奥曲肽抑制裸鼠肝癌原位种植瘤生长机制的研究

目的观察奥曲肽(OCT)抑制肝癌生长的效果,对其抑瘤作用的机制进行深入的探讨。方法以裸鼠肝癌原位种植瘤模型,观察OCT对种植瘤生长的影响,以免疫组化观察OCT对种植瘤内生长抑素受体2(SSTR2)、肝细胞生长因子受体(cMet)、转化生长因子β1(TGFβ1)、磷酸化Smad2、Smad4和Smad7蛋白的表达,以半定量逆转录聚合酶链反应观察SSTR2和Smad4mRNA的表达。结果OCT明显抑制裸鼠人肝癌种植瘤的生长[(0.17±0.14)gvs.(0.53±0.06)g],抑瘤率达到67.9%;治疗组种植瘤内SSTR2和Smad4mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组;cMet的蛋白表达显著下降;TGFβ1、磷酸化Smad2和Smad7的蛋白表达两组差异无统计学意义;此外,肿瘤内磷酸化Smad2的表达显著低于正常肝脏。结论OCT能显著抑制裸鼠肝癌原位种植瘤的生长,其机制可能与上调SSTR2表达、下调cMet表达以及促进TGFβ抑制信号的传导,恢复TGFβ/Smads系统的抑瘤功能有关。此外,磷酸化Smad2表达的降低可能是Bel7402肝癌细胞的重要特征之一。     

奥曲肽下调cMet的表达抑制肝细胞癌的生长

目的 研究生长抑素类似物奥曲肽对肝细胞癌生长的影响及其抑瘤机理。方法 以MTT法检测奥曲肽对Bel7402人肝癌细胞株增殖的影响,光镜下观察细胞形态的变化;以细胞“划痕”实验和黏附实验观察其对细胞侵袭和黏附能力的影响;以流式细胞仪检测细胞周期及细胞表面肝细胞生长因子受体cMet表达的变化。以裸鼠人肝癌转移模型为材料,观察奥曲肽对种植瘤生长的影响及其预防种植瘤切除术后复发转移的作用,免疫组化法观察种植瘤内cMet蛋白表达。结果 奥曲肽处理后的Bel7402细胞增殖能力和细胞形态无明显改变;细胞的侵袭和黏附能力随着奥曲肽作用时间的延长明显低于未经奥曲肽处理的Bel7402细胞株（P〈0．05）;处于生长静止期（G0／G1）细胞的比例显著增加（P〈0．01）;cMet表达阳性的细胞比例明显减少（P〈0．001）。裸鼠人肝癌种植瘤的生长受到明显抑制（P〈0．001）,奥曲肽的抑瘤率为67．9％,种植瘤内cMet的阳性表达程度也显著降低;同时,种植瘤切除后无一例出现复发转移,而未经奥曲肽处理者,有3例复发且其中1例死亡,肝内转移瘤内cMet表达亦高于原种植瘤,但差异无统计学意义。结论 奥曲肽能通过下调cMet的表达抑制肝癌的生长。     

奥曲肽上调Smad4表达抑制肝癌细胞生长

目的观察奥曲肽（octreotide，OCT）对Bel7402人肝癌细胞内Smad4调节及其对肝癌细胞的抑制作用。方法以MTr法测量OCT对Bel7402细胞增殖的影响，光镜下观察细胞形态的变化。以细胞迁移实验和粘附实验观察细胞侵袭和粘附能力的影响。以流式细胞仪检测细胞周期和Smad4蛋白的变化。以裸鼠人肝癌种植模型，观察OCT对种植瘤生长的影响，以免疫组化观察种植瘤内Smad4蛋白的表达。以半定量RT—PCR观察体内外Smad4mRNA的表达。结果OCT处理的Bel7402细胞增殖能力和细胞形态无明显改变，细胞的侵袭和粘附能力明显下降，细胞生长静止期（G0／G1）的比例显著增加（48．0％±3．2％vs57．7％±0．9％），OCT明显抑制裸鼠人肝癌种植瘤的生长，抑瘤率达到67．9％。体外OCT流式细胞仪检测治疗组种植瘤内Smad4蛋白（6．36±1．22）的表达显著高于对照组（3．22±1．20）。体内外Smad4 mRNA的表达，治疗组（0．701±0．035，1．091±0．131）也明显高于对照组（O．531±O．073，0．634±0．222）。结论OCT能显著抑制体内外肝癌细胞的生长，上调肝癌细胞内Smad4的表达可能是其抑瘤的重要机制。     

人肝癌细胞系HCCLM3中生长抑素受体亚型的表达研究

目的检测人肝癌高转移细胞系生长抑素受体mRNA和蛋白的表达,探讨生长抑素对肝癌细胞株增殖的影响及其作用机制.方法应用免疫组化和RT-PCR的方法检测人肝癌细胞系中五种生长抑素受体亚型的表达,并进行半定量分析;应用MTT法检测8肽生长抑素对肿瘤细胞增殖的影响.结果肝癌细胞HCCLM3中存在SSTR1-5表达.生长抑素抑制肝癌细胞株HCCLM3的增殖并呈浓度依赖性,其作用可以被PTP抑制剂正钒酸钠所抑制;HCCLM3细胞表达5种生长抑素受体的mRNA和蛋白,表达强度由强到弱依次为SSTR2、SSTR1、SSTR4、SSTR3、SSTR5.SSTR2和SSTR1的表达强度明显强于SSTR3、SSTR4、SSTR5（P＜0.05）,应用生长抑素后受体亚型SSTR2、SSTR3、SSTR5 mRNA表达强度明显高于SSTR1、4 mRNA（P＜0.05）.结论五种生长抑素受体亚型均存在于HCCLM3肝癌细胞系中,生长抑素可以明显抑制肝癌细胞的增殖.SSTR2 SSTR3、SSTR5和生长抑素结合后通过激活PTP抑制肿瘤细胞的生长和增殖.     

生长抑素类似物对肝癌细胞转化生长因子β/Smads信号系统的调节

生长抑素 (SST)是一种环状的多肽类激素 ,在人体内具有广泛的生物效应 ,主要表现为调节生长激素释放、神经冲动传递、免疫细胞活性、抑制内分泌及平滑肌收缩 ,减少肠系膜血流、抑制肠道对氨基酸的吸收等[1] 。转化生长因子 (TGF) β/Smads信号是上皮细胞重要的负性调节系统 ,是机体抑癌的中心环节。本研究旨在探讨OCT对肝癌的抑制作用 ,及该抑瘤作用同TGFβ/Smads系统的关系。一、材料与方法1.细胞株 :Bel740 2人肝癌细胞株。2 .裸鼠肝癌原位种植瘤的制作 :取Bel740 2细胞株 ,制成 2× 10 6个细胞悬液 ,接种于裸鼠腹股沟。待皮下肿…     

TRAIL真核表达质粒的构建及抑制肝癌生长的实验研究

目的构建TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因的真核表达质粒，观察其对BALB／c裸鼠肝癌细胞皮下移植瘤模型的抑瘤作用。方法提取U937细胞总RNA．用RT-PCR方法扩增出胞外区(114—281aa)，连入溶菌酶信号肽序列，构建分泌型TRAIL重组质粒；建立裸鼠7402肝癌细胞皮下移植瘤模型，纯化后的质粒DNA与脂质体聚乙烯胺混合后经肌肉注射进行基因转染，体内验证重组蛋白的抑瘤活性，采用TUNEL法进行肿瘤组织细胞凋亡检测。结果肿瘤体积测定结果显示．TRAIL对肝癌细胞生长有抑制作用；凋亡检测光镜下可见有棕褐色凋亡细胞，细胞凋亡指数增高。结论重组TRAIL质粒能引起肿瘤细胞的凋亡，抑制7402肝癌细胞的生长。     

生长抑素受体-2基因逆转上皮-间充质转化抑制肝癌细胞侵袭转移机制的研究

目的 观察生长抑素受体-2(SSTR2)基因对肝癌细胞株MHCC-97H侵袭转移及上皮-间充质转化(EMT)特性的影响.方法 构建慢病毒3FLAG-puromycin-LV及SSTR2-LV,转染肝癌细胞株MHCC-97H,噻唑蓝(MTT)、免疫荧光检测转染效率.采用Transwell侵袭实验和迁移实验分别检测未转染细胞(空白对照组)、转染3FLAG-puromycin-LV细胞(阴性对照组)和转染SSTR2-LV细胞(实验组)侵袭转移能力的强弱.镜下观察转染前后细胞形态的变化,免疫荧光检测转染前后细胞上皮表型蛋白和间质表型蛋白的定位和表达,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测转染后细胞SSTR2的表达,Westem blot检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白的表达.结果 SSTR2-LV可以有效转染肝癌细胞株MHCC-97H,稳定表达SSTtR2的mRNA和蛋白.转染SSTR2-LV的肝癌细胞株MHCC-97H较空白对照组和阴性对照组侵袭迁移能力明显受到抑制(P＜0.05).镜下观察肝癌细胞株MHCC-97H转染SSTR2-LV后,由成纤维细胞样、排列分散,转变为细胞排列紧密如铺路石.免疫荧光染色结果可见肝癌细胞株MHCC-97H转染后细胞膜表达的E-cadherin荧光由胞质转移至细胞周边浓聚,而Vimentin的荧光强度较前下降.采用Western blot进行蛋白定量分析,转染后MHCC-97H细胞上皮表型标志性蛋白E-cadherin、β-连环蛋白(β-catenin)表达量增高,间质表型标志性蛋白N-cadherin、Vimentin表达量减少,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 转染再表达SSTR2MHCC-97H细胞可以增加上皮表型蛋白表达,减少间质表型蛋白,从而逆转肝癌细胞EMT,导致肿瘤细胞侵袭能力减弱.     

腺病毒介导反义基质金属蛋白酶-2抑制肝癌生长和血管生成的研究

目的探讨携带反义二型基质金属蛋白酶（MMP2）基因的重组腺病毒（Ad-MMP2AS）对人肝癌动物模型生长和血管生成的抑制作用。方法用我们构建的Ad-MMP2AS感染人肝癌细胞株（Bel-7402）。Boyden Chamber检测Ad-MMP2AS对Bd-7402细胞降解人工基底膜（Matrigel）的抑制作用；Western blotting和明胶酶谱分析测定Ad-MMP2AS对Bel-7402细胞分泌MMP2的影响；用感染Ad-MMP2AS的Bel-7402细胞接种于裸鼠皮下观察其成瘤能力；Ad-MMP2AS瘤内注射。观察它对肝癌生长的抑制作用；肿瘤组织切片、HE染色观察瘤细胞生长情况；免疫组织化学分析肿瘤组织血管密度。结果Ad-MMP2AS感染的Bel-7402细胞穿过Matrigel的Bel-7402细胞数下降52％、成瘤量下降4.3倍；瘤内注射Ad-MMP2AS使瘤体生长减少63％；肿瘤组织血管密度减少2.6倍。结论Ad-MMP2AS能抑制肝癌的生长和肿瘤血管的生成，对肝癌有治疗潜力。     

奥曲肽和NC-8-12对人结肠癌细胞株HCT116体内外生长的影响

目的　探讨生长抑素类似物 (SSTA)能否在体内、外抑制结肠癌细胞的增殖及其抑制作用的可能机理。方法　用RT PCR和原位杂交方法检测人结肠癌细胞株HCT116生长抑素Ⅱ型受体 (SSTR2 )mRNA的表达 ;用MTT法检测奥曲肽 (Oct)或SSTR2特异激动剂NC 8 12对胰岛素或表皮生长因子刺激下的HCT116细胞作用2 4h后的增殖情况 ,并用流式细胞仪检测其CyclinD1的表达 ;同时将HCT116细胞种植于裸鼠皮下 ,给予其奥曲肽或NC 8 12治疗 ,观察肿瘤生长情况。结果　①HCT116细胞株和荷瘤裸鼠癌组织中均有SSTR2mRNA的表达 ;②胰岛素和表皮生长因子能促进HCT116细胞株生长 ,且这一促进作用能部分地被Oct和NC 8 12减弱 ;③胰岛素刺激下HCT116细胞的CyclinD1表达水平提高 ,Oct或NC 8 12作用后其表达水平下降 ,但差异无显著性意义 (P>0 .0 5 ) ;④Oct和NC 8 12组裸鼠皮下种植瘤重量和体积与对照组比较差异无显著性意义 (P>0 .0 5 )。结论　在体外 ,Oct及NC 8 12均能抑制HCT116细胞株增殖 ,SSTR2参与介导了SSTA抑制结肠癌细胞生长的作用 ;在本实验剂量下 ,Oct和NC 8 12均对接种于裸鼠的人结肠癌肿瘤生长无影响。     

生长激素和生长抑素对人结肠癌裸鼠移植瘤模型的影响

目的观察外源性生长激素（GH）和生长抑素（SS）对人结肠癌细胞株HT-29裸鼠移植瘤模型肿瘤生长和裸鼠血清蛋白水平的影响。方法接种结肠癌细胞株HT-29建立裸鼠移植瘤模型。比较移植肿瘤体积、细胞周期分布、增殖指数（PI）、凋亡率、bcl-2和bax mRNA水平．以及裸鼠血清蛋白水平。结果生长抑素能够明显抑制移植瘤的生长（P〈0．05）、降低移植瘤PI（P〈0．05）、促进移植瘤细胞凋亡（P〈0．01）、降低移植瘤bcl-2mRNA表达（P〈0．05）、提高移植瘤baxmRNA表达（P〈0．05），生长激素则表现出相反的作用。生长激素能够改善移植瘤导致的低蛋白血症（P〈0．05）。结论外源性生长抑素能够显著抑制人结肠癌裸鼠移植瘤生长，外源性生长激素单独或联合生长抑素应用能够改善荷人结肠癌移植瘤裸鼠低蛋白血症，但具有潜在的促进肿瘤生长的作用。     

上调miR-449a表达对肝癌细胞生长和侵袭能力的影响

目的:探讨miR-449a在肝癌(HCC)细胞中的表达及其对HCC细胞生物学行为的影响。方法:用qRT-PCR检测miR-449a在正常肝细胞L02和4种HCC细胞株(HepG2、Hep3B、SMMC-7721和Bel-7402)的表达。用脂质体法将miR-449a模拟物或阴性对照序列转染HCC细胞后,分别用CCK-8法、流式细胞术、Transwell小室实验检测细胞增殖、细胞周期、侵袭能力的变化,并观察以上两种不同转染的HCC细胞在裸鼠体内的成瘤情况。结果:miR-449a在4种HCC细胞株的表达水平均明显低于L02细胞(均P0.05),其中在Bel-7402细胞表达的水平最低。与转染阴性对照序列的Bel-7402细胞比较,转染miR-449a模拟物的Bel-7402细胞增殖活性明显降低、G_1/S期阻滞明显增加、穿室细胞数明显减少(均P0.05);与转染阴性对照序列的Bel-7402细胞比较,转染miR-449a模拟物的Bel-7402细胞在裸鼠体内成瘤后的移植瘤质量与体积均明显减小(0.748 g vs.1.234 g;33.667 mm~3 vs.1 400.500 mm~3,均P0.05)。结论:HCC细胞中miR-449a表达降低,上调miR-449a表达可以抑制HCC细胞在体内外的生长。     

KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因联合survivin基因干扰抑制肝癌细胞生长的体内研究

目的：探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统（Ad-KDRP-CD/TK）联合survivin基因干扰对肝癌细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。
　　方法：将20只裸鼠随机分均为模型组（皮下植入BEL-7402肝癌细胞成瘤,不加任何处理）、双自杀基因转染组（皮下植入转染Ad-KDRP-CD/TK的BEL-7402细胞,成瘤后瘤内注射前药更昔洛韦与5-氟胞嘧啶）、survivinsiRNA转染组（皮下注射BEL-7402肝癌细胞,成瘤后瘤内注射survivinsiRNA/Lip-DMEM转染混合物）、联合转染组（双自杀基因转染+survivinsiRNA转染处理）。治疗2周后处死各组小鼠,称取肿瘤质量,计算肿瘤抑制率,检测瘤组织微血管密度（MVD）及survivinmRNA与蛋白表达。结果：各治疗组的肿瘤质量明显小于模型组（均P<0.05）,且联合转染组的抑瘤率最大（均P<0.05）;肿瘤组织MVD、survivinmRNA与蛋白水平均明显降低,且联合转染组的降低程度最为明显（均P<0.05）。
　　结论：双自杀基因联合survivin干扰是抑制鼠肝癌细胞在体内生长的有效途径。     

氟尿嘧啶与生长抑素受体基因联合治疗鼠 胰腺癌移植瘤的研究

目的 ： 观察生长抑素二型受体(SSTR2)基因体内转染后裸鼠胰腺癌移植瘤对5-氟尿嘧啶（5-FU）的反应，并探讨其可能机制。方法 ：将人胰腺癌细胞株panc-1种植于裸鼠背部皮下形成胰腺癌移植瘤模型。成模后动物随机分成4组（每组6只）;I组为对照组;II组为腹腔注射5-FU治疗组;III组为瘤内注射pCMV-6C-SSTR2-脂质体转染SSTR2基因治疗组;IV组为基因治疗+5-FU治疗组。观察肿瘤生长速度，测量瘤体大小及重量。用免疫组织化学方法和免疫印迹技术(Westernblot)检测转染效率;用凋亡原位检测方法(Tunel)检测胰腺癌细胞的凋亡率。结果 ：体内转染后SSTR2可重新表达。5-FU和SSTR2基因联合治疗(IV)组肿瘤生长速度显著慢于单独基因治疗(III)组及单独5-FU治疗(II)组和空白对照(I)组（ P <0.01）;最终肿瘤大小，重量也显著小于其他3组（均 P <0.01），而癌细胞凋亡率显著高于其他3组（均 P <0.01）。结论 ：SSTR2重新表达后可增强胰腺癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性，联合5-FU 和SSTR2基因治疗可望成为治疗胰腺癌新的途径。     

甲胎蛋白启动子驱动的yCDglyTK双自杀基因治疗裸鼠肝癌的机制研究

目的研究携带甲胎蛋白（AFP）启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶（yCDglyTK）双自杀基因体内靶向性治疗肝癌的效果和机制。方法构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因表达质粒,通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721肝癌细胞的裸鼠肝癌皮下种植瘤,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果成功构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因,其靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞种植瘤上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞种植瘤上无表达,氟胞嘧啶（5-FC）、更昔洛韦（GCV）及两者联合可有效抑制HepG2细胞种植瘤的生长,抑瘤效果GCV＋5-FC〉5-FC〉GCV,而SMMC7721细胞种植瘤的生长未受影响。HepG2细胞种植瘤治疗后有明显的细胞凋亡,而SMMC7721细胞种植瘤内极少凋亡细胞。结论携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。     

MAGE-1抗原肽致敏DC活化淋巴细胞对裸鼠肝癌移植瘤的免疫防护作用

目的　观察黑色素瘤 1基因 (MAGE 1)抗原肽致敏树突状细胞 (DC)所活化的淋巴细胞(CTL)对人肝癌HCC移植瘤的抑制和消退作用 ,评估临床治疗HCC的可行性和有效性。　方法BEL 74 0 2HCC细胞于 30只裸鼠背部皮下接种 ,建立裸鼠HCC移植瘤模型 ,其中 2 2只成瘤 ;用MAGE 1九肽致敏DC所活化的淋巴细胞 (1× 10 6)注入肿瘤部位皮下 (治疗组A ,n =5 ) ,其余 17只随机分成 5组 (B、C、D、E、F) ,用其他不同性质的细胞治疗 ,观察各组肿瘤生长情况并进行病理学分析和统计学处理 ,阐明特异性CTL对肿瘤的作用机制。　结果　 (1)A组HCC移植瘤均停止生长并趋于缩小 ,荷瘤裸鼠观察期内无死亡 ;而其他 5组肿瘤均快速生长 ,大部分荷瘤裸鼠 2周内死亡。MAGE 1九肽致敏DC所活化淋巴细胞能显著抑制HCC移植瘤生长 ,促使肿瘤消退 (P <0 0 1)。 (2 )A组移植肿瘤广泛坏死 ,肿瘤细胞广泛凋亡。　结论　MAGE 1九肽致敏DC有抑制HCC生长 ,促进HCC消退 ,防止肿瘤转移、复发的作用。肿瘤细胞凋亡增强是DC肿瘤免疫的可能机制。MAGE 1九肽联合DC可作为治疗HCC的新型疫苗。