应用复合探针实时荧光定量RT-PCR技术高灵敏度检测呼吸道合胞病毒

摘要:目的　建立一种运用复合探针实时荧光定量PCR技术检测呼吸道合胞病毒（RSV）的方法。方法　根据复合探针技术原理,以其F蛋白基因作为基因靶序列建立检测方法,对引物与探针进行优化与筛选;对检测的灵敏度、特异性、精密度等进行评价,并通过对259例临床标本的检测对本方法的检测效果进行评估。结果　本方法的检测灵敏度RSV A型可达2.0×102 PFU /ml、RSV B型最低可达5.0×102 PFU /ml;与非呼吸道合胞病毒等常见呼吸道病毒均无交叉反应;批间批内变异系数均小于5%;与临床咽拭子标本的检测结果对比表明,该方法与临床诊断结果的符合率为99.23%。结论　该方法建立的荧光定量RT-PCR检测技术能够快速、准确、特异、高灵敏度的对呼吸道合胞病毒核酸进行定性分析,为呼吸道合胞病毒的临床检测提供了新的、更为有效的检测方法。     

微流控实时荧光定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测两种出血热病毒的比较

目的 比较微流控实时荧光定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测两种出血热病毒的情况。方法 以汉城病毒(Seoul virus, SEOV)和汗滩病毒(Hantaan virus, HTNV)作为靶序列设计特异性的引物探针,制备体外转录RNA参考品,对其灵敏性进行评价,通过SEOV和HTNV的假病毒或者病毒培养物制备模拟阳性样本,分别通过微流控和荧光定量RT-PCR检测。结果 SEOV、HTNV体外转录RNA参考品拷贝数浓度分别是2.54×10¹²、1.26×10¹² copies/μl。SEOV、HTNV微流控实时荧光定量RT-PCR检测最低检出限值分别是119.5、123.8 copies/PCR,实时荧光定量RT-PCR检测分别是120.4、128.9 copies/PCR。两种方法检测不同浓度SEOV、HTNV的变异系数均<2%,检出率均为100%。结论 微流控实时荧光定量RT-PCR检测具有很好的特异性、稳定性和灵敏性,适用于现场实验室检测。     

马尔堡病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的建立马尔堡病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法人工合成马尔堡病毒特异性核酸序列作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR引物、探针并构建反应体系,对反应条件进行优化,验证该方法的特异性、灵敏度。结果建立的马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测方法对马尔堡病毒核酸检测有高度特异性,与1型～4型登革病毒、日本脑炎病毒和基孔肯雅病毒均无交叉反应,检测灵敏度为102拷贝/反应。结论该方法灵敏度高、特异性强,适用于对马尔堡病毒的快速检验。     

病毒分离、RT-PCR和实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒71型比较

评价病毒分离培养、RT-PCR及实时荧光RT-PCR法对于肠道病毒7l型的检测效果。方法分别用疖毒分离培养、RT-PCR、实时荧光RT-PCR方法对2009年龙岩市手足口病哨点监测医院送检的153份手足口病患者咽捌子样本进行EV71检测，并对检测结果进行配对卡方检验。结果3种方法总体符合率为81．0％，3种检测方法对样本呻EV71阳性检出率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论病毒分离、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法均适用于EV71的检测，可以作为EV71的日常临床诊断方法。     

实时荧光PCR和RT-PCR方法检测甲型流感病毒的比较

目的比较实时荧光PCR检测(FQ-PCR)与RT-PCR在鉴定甲型流感病毒中的优劣,建立能快速简便、特异地从临床标本中检测并鉴定流感病毒的新方法。方法对200份临床采集的咽拭子样本进行FQ-PCR与RT-PCR检测,综合比较2种监测方法之间的差异。结果 FQ-PCR检测200份临床咽拭标本,96份甲型阳性,阳性率为48.0%;从RNA提取到检测结果仅需3～3.5 h。RT-PCR检测200份临床咽拭标本,69份阳性,阳性率为34.5%;从RNA提取到检测结果约需8 h。结论 FQ-PCR方法快速、特异、灵敏,在甲型流感病毒检测中具有较大的应用价值。     

Ⅰ型脊髓灰质炎野病毒实时荧光RT-PCR快速检测方法的评价

目的 评价和探讨Ⅰ型脊髓灰质炎(脊灰)野病毒快速检测策略.方法 采集671名来自脊灰野病毒流行疫区的在京学生粪便标本,采用一组实时荧光RT-PCR代替标准方法分别进行肠道病毒通用型检测、脊灰病毒分型检测、Ⅰ型脊灰疫苗株和野毒株鉴别检测.并利用Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰病毒标准株(Sabin株)和Ⅰ型野毒株对实时荧光RT-PCR和标准方法的灵敏度进行比较和评价.结果 (1)新脊灰病毒检测流程(肠道病毒通用型检测+脊灰病毒分型检测+脊灰野毒鉴别检测)检出非脊灰肠道病毒33例;脊灰病毒疫苗株16例,其中Ⅰ型5例、Ⅱ型1例、Ⅲ型3例、Ⅰ+Ⅱ型1例、Ⅰ+Ⅲ型4例、Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ型2例;脊灰病毒Ⅰ型野毒株3例.(2)3种实时荧光RT-PCR检测脊灰病毒比标准方法敏感1～ 100倍.其中肠道通用型检测和脊灰病毒分型检测2种方法对Ⅱ型脊灰病毒疫苗株的检测,比标准方法敏感100倍;脊灰病毒分型检测能准确区分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰疫苗株,脊灰野毒株鉴别检测对Ⅰ型疫苗株的检测比标准方法敏感10倍;3种实时荧光RT-PCR均能有效检测出Ⅰ型脊灰野毒株,比标准方法敏感10倍.结论 新的脊灰病毒检测流程,可大幅缩短检测时间,提高检测通量,且灵敏度高于标准方法,适合于脊灰应急检测应对突发疫情.     

Ⅰ型脊髓灰质炎野病毒实时荧光RT-PCR快速检测方法的评价

目的 评价和探讨Ⅰ型脊髓灰质炎(脊灰)野病毒快速检测策略.方法 采集671名来自脊灰野病毒流行疫区的在京学生粪便标本,采用一组实时荧光RT-PCR代替标准方法分别进行肠道病毒通用型检测、脊灰病毒分型检测、Ⅰ型脊灰疫苗株和野毒株鉴别检测.并利用Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰病毒标准株(Sabin株)和Ⅰ型野毒株对实时荧光RT-PCR和标准方法的灵敏度进行比较和评价.结果 (1)新脊灰病毒检测流程(肠道病毒通用型检测+脊灰病毒分型检测+脊灰野毒鉴别检测)检出非脊灰肠道病毒33例;脊灰病毒疫苗株16例,其中Ⅰ型5例、Ⅱ型1例、Ⅲ型3例、Ⅰ+Ⅱ型1例、Ⅰ+Ⅲ型4例、Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ型2例;脊灰病毒Ⅰ型野毒株3例.(2)3种实时荧光RT-PCR检测脊灰病毒比标准方法敏感1～ 100倍.其中肠道通用型检测和脊灰病毒分型检测2种方法对Ⅱ型脊灰病毒疫苗株的检测,比标准方法敏感100倍;脊灰病毒分型检测能准确区分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰疫苗株,脊灰野毒株鉴别检测对Ⅰ型疫苗株的检测比标准方法敏感10倍;3种实时荧光RT-PCR均能有效检测出Ⅰ型脊灰野毒株,比标准方法敏感10倍.结论 新的脊灰病毒检测流程,可大幅缩短检测时间,提高检测通量,且灵敏度高于标准方法,适合于脊灰应急检测应对突发疫情.     

新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的:建立新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法:分析新疆出血热病毒核酸S片段序列的保守性,设计新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR引物和探针。以体外转录后的RNA作为阳性对照模板,摸索出实时荧光RT-PCR检测的最佳引物浓度、探针浓度和反应体系条件,并进行灵敏度和特异性分析。结果:建立的新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:正向引物CCHFV-FP终浓度250 nM,反向引物CCHFV-RP终浓度500 nM,探针CCHFV-Probe终浓度500 nM;扩增程序为:50℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,57℃20 s 45次循环。该方法最低检测限约为2 copies病毒/反应,与森林脑炎病毒和汉坦病毒无交叉反应。结论:该方法灵敏度高、特异性强,适用于新疆出血热病毒的快速检测。     

实时荧光RT-PCR技术在黄热病快速检测中的应用

[目的]建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法并用于口岸黄热病的快速检测. [方法]体外转录黄热病病毒5-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索最佳反应体系条件并用于黄热病疫苗和入境发热患者标本的检测.[结果]建立的黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:2xRT-PCR缓冲液10 μl,正向引物5UTR-FP终浓度750 nM,反向引物5UTR-RP终浓度750 nM,探针5UTR-Probe终浓度500 nM,25xRT-PCR Enzyme Mix 0.8μl,RNA 5μl,用DEPC H2O补足到反应总体积20μl;Roche lightcycler仪器适用的扩增程序为:45℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,56℃10 s(single),72℃15 s,45次循环.该方法最低检测限约为20copies病毒/反应,与登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒无交叉反应.应用该方法对黄热病疫苗、媒介蚊虫和入境发热患者的血清标本进行检测,结果为黄热病疫苗核酸阳性,其他标本为阴性.[结论]该实时荧光RT-PER方法灵敏度高,特异性强,适用于黄热病病毒的快速检验,防止该病在国境口岸的传入.     

实时荧光RT-PCR方法检测水及水产品中霍乱弧菌

〔目的〕探索实时荧光RT-PCR方法在霍乱弧菌检验方面是否比传统方法有优势。〔方法〕用深圳太太基因工程有限公司提供的霍乱弧菌实时荧光RT-PCR试剂盒方法进行检验。〔结果〕用实时荧光RT-PCR方法从样品的2次增菌液中检出2个样品为霍乱弧菌通用型阳性。用传统的微生物生理、生化培养法,从上述2个样品中分离出3株菌株。根据血清分型、API鉴定和荧光RT-PCR,确认所分离的菌株有2株是国际检疫传染病的病原—O1群霍乱弧菌;1株是非O1/非O139群霍乱弧菌。〔结论〕实时荧光RT-PCR方法在霍乱弧菌的检验方面具有快速、灵敏、特异性强等优势,有利于提高霍乱弧菌的检出率。     

用RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测诺沃克病毒的比较分析

目的:研究用不同方法检测诺沃克病毒核酸的阳性率关系,为进一步完善诺沃克病毒核酸的实验室检测提供依据。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及实时荧光逆转录聚合酶链反应(real-tim e RT-PCR)两种方法,对124例腹泻标本进行诺沃克病毒核酸的检测。结果:124份标本中,RT-PCR检出诺沃克病毒阳性31例,阳性率为25%;实时RT-PCR检出阳性37例,阳性率为29.84%;两种方法均阳性的28例,均阴性的84例,符合率为90%;不同性别阳性率无显著性差异;采用实时RT-PCR检测诺沃克病毒,敏感性较RT-PCR高,但两种方法的阳性率无统计学差异。对于强阳性样本(Ct值在20以内或电泳结果特异性条带很亮),两种方法检出率均为100%;对于弱阳性样本,则大部份标本实时RT-PCR检出阳性而RT-PCR未能检出,少部份标本RT-PCR检出阳性而荧光RT-PCR未能检出。结论:对于诺沃克病毒的实验室检测方法,首选实时RT-PCR;在可能的情况下,应该RT-PCR和实时RT-PCR两种方法联用进行检测,以避免发生弱阳性样本漏诊的情况。     

肠道病毒VP1基因定型巢式RT-PCR反应体系建立及评价

目的建立一种快速、灵敏、特异的肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法。方法根据Gen Bank发表的肠道病毒全基因组序列,收集国内外文献,将文献中用于测序分型的引物进行总结分析,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测肠道病毒基因分型的巢式RT-PCR方法。将200株肠道病毒通用阳性,EV71、CA16阴性的临床标本及阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒用该方法进行巢式RT-PCR扩增,随机选择30例PCR产物进行测序,明确本区肠道病毒流行基因型。结果 200份临床病例样本巢式RT-PCR扩增,124例有准确PCR扩增条带,阳性率为62%;阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒均未扩增出条带;23例测序成功,7例比对失败,其中检出16份CA6阳性,阳性率为69.5%,6份CA12阳性,阳性率为26.1%,1份CA10阳性,阳性率为4.3%。结论肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度;本院就诊患儿肠道病毒基因型主要以CA6和CA12型为主。     

流行性腮腺炎病毒荧光定量逆转录-聚合酶链反应快速检测方法的建立

目的建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),用于检测流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒(MuV)核酸。方法针对MuV血凝素(H)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、灵敏度与准确性;并通过体外克隆技术建立MuV基因拷贝数定量分析模型。结果引物与探针的优化浓度分别为880mmol/L和280mmol/L,具有良好的保守性和特异性,与其它呼吸道病毒均无交叉反应;方法检测灵敏度为10拷贝/反应,相当于0.01TCID50,标准曲线线性范围为107~10拷贝/反应;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。结论TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,为MuV的早期快速检测提供了一种新的检测技术。     

一步法RT-PCR检测SARS冠状病毒技术研究

[目的]建立一步法RT—PCR方法，对非典型肺炎疑似病例进行SARS相关冠状病毒检测。[方法]参照WHO公布的PCR检测SARS相关冠状病毒的引物序列，我们合成了4对引物，利用RT—PCR技术建立一步法检测SARS相关冠状病毒的方法。[结果]利用该方法对武汉市非典型肺炎疑似病例进行SARS相关冠状病毒检测，其中样品W20用4对引物检测均在相应的位置出现了DNA条带，样品W1只有BNIin—s/as引物出现预期产物。同时我们将W20的BNIin—s/as引物扩增的109bp产物进行了序列测定，结果显示该片段序列与其他地区和国家的SARS冠状病毒的同源性极高，均在99．5％以上。[结论]一步法RT—PCR扩增产物是SARS冠状病毒基因片段，我们建立的一步法RT—PCR是一种可靠的检测方法。     

RT-PCR快速检测腮腺炎病毒

目的：建立腮腺炎病毒的核酸快速诊断技术。方法：在腮腺炎病毒核蛋白基因（NP）的保守区域设计一对半引物，采用逆转录聚合酶链（RT-PCR）和半巢式PCR方法扩增腮腺炎病毒特异性核酸片段。结果：该方法能特异性地扩增腮腺炎病毒357bp和232bp的核酸片段，而对麻疹、风疹和流感病毒无交叉反应。检测腮腺炎病毒的灵敏度，1次PCR可检测出10CCID50，2次PCR反应可达0.1CCID50。采用该方法从流行性腮腺炎患含漱液标本中能直接检出腮腺炎病毒核酸条带。结论：该方法能特异、敏感地检测临床标本中腮腺炎病毒，是快速诊断腮腺炎病毒感染的理想方法。     

衢州市2009年流感病毒荧光定量RT-PCR检测结果分析

目的了解衢州市流感病毒的感染情况,为制定预防和控制流感策略提供依据。方法采用荧光定量RT-PCR方法,对衢州市692例流感标本进行检测。结果共检测出甲1型流感25份,阳性率3.61%;甲3型流感117份,阳性率16.91%;乙型流感18份,阳性率2.6%;甲型H1N1流感242份,阳性率34.97%。结论衢州市流感形势不容乐观,需要有关部门加大对流感的防控力度。     

Sequence and structural diversity of transferrin receptors in Gram-negative porcine pathogens

Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, and Haemophilus parasuis are bacterial pathogens from the upper respiratory tract that are responsible for a substantial burden of porcine disease. Although reduction of disease has been accomplished by intensive management practices, immunization remains an important strategy for disease prevention, particularly when intensive management practices are not feasible or suitable. An attractive target for vaccine development is the surface receptor involved in acquiring iron from host transferrin, since it is common to all three pathogenic species and has been shown to be essential for survival and disease causation. It has also recently been demonstrated that an engineered antigen derived from the lipoprotein component of the receptor, transferrin-binding protein B (TbpB), was more effective at preventing infection by H. parasuis than a commercial vaccine product. This study was initiated to explore the genetic and immunogenic diversity of the transferrin receptor system from these species.Nucleic acid sequences were obtained from a geographically and temporally diverse collection of isolates, consisting of 41 A. pleuropneumoniae strains, 30 H. parasuis strains, and 2 A. suis strains. Phylogenetic analyses demonstrated that the receptor protein sequences cluster independently of species, suggesting that there is genetic exchange between these species such that receptor-based vaccines should logically target all three species.To evaluate the cross-reactive response of TbpB-derived antigens, pigs were immunized with the intact TbpB, the TbpB N-lobe and the TbpB C-lobe from A. pleuropneumoniae strain H49 and the resulting sera were tested against a representative panel of TbpBs; demonstrating that the C-lobe induces a broadly cross-reactive response.Overall our results indicate that there is a common reservoir for transferrin receptor antigenic variation amongst these pathogens. While this could present a challenge to future vaccine development, our results suggest a rationally designed TbpB-based vaccine may provide protection against all three pathogens.     

荧光定量RT-PCR定量检测诺如病毒方法的建立及其评价

目的:建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒GⅠ、GⅡ的方法,以用于患者标本的检测、分型及绝对定量。方法:经过优化筛选出最佳反应体系及反应条件,建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒的方法;制作两种不同型号的荧光定量PCR仪的绝对定量标准曲线,并从灵敏度、特异性、重复性、对患者标本检测能力等方面对建立的方法进行综合评价。结果:该方法在两种不同型号的仪器上对108~101copy/μl范围内的病毒,具有良好的线性关系,最低灵敏度为101copy/μl。与容易引起腹泻症状的轮状病毒、腺病毒、星状病毒、肠道病毒均无交叉反应;诺如病毒GⅠ、GⅡ两种常见感染人类的亚型之间无交叉反应。批内及批间重复性实验的标准差在0.10~0.59、变异系数在0.43%~2.84%之间,显示该方法重复性较好。用该方法共检测腹泻患者粪便标本181份,其中33份诺如病毒阳性,随机抽取10份阳性标本测序分析,结果证实均为诺如病毒。结论:本研究建立的诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法,灵敏度、特异性、重复性、对患者标本的检测能力等均显示较好的结果,且能快速区分GⅠ、GⅡ两种感染人类的重要亚型,在诺如病毒的快速检测中有着实际推广意义。     

呼吸道感染病原菌分布及耐药性调查

目的：了解我院呼吸道感染病原菌谱及耐药性。方法：对我院2006年1月～9月临床送检的痰及咽拭子进行细菌培养,采用美国德灵公司Auto Scan-4微生物分析系统进行细菌鉴定和药物敏感试验;采用ATB Fungus进行真菌药物敏感试验。按NCCLS标准判定敏感菌株。结果：共分离到病原菌119株,革兰阴性杆菌占68.07%,真菌占26.05%,革兰阳性球菌仅占5.88%。革兰阴性杆菌以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌为主,分别占病原菌总数的36.13%、7.56%、6.72%;真菌以白色假丝酵母菌为主,占真菌总数的54.84%。药敏结果提示,铜绿假单胞菌、肠杆菌属、沙雷氏菌属等均出现多重高比例耐药,真菌也对唑类药物出现强耐药性。结论：最近呼吸道感染病原菌以革兰阴性杆菌和真菌为主,而且出现多重耐药。