV 细胞作阴性对照.种植肿瘤细胞(荷瘤)后观察成瘤时间、肿瘤大小和荷瘤后小鼠的生存时间及生存率.结果 pCMV-S2S组CTL活性为(34.21±1.38)%,高于HBsAg组[(19.64±1.50)%]和pCMV组[(3.45±1.89)%](P＜0.05).荷瘤后10 d,pCMV-S2S组小鼠SP2/0-S2S细胞的成瘤率为58.3%,低于SP2/0-CMV细胞的成瘤率(91.7%)(P＜0.05);两对照组SP2/0-S2S细胞与SP2/0-CMV细胞的的成瘤率无明显差异.荷瘤后pCMV-S2S组初次出现死亡小鼠的时间为24 d,较两对照组均延迟了13 d,平均生存时间为(31±1) d,较两对照组延长(P＜0.05);4周生存率(75%)高于两对照组(P＜0.05), 两对照组之间生存时间及生存率差异无统计学意义.结论 HBV核酸疫苗pCMV-S2S能在小鼠体内诱生较强的特异性CTL活性,对荷瘤小鼠具有特异性免疫保护作用,可望用于HBV感染的免疫保护.     

C3d增强基因免疫诱导的小鼠抗乙型肝炎病毒特异性免疫应答

目的探讨C3d对乙型肝炎病毒(HBV)基因免疫诱导的特异性免疫应答的调节作用,为增强HBV基因疫苗免疫效果寻求新途径。方法将HBVpreS2/S编码基因分别插入真核表达载体TR421和含有三拷贝C3d编码基因的TR421C3d3质粒,构建重组质粒TR421preS2/S和TR421preS2/SC3d3。采用肌肉注射法对BALB/c小鼠实施基因免疫,以空质粒TR421为对照,定期采集血清。ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗HBsIgG,3HTdR掺入法检测其特异性淋巴细胞增殖活性。结果TR421preS2/SC3d3重组质粒免疫组诱导的特异性抗HBsIgG水平明显高于TR421preS2/S重组质粒免疫组(P<005),而且TR421preS2/SC3d3重组质粒基因免疫诱导的特异性淋巴细胞增殖活性也显著高于TR421preS2/S重组质粒组(P<005)。结论C3d可增强基因免疫诱导的HBV特异性体液和细胞免疫应答,为提高HBV基因疫苗的免疫效果提供了新的途径。     

成人接种重组酵母乙肝疫苗后免疫效果的评价

目的：探讨重组酵母乙型肝炎疫苗（YDV）对成人的免疫效果及安全性。方法；在辽宁省北票市部分学校选择22－58岁教师124人，一般健康状况良好，乙型肝炎表面抗原（HBsAg)，乙型肝炎表面抗体（抗－HBs ）,乙型肝炎核心抗体（抗－HBc)3项指标均为阴性，体温正常。按0，1，6个月程序，每剂5μg/0.5ml接种卫生部北京生物制品研究所生产的YDV。结果；免疫后3，7，12，24个月时，抗－HBs阳转率分别为35．0％，83．3％，65．5％，37．2％（P＜0．01），在7个月时达到高峰，以后又急剧下降。女性抗－HBs阳转率均高于男性。小于35岁组的抗体阳转率高于35岁以上组，但仅在免疫后12个月时二者有显著性差异。免疫3d后局部和全身未见不良反应。结论：YDV对成人具有良好的免疫原性和安全性，其抗－HBs持续时间有待进一步观察。     

自身免疫性肝病20例临床分析

目的：比较自身免疫性肝炎（AIH）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）和慢性乙型肝炎的临床特点，以利于临床早期鉴别诊断。方法：分析20例自身免疫性肝病临床资料，并将其与同期20例慢性乙型肝炎进行比较。结果：PBC肝功能异常以碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶和总胆红素升高为特点，转氨酶水平低于AIH和慢性乙型肝炎；后两者肝功能异常无统计学差异．PBC免疫学指标以IgM升高为特点；AIH和慢性乙型肝炎亦有IgG升高，但两者相比无明显差异，自身免疫性肝病血液循环中可出现多种自身抗体，其中PBC以抗线粒体抗体（AMA），尤其AMA-M2为主；AIH循环自身抗体以抗核抗体（ANA）、抗平滑肌抗体（SMA）为主，肝穿刺病理学检查显示：PBC胆管损伤、炎症、淤胆明显；AIH以汇管区浆细胞浸润为主要特征；慢性乙型肝炎以肝细胞变性坏死明显；但总体而言，三者病理上并无可确诊的形态学改变。结论：自身免疫性肝病与慢性乙型肝炎临床表现、肝功能检查及病理皆有许多相似之处，但仍然有其各自特异的临床诊断依据，治疗方法也有明显不同。     

自身免疫性肝炎的诊断

自身免疫性肝炎（autoimmunehepatitis，AIH）是一种较少见的慢性进展性肝脏疾病，主要临床表现为血清转氨酶升高、高丙种球蛋白、血清自身抗体。肝组织学改变的特征为，汇管区单核细胞、淋巴细胞、浆细胞及巨噬细胞浸润并向周围肝实质侵入形成界板炎症。并侵入肝小叶的实质，炎症细胞围绕于坏死肝细胞，最终可导致肝纤维化和肝硬化。     

利用α-胞衬蛋白免疫诱导建立小鼠干燥综合征模型

目的 应用α-胞衬蛋白(α-Fodrin)免疫BALB/C小鼠,以期建立干燥综合征的实验动物模型.方法 应用α-胞衬蛋白100μg(50μl)配合等体积佐剂,于0、14、35、51 d进行尾根部皮下注射给药免疫4周龄的BALB/C小鼠,以颌下腺匀浆作为阳性对照,GST及PBS作为阴性对照.小鼠每周计饮水量,每2～3周取血,检测不同时间点小鼠血清中的α-胞衬蛋白抗体、M3受体蛋白多肽(M3RP)抗体、SSA抗体、SSB抗体、类风湿因子(RF)以及抗核抗体(ANA)等自身抗体,ELISA方法测定小鼠血清中的细胞因子白介素(IL)-2,IL-10和干扰素(IFN)-γ.检测小鼠颌下腺病理改变及α-胞衬蛋白的抗原表达情况.结果 (1)免疫前小鼠血清中的自身抗体均为阴性,而自初次免疫后35 d开始,经颌下腺匀浆及α-胞衬蛋白免疫的BALB/C小鼠出现α-胞衬蛋白抗体、M3RP抗体和ANA,而上述抗体在PBS和GST对照组为阴性.(2)自初次免疫后56 d开始,予颌下腺匀浆及α-胞衬蛋白免疫的BALB/C小鼠的腺体中出现少量淋巴细胞浸润,且随时间的延长,淋巴细胞浸润逐渐加重;而应用PBS和GST免疫的小鼠腺体无明显的病理改变.应用α-胞衬蛋白多抗免疫组化的方法检测颌下腺匀浆、α-胞衬蛋白免疫的BALB/C小鼠的颌下腺组织中有α-胞衬蛋白表达,而PBS和GST组为阴性.(3)IFN-γ在予α-胞衬蛋白、颌下腺匀浆、GST及PBS免疫后分别为(81.6±7.1)、(90.5±4.9)、(30.1±5.9)、(19.3±6.4)ps/ml;IL-2在上述各组免疫后分别为(18.7±2.3)、(19.8±0.9)、(4.9±1.1)、(3.5±1.6)pg/ml,与GST及PBS组相比,α-胞衬蛋白及颌下腺匀浆免疫可明显提高小鼠血清IFN-γ和IL-2水平(P<0.05).(4)α-胞衬蛋白免疫对各组小鼠饮水量无明显影响.结论 (1)建立了应用α-胞衬蛋白诱导的SS动物模型.(2)免疫后小鼠血清中出现的多种抗体可能与抗原扩展有关.(3)干燥综合征的发病可能与Thl参与有关.     

乙型肝炎病毒preS 2蛋白在Hela细胞中的表达

[目的]构建乙型肝炎病毒含3’末端缺失的preS／S基因表达载体并转染细胞，观察所构建载体在体外培养的真核细胞中的表达．[方法]采用基因重组技术构建含有CMV启动子及preS／S基因（adr亚型）开放阅读框的preS／S基因表达载体pcDNA3．1-preS／St，并将其转染至Hela细胞，利用免疫细胞化学方法检测其表达情况．[结果]免疫细胞化学检测发现preS2蛋白可在Hela细胞中表达．     

Wa细胞膜上与乙型肝炎病毒的preS1特异性结合的受体样蛋白

本文对与乙型肝炎病毒外周蛋白ｐｒｅＳ１特异结合的Ｂ细胞来源的Ｗａ细胞膜受体样蛋白进行了研究，用麦芽糖结合蛋白－ｐｒｅＳ１－直链淀粉树脂亲和层析柱分离得到了与ｐｒｅＳ１特异性结合的Ｗａ细胞膜受体样蛋白质，抗麦芽糖结合蛋白－ｐｒｅＳ１的单克隆抗体Ｆ３５．２５结合Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实确系膜蛋白与ｐｒｅＳ１的特异性结合，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，Ｗａ细胞膜上存在有三种不同的受体样蛋白，分子量分别为６００００，５６０００和４８０００．这表明在非肝细胞膜中也可能存在乙型肝炎病毒的特异性受体和直接感染途径。     

前S1抗原和HBV-DNA与HBV血清标志物之间的相关性探讨

目的 探讨前S1抗原和HBV-DNA与HBV血清标志物之间的关系.方法 对1158例慢性乙型肝炎患者用酶联免疫吸附试验(EUSA)检测HBV血清标志物和PreS1,聚合酶链反应(PCR)方法检测HBV-DNA.结果 1158例慢性乙型肝炎患者中HBV-DNA总阳性率68.9%,PreS1总阳性率54.8%,有显著性差异(X2=53.24,P<0.005).HBV-DNA、PreS1在HBeAg( )组的阳性率均明显高于HBeAg(-)组(HBV-DNA:X2=226.24,P<0.005;PreS1:X2=49.64,P<0.005).PreS1和HBeAg与HBV-DNA的总符合率分别为56.9%和63.3%,PreS1的敏感性高于HBeAg,但特异性则相反.随着HBV-DNA拷贝数的升高,PreS1和HBeAg的阳性率亦随之升高,HBV-DNA含量低时PreS1的阳性率明显高于HBeAg.结论 联合检测HBV血清标志物、PreS1,并动态监测HBV-DNA的含量,在观察慢性乙肝患者HBV复制、疗效时具有重要的临床应用价值.PreS1可作为HBeAg阴性、无条件开展HBV-DNA检测时的补充指标.     

Recombinant adenovirus with human indoleamine-2,3- dioxygenase and hepatitis B virus preS was constructed and expressed in HepG2 cells

Background  Indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) is proven to suppress hepatitis B virus (HBV) specific immune response and depletion of IDO may be a useful approach for HBV therapy. To test this concept, we constructed recombinant adenovirus with human IDO and HBV preS, which would form the basis for future in vivo experiments. 

Methods  The fragment of human IDO and HBV preS cDNA were subcloned into multiple cloning sites in an adenoviral vector system containing two cytomegalovirus (CMV) promoters. Recombination was conducted in the Escherichia coli BJ5183. The recombinant adenovirus containing hIDO gene and HBVpreS gene was packaged and amplified in 293 cells. Integration was confirmed by polymerase chain reaction as well as the quantification of viral titers. HepG2 cells were infected with the recombinant adenovirus and mRNA and protein specific for hIDO and HBVpreS was detected by RT- PCR and Western blotting respectively.

Results  The recombinant adenovirus was produced successfully. Its titer was 2.5×10⁹ efu/ml. IDO and HBVpreS mRNA as well as the encoded proteins could be found in transfected HepG2 cells, but not in control HepG2 cells.

Conclusion  The transfer of hIDO-HBVpreS with double-promoter adenoviral vector was efficient. The recombinant adenovirus with hIDO and HBV preS would provide the experimental basis for future studies.

     

慢性乙型肝炎病毒感染者血清前S_2蛋白和聚合人血清白蛋白结合活性的对比研究

以合成的前S2肽免疫兔获得抗血清。分别以抗前S2抗体和聚合人血清白蛋白作试剂,用固相放免法检测前S2和聚合人血清白蛋白结合活性。在甲型肝炎和HBsAg(-)的各类慢性肝病病人中均未检出。在经肝活检诊断的慢性乙型活动性肝炎,两者的检出率在病情增重期显著高于缓解期,并高于肝组织正常的无症状HBV携带者。在HBeAg(+)组中两者的检出率均显著高于抗HBe(+)组。在上述检测中,聚合人血清白蛋白结合活性与前S2并不相同,后者的检出率仅为前者的56.7％。     

Binding site of hepatitis B virus preS1 region to the asialoglycoprotein receptor of human liver

ＴｈｅｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ (ＨＢＶ)ｉｓａｍａｊｏｒｐａｔｈｏｇｅｎｏｆｃｈｒｏｎｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅａｎｄｌｉｖｅｒｃｉｒｒｈｏ ｓｉｓａｎｄｉｓｋｎｏｗｎｔｏｂｅｉｎｆｅｃｔｅｄｔｏｔｈｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｖｉａＨＢＶｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒｓ[1] .Ｈｏｗｅｖｅｒ ,ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅ ｃｅｐｔｏｒｆｏｒＨＢＶｈａｓｎｏｔｙｅｔｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ .ＴｈｅＨＢＶｅｎｖｅｌｏｐｓｃｏｎｓｉｓｔｏｆｔｈｒｅｅｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅ…     

急慢性乙肝患者血清preS1-Ag抗HBc-IgM检测的临床意义

目的观察急、慢性乙肝患者病变及治疗过程中Pre-S1Ag、抗HBc-IgM的变化并探讨其临床意义。方法应用酶联免疫法、荧光定量PCR技术及化学法对145例急、慢性乙肝患者病变及治疗过程中血清Pre-S1Ag、抗HBc-IgM、HBV-DNA及肝功能(总蛋白、白蛋白、总胆红素、直接/间接胆红素、丙氨酸氨基转移酶、总胆汁酸)等指标进行检测并观察其与预后的关系。结果Pre-S1Ag、抗HBc-IgM在急性乙型肝炎中检出率高达95.2%和97.6%,治疗后,两项指标均显著下降;肝功能完全恢复组Pre-S1Ag、抗HBc-IgM阳性率显著低于未恢复组(P<0.05);慢性活动性乙肝中两项指标均为83.3%且活动性乙肝组显著高于非活动性乙肝组;Pre-S1Ag、抗HBc-IgM与HBV-DNA阳性率高度相关(r1=0.98,r2=0.96,P<0.05)。结论检测Pre-S1Ag和抗HBc-IgM对急性乙肝的早期诊断、监测复制及预后评估及慢性乙肝的分类均具有较大价值。     

乙型肝炎病毒S区和C区基因长片段扩增新方法的探讨

目的 :为HBV基因研究提供一个灵敏度和扩增效率均较佳的长片段PCR新方法 .方法 :应用自行设计的引物扩增血清中HBVS区和C区的 2 .5kb基因 ,并与HBV全长扩增方法进行比较 .结果 :HBV 2 .5kbPCR方法在HBsAg阳性患者血清中的阳性检出率明显高于全长PCR方法 (P <0 .0 5 ) ,相同反应条件下 2 .5kbPCR产物的平均A值和灰度总值也高于 3.2kb的全长基因组 (P <0 .0 5 ) .结论 :HBV2 .5kbPCR方法的灵敏度和扩增效率高于全长PCR方法 ,可作为HBV相关疾病研究中的一种新的技术手段