长白山白眉蝮蛇血凝酶的分离纯化研究

摘 要 目的：建立一种分离纯化长白山白眉蝮蛇血凝酶的方法。方法: 先后采用分子筛层析法、离子交换色谱法、肝素 Sepharose亲和层析法从长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离纯化得到一种具有有凝血活性的酶成分,并采用SDS-Page法、RP-HPLC法测定其纯度,凝胶电泳法(SDS-Page)考察其对牛纤维蛋白原的作用方式、高效空间排阻色谱法（HPSEC）测定其相对分子质量,等电聚焦电泳分析法（IEF）测定其等电点,Lowry法测定其蛋白浓度。结果: 从长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离纯化了一种凝血酶成分,SDS-Page显示为一条带,HPLC得到单一的色谱峰,该酶只作用于纤维蛋白原的α链,其相对分子质量为32.2 kD,等电点为5.21,此酶具有体外凝血活性。结论:该方法可用于长白山白眉蝮蛇血凝酶的分离纯化。     

长白山白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的纯化

从长白山白眉蝮蛇蛇毒中纯化具有溶栓功效的纤溶酶。方法：用 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０离子交换、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５凝胶过滤层析和 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ ５０三步柱层析分离方法,对长白山白眉蝮蛇蛇毒进行分离纯化,得到了一种纤溶酶活性组分。结果：经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱表征该酶为单一蛋白,其分子量为 ２３．３６７ ｋＤ。结论：为进一步研究其结构和功能提供了可靠依据。     

一种蛇毒类凝血酶纯化新方法

目的 提供一种蛇毒类凝血酶的新纯化方法。方法 蛇毒经预处理后,依次经过苯甲脒琼脂糖凝胶亲和色谱、阳离子交换色谱和疏水色谱后获得蛇毒类凝血酶,分别对活性、分子量及纯度进行检测,并与使用现有专利方法制备的蛇毒类凝血酶进行质量比较。结果 新方法制备的蛇毒类凝血酶与现有专利方法相比,分子量无明显差异,但新方法的比活力更高,且纯度更高,同时新方法的工艺稳定性更佳。结论 新方法与现有专利方法相比,简化了工艺步骤,缩短了纯化周期,减少了过程环境暴露风险,可获得高纯度类凝血酶,工艺稳定性高,产品质量一致性好,利于临床安全用药。     

蝮蛇蛇毒类凝血酶的研究

为研制蝮蛇抗栓酶的换代产品，开发单一组分的类凝血酶制剂。采用离子交换和亲和层析等现代纯化方法，从东北白眉蝮蛇蛇毒中分离出了单一组分的类凝血酶。半成品经高效液相色谱凝胶柱测定，纯度大于90％，最高可达97.94％，分子量38200D，SDS－PAGE电泳测定为一条带，分子量为42100D，活性为1137BU／mg，比活性为1705BU／mg·pro，不含出血毒和神经毒，冻干成品制剂全部符合注射用品标准。     

白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的分离纯化

目的用白眉蝮蛇蛇毒分离纯化纤溶酶。方法利用离子交换层析、亲和层析、分子筛层析技术进行分离纯化纤溶酶。结果得到了电泳纯的纤溶酶,其相对分子质量为24000。结论该工艺可以快速地分离纯化白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶：     

白眉蝮蛇蛇毒的分离纯化及综合利用

目的促进蛇毒的有效、综合利用。方法在分离纯化白眉蝮蛇蛇毒中降纤酶的试验过程中,同时分离纤溶酶。结果主要成分降纤酶的回收率为55.80%,纤溶酶的回收率为20.40%。结论该方法实现了对蛇毒宝贵资源的综合利用,为其综合开发利用探索了一条有效途径。     

长白山蝮蛇蛇毒的提取分离

应用ＤＥＡＥ葡聚糖凝佼Ａ－５０对蝮蛇蛇毒进行柱层析分析得到十三个蛋白峰，其有效组份为凝血酶样酶（精氨酸酯）分布在６、７、８峰，并对该组酶的活性进行初步探讨。     

新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin止血作用的实验研究

目的:研究类凝血酶Agacutin的止血效果。方法:新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射Agacutin,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果。结果:静脉注射Agacutin 0.01~0.05 U.kg-1后,各组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%~60.5%),给药后30 min药效达高峰,药效持续24 h。与给药前比较,各组兔血纤维蛋白原含量和血粘度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致。试验结果显示,Agacutin对部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性、血小板体外聚集、优球蛋白凝固时间均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性。腹腔注射Agacutin0.5~2 U.kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%~66%)。结论:Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白且不激活凝血因子II和XIII,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成血栓形成。     

白眉蝮蛇降纤酶的纯化及特性分析

目的从白眉蝮蛇蛇毒中提取降纤酶,并对其进行特性分析。方法采用一步亲和色谱法分离纯化降纤酶,用高效液相色谱分析其纯度,SDS-PAGE测定其相对分子质量。结果分离得到的降纤酶纯度高(99%以上),SDS-PAGE分析为一条带,相对分子质量为36 000,比活性为4 800 u/mg。结论用一步亲和色谱法从白眉蝮蛇蛇毒中纯化降纤酶的方法简单有效,所得产品纯度高、产量高。     

尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的小鼠致畸试验

本实验主要对尖吻蝮蛇类凝血酶进行小鼠致畸试验,目的在于为今后临床药物安全使用提供资料。     

江浙蝮蛇毒镇痛组分的分离纯化及其理化性质

目的　分离筛选江浙蝮蛇毒中主要镇痛组分 ,研究其分子量、等电点、纯度、氨基酸序列、稳定性等理化性质 ,以及镇痛作用、机体耐受性和依赖性等药理学性质。方法　采用离子交换和分子筛 ,以柱层析法分离蛇毒组分。用生化测定方法 ,测定其理化性质。用热板法和醋酸扭体法等确定最佳镇痛组分 ,并用纳洛酮催促和自然戒断实验、耐受性实验考察其依赖性和耐受性。结果　分离获得 14个蛋白组分 ,经ED50 /LD50 筛选出最佳镇痛组分C4 ,鉴定结果表明纯度为电泳纯 ,HPLC相对纯度为 92 .16 % ,分子量 16 .6ku ,等电点 8.8,氨基酸序列与磷脂酶A2 同源 ,为一种新的镇痛蛋白 ,并获得其紫外吸收特征峰、镇痛耐受和依赖性等性质。结论　C4组分具有显著的镇痛效果 ,未发现耐受性和依赖性 ,值得进一步研究开发。     

液相色谱分离纯化五步蛇毒凝血酶样酶

目的：改进分离工艺，找到液相色谱分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的最佳方案。方法：五步蛇毒依次经SuperdexG75凝胶过滤、DEAE．SephroseF．F阴离子交换和SuperdexG30凝胶过滤，通过改变洗脱液pH值、流速、Tris浓度、盐浓度及上样量来考察对分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的影响。结果：Superdex75凝胶过滤色谱分离纯化受洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量的影响；DEAE—SephroseF．FN离子交换色谱受盐浓度的影响：SuperdexG30凝胶过滤色谱受上样量的影响。三步分离纯化后获得一种五步蛇毒凝血酶样酶，分子量约23kD。结论：依次经SuperdexG75、DEAE—SephroseF．F和SuperdexG30凝胶，通过改变洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量等能得到最佳分离条件．最终可获得五步蛇毒凝血酶样酶的纯品。     

蝮蛇毒纤溶酶的分离纯化及性质研究

目的 :寻找一种分离纯化蝮蛇毒纤溶酶的工艺并研究其理化性质。方法 :采用DEAE SepharoseCL 6B和HeparinCL 6B层析方法 ,从蝮蛇毒中分离纯化纤溶酶。结果 :蝮蛇毒纤溶酶经HPLC为单一峰 ,等电聚焦电泳为一条带 ,其等电点为 4.5 5 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为 2 9.4kD。该酶对热不稳定 ,在 pH6～ 9时稳定 ,氨基酸组成分析表明含酸性氨基酸较多。结论 :用此工艺可制得高纯度的蝮蛇毒纤溶酶。     

尖吻蝮蛇毒中一种新类凝血酶的分离纯化

用阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱技术,从尖吻蝮蛇毒中纯化得到一个具有凝血活性的组分.经Superdex 75 HR10/30预装柱检测,纯度达99.91%.SDS-PAGE显示为单一条带,还原、非还原条件下分子量分别为59.25k、52.58k.该组分的凝血酶比活为41.5u/mg,精氨酸酯酶比活为14.29u/mg,但不激活血浆凝血因子ⅩⅢ.EDTA不能抑制其凝血活性,而苯甲磺酰氟则产生不可逆抑制作用.结果表明该酶是一种新尖吻蝮蛇毒类凝血酶.     

Pharmacokinetics of thrombin-like enzyme from venom of Agkistrodon halys ussuriensis Emelianov determined by ELISA in the rat.

A thrombin-like enzyme (TLE) was separated and purified from the venom of a northeast Chinese snake Agkistrodon halys ussuriensis Emelianov. Experiments were performed in rats to determine the pharmacokinetic parameters following an intravenous (i.v.) or a subcutaneous (s.c.) injection of the thrombin-like enzyme. The plasma levels of TLE were estimated by enzyme-linked immunosorbent assay. The method exhibited high reproducibility and accuracy in correlating optical densities with TLE concentrations (0.2–30 ng ml⁻¹, r=0.99). The plasma concentration-time course after i.v. administration of 50 μg kg⁻¹ TLE was well fitted by a two-compartment open model. The half-life of the -phase was 18.0±3.2 min, and that of the β-phase 3.9±0.7 h. The apparent volume of distribution was 1.8±0.5 l kg⁻¹, and clearance was 5.4±0.5 ml min⁻¹ kg⁻¹. When the TLE was injected s.c. at a dose of 0.75 mg kg⁻¹, the changes in plasma concentration were best described by a two-compartment model with a first-order absorption. The maximal plasma level of 51±2.7 ng ml⁻¹ was reached at 5.2±0.5 h. The absorption rate constant was 0.3±0.03 h⁻¹. The area under the plasma concentration-time curve (AUC) was 2.8±0.8 μg h⁻¹ ml⁻¹.     

江浙蝮蛇毒镇痛组分对吗啡依赖大鼠尾状核神经肽的调控作用

目的:研究江浙蝮蛇毒镇痛C4组分对大鼠尾状核中神经肽水平的调控作用.方法:应用微透析技术,探针定位于大鼠尾状体,以人工脑脊液透析,HPLC检测亮氨酸脑啡肽、β-内啡肽和P物质的含量,动态监测其变化.结果:在吗啡依赖大鼠给予C4组分后,尾状核亮氨酸脑啡肽含量显著增高,为可乐定组的1.5倍,并持续作用8h以上,而β-内啡肽和P物质含量变化较小.结论:C4组分主要作用于亮氨酸脑啡肽,通过提高其含量发挥镇痛作用.     

白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的聚乙二醇修饰

为提高纤溶酶的临床适用性，采用4种针对氨基修饰的mPEG试剂——mPEG—SPA5K、mPEG—SMB5K、mPEG—ButyrALD5K和mPEG2-NHS40K修饰蛇毒纤溶酶，以获得高比例的单修饰产物和较高的酶活性保留率。优化修饰反应条件，用Superdex75凝胶过滤色谱法分离纯化修饰产物。最终确定mPEG—SPA5K为最适宜的修饰剂。产物经sDs—PAGE和MALDI-TOF-MS法检测为单修饰，修饰产物酶活性收率为67．3％，修饰产物的热稳定性提高，免疫原性显著下降。     

Purification and characterization of antitoxic proteins from the serum of Agkistrodon halys Pallas.

In this study, the authors report the purification and characterization of antitoxic proteins from the serum of Agkistrodon halys Pallas. Two antitoxic proteins have been successfully isolated by the methods of (NH4)(2)SO(4) fractional precipitation, chromatography and preparative discontinuous polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). We have measured their molecular weights by Sephadex G-150 chromatography and 0.1% SDS-Tris-HCl discontinue PAGE respectively. Antitoxin I was about 138,000+/-40 Da and antitoxin II was about 76,000+/-40 Da, they are all single-chain peptides. We have measured their capacity to neutralize the toxicity of agkistrodotoxin (ATX), and their capacity to inhibit the PLA(2) activity of ATX. The results showed that antitoxin I could increase LD(50) of ATX from 0.25+/-0.05 to 0.445+/-0.13 mg/kg, decrease its PLA(2) activity from 2.36 to 1.72 microm/mg min, and antitoxin II could increase LD(50) of ATX from 0.25+/-0.05 to 0.56+/-0.12 mg/kg, decrease Phospholipase A(2) (PLA(2)) activity from 2.36 to 1.2 microm/mg min. When the natural antitoxins were mixed with different amounts of ATX and inoculated intraperitonially into eight mice, it was found that 0.5 mg antitoxin I could neutralize the toxicity of 0.4 mg ATX and 0.5 mg antitoxin II could neutralize the toxicity of 0.5 mg ATX completely. These antitoxic proteins could neutralize the toxicity of ATX completely and inhibit ATX's PLA(2) activity partially.