人组蛋白H1基因的原核表达、纯化及其活性检测

目的:克隆人组蛋白H1全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及活性检测.方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人组蛋白H1全长编码区基因,将其克隆到pGEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达与纯化产物.结果:从人乳腺文库中扩增获得约650 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为52 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H1,激酶实验证明该蛋白活性良好.结论:成功获得了活性良好的重组蛋白GST-H1,为后续研究细胞周期蛋白调控奠定了实验基础.     

人TLR1胞外段原核表达载体的构建、蛋白表达及纯化

目的:克隆、原核表达人Toll-like receptor1 (TLR1)胞外段基因,获得人TLR1胞外段蛋白.方法:RT-PCR扩增人TLR1胞外段基因,构建pET30(a)+/TLR1表达质粒,转染大肠杆菌BL21,在BL21细胞中表达TLR1胞外段蛋白,并进行纯化和Western blot 鉴定.结果:PCR扩增及重组质粒测序结果表明成功地构建了pET30(a)+/TLR1胞外段原核表达质粒,PCR扩增的目的基因大小为1 700 bp左右.表达的包涵体蛋白经溶解及变性后上镍亲和柱纯化,SDS-PAGE分析纯化产物在Mr为68 kD处有明显蛋白条带;Western blot ELISA结果显示,其表达纯化的蛋白为TLR1蛋白.结论:TLR1胞外段在大肠杆菌BL21中正确表达,为TLR1识别机制及信号转导机制研究奠定了基础.     

人FOXP3 cDNA的克隆及在原核细胞中的表达

目的:克隆人FOXP3cDNA,构建其原核表达载体,在大肠杆菌中表达。方法:从新生儿脐带血获得FOXP3mRNA,用巢式RT-PCR技术扩增FOXP3cDNA,产物纯化后T-A克隆连接至pMD18-T载体,构建其原核表达载体pRSET-A-FOXP3,转化大肠杆菌BL-21(DE3)pLysS,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定。结果:获得FOXP3mRNA,并对其编码区cDNA序列进行扩增。PCR产物连接至原核表达载体pRSET,经DNA测序,证实与Gen-Bank中的人FOXP3编码序列一致。经SDS-PAGE及Western blot显示在相对分子质量(Mr)约为52000处出现融合表达条带,表达量约占菌体蛋白总量的20%。结论:成功地克隆人FOXP3cDNA,构建了其原核表达载体,并在大肠杆菌中得到有效表达。     

牛IL-18成熟蛋白基因在昆虫细胞中的表达及其活性

目的:在杆状病毒表达载体中表达牛白细胞介素-18(bovine interleukine-18,BoIL-18)成熟蛋白基因,并鉴定其生物学活性。方法:设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTb上,构建重组质粒repFastBac HTb-18,转化至DH10Bac感受态细胞中得到重组Bacmid(Bacmid-BoIL18)。在Cellfectin作用下,将Bacmid-BoIL18转染昆虫细胞sf9获得重组杆状病毒,然后将重组杆状病毒感染sf9,感染后不同时间收获sf9细胞,进行SDS-PAGE电泳,分析表达情况;用BoIL-18的原核表达产物作为抗原制备的兔多克隆抗体进行Western blot分析;将纯化的表达产物对牛外周血单个核细胞(PBMC)进行细胞增殖试验,对健康牛脾进行IFN-γ诱生试验,初步分析表达产物的生物学活性。结果:BoIL-18成熟蛋白基因在昆虫细胞中获得了表达,经薄层凝胶扫描分析证实,表达量占总蛋白的21.3%;Western blot分析证明,在相对分子质量(Mr)约为26 000处有一条特异性条带。生物学活性分析表明,纯化的表达产物可明显增强淋巴细胞增殖,促进IFN-γ的产生。结论:BoIL-18成熟蛋白基因在昆虫细胞中获得了表达,表达产物具有良好的生物学活性。     

人DC-SIGN全长编码区基因的克隆及其胞外段的原核表达

目的:克隆人DC-SIGN全长编码区基因, 获得其胞外段的原核表达产物.方法:采用RT-PCR方法, 从健康产妇胎盘中克隆DC-SIGN全长cDNA, 扩增其胞外段基因并构建pET41a-sDC-SIGN重组表达质粒, 在大肠杆菌BL21(DE3)中表达, 以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果:从健康产妇胎盘总RNA中, 扩增获得约1 300 bp的DNA片段, 克隆至pGM-T载体获得重组质粒pGM-DC-SIGN.从pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN的胞外段基因, 构建重组表达质粒pET- 41a-sDC-SIGN;纯化表达产物sDC-SIGN-GST, 鉴定其相对分子质量( M r)为66 000, Western blot证明其可与抗DC-SIGN抗体特异性结合.结论:成功克隆DC-SIGN全长编码区基因, 并在大肠杆菌中成功表达其胞外段融合蛋白sDC-SIGN-GST, 为进一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础.     

人热休克蛋白70基因的原核表达

目的 表达人热休克蛋白70（HSP70）并进行鉴定。方法 用PCR方法扩增人HSP70基因片段，经T-A克隆法克隆到载体pUCm-T中，并进行DNA测序，将人HSP70基因片段从载体pUCm-T中酶切后，构建重组表达载体pGEX-4T-1-HSP70，并转化大肠杆菌JM109，用IPTG诱导，收集细菌，菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测。结果 人HSP70基因的PCR产物约为1.9kb。序列测定结果证实，所获目的序列与文献[3]报道的相一致，经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定证实。人HSP70基因已成功地克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建的表达载体pGEX-4T-1-HSP70，能很好地在大肠杆菌中表达相对分子质量（Mr)为96000并具有抗原特性的融合蛋白，结论 成功地克隆并表达了HSP70基因，为研究HSP70的结构。功能与临床应用提供了必要条件。     

人IL-1β的克隆及其高效可溶性表达

目的:从人淋巴细胞中克隆白介素-1β(IL-1β)cD-NA,通过原核可溶性表达纯化,获得具有生物活性的可溶性IL-1β,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础.方法:从人PBMC中克隆出人成熟IL-1β基因,并插人到原核表达载体pSUMO中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pSUMO-hIL-1β.将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达hIL-1β/SUMO融合蛋白,经Ni-NTA Agaroae纯化后,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.用protease-1切去SUMO标签,用Real time-PCR鉴定其对人T细胞表达的细胞因子的影响.结果:SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量(Mr)为37 000,成熟蛋白Mr为17 000,与理论值相符.灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的约30%左右,主要以可溶形式存在.Western blot证实该蛋白为hIL-1β.成熟蛋白纯化产物纯度超过90%以上.通过RT-PCR检测证明其具有刺激人T细胞大量表达多种细胞因子(IL-1β,IL-4,IL-10,IL-18,IFN-γ,TGF-β,TNF-α)的活性.结论:利用大肠杆菌表达系统完全可以高效可溶性表达较高纯度的具有生物活性的hIL-1β蛋白.     

我国地方品种鸡IL-17cDNA的克隆、表达及鉴定

目的:克隆我国地方品种鸡IL-17 cDNA,构建该基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白并鉴定其免疫特性。方法:利用特异性引物,通过RT-PCR方法扩增得到隐性白羽鸡IL-17(ChIL-17)的基因片段,PCR产物克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-ChIL17。将重组质粒pGEX-6P-1-ChIL17转化E.coliBL21,IPTG诱导表达目的蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果:成功扩增出ChIL-17基因片段,大小约510 bp,序列与GenBank登录的序列(NM 204460)相比,核苷酸同源性为99.8%,第477位碱基由G变为A,氨基酸同源性为100%。酶切鉴定结果表明,ChIL-17基因正确克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中。重组质粒pGEX-6P-1-ChIL17在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示出Mr约46 000大小的目的蛋白表达条带;Western blot结果表明,表达产物与小鼠IL-17抗体具有良好的反应性。结论:成功克隆并表达出我国地方品种鸡ChIL-17基因,为抗ChIL-17单...     

FSHR胞外区基因片段的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建人卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)胞外区的原核表达载体,并用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备抗血清.方法 采用RT-PCR克隆人FSHR胞外区,将其克降到原核表达载体pET32a(+),并通过IPTG诱导目的 基因在大肠杆菌中表达,所获得的包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化重组蛋白,并用SDS-PAGE和蛋白印迹法鉴定.结果 PCR扩增出1 047 bp目的 基因片段,测序证实克隆的基因序列与GenBank中的FSHR序列相符.工程菌pET32 a(+)/FSHR胞外区经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr约为58 000,与预期的一致.其表达形式为不溶性包涵体,此包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,纯化的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带.该蛋白免疫小鼠制备抗血清,抗体效价为1:12 800,Western blot检测证实该抗体能与目的 蛋白发生特异性结合.结论 获得了人FSHR胞外区融合蛋白及特异性多克隆抗体,为进一步研究FSHR蛋白的功能奠定了基础.     

幽门螺杆菌napA-ctxB融合蛋白的基因克隆与表达

目的 克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白napA与霍乱毒素B亚单位ctxB融合基因napA-ctxB(nctB),为制备预防H.pylori感染的疫苗奠定基础.方法 用PCR方法扩增ctxB目的基因片段,克隆至pQE30-napA质粒的napA基因上游,构建含双基因的表达质粒pQE30-napA-ctxB(pQE30-nctB),经测序分析确认后转化E.coli DH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白NCTB,融合蛋白NCTB经镍离子柱纯化.结果 PCR扩增出807 bp的目的基因片段nctB.工程菌pQE30-nctB-DH5α经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr为30 000,与预期的一致,约占菌体总蛋白的27%,重组蛋白用Ni2 -NTA 树脂提纯,纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图象软件分析表明纯度可达94%以上.Western blot 显示重组蛋白质有良好的抗原性.结论 构建含双基因的表达质粒pQE30-nctB成功,并在大肠杆菌DH5α中高效的表达.