槲皮素对成年大鼠局灶性脑缺血后侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖的影响

摘要：目的观察槲皮素对成年大鼠局灶性脑缺血后侧脑室室管膜下区（SVZ）细胞增殖的影响。方法线栓法制作大鼠右
侧大脑中动脉阻塞模型,术后6 h腹腔注射槲皮素（50 mg/kg,1次/3 d）,术后4 h腹腔注射BrdU（50 mg/kg,1次/d）,分别于
缺血第7、14、21天采用免疫荧光染色观察侧脑室SVZ BrdU阳性细胞数。结果脑缺血第7天,缺血侧SVZ BrdU阳性细
胞较假手术组明显增多,第14天达峰值,第21天减少（P<0.01）。槲皮素组第7天时,缺血侧SVZ BrdU阳性细胞亦明显增
多,并随着缺血时间延长明显增加;与缺血组比较,槲皮素组7、14 和21 d 缺血侧SVZ BrdU阳性细胞数均显著增加（P<
0.01）,至21 d仍保持高水平。结论槲皮素可维持成年大鼠局灶性脑缺血后侧脑室SVZ的细胞增殖在较高水平。     

三碘甲状腺原氨酸促进2VO大鼠侧脑室下区的神经再生

目的：探讨三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine,T3）对双侧颈总动脉结扎（2-vessel occlusion,2VO）大鼠侧脑室下区（subventri（sular zone．svz）神经再生的影响。方法：雄性SD大鼠完全随机分为假手术组,2VO组和缺血后T3干预组,每组8只,采用双侧颈总动脉永久性结扎术制备慢性脑缺血模型,术后各组大鼠连续7d腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2′-deoxyuridine,BrdU）标记增殖细胞。各组5只分别于第7、14天灌注取脑组织,采用BrdU与Doublecortin（DCX）免疫荧光双染法标记新生神经元;各组3只取新鲜脑组织分离SVZ,采用免疫印迹法检测DCX蛋白的表达水平。结果：T3作用7d后,T3干预组BrdU阳性细胞较假手术组显著增多（P=0．002）,与2VO组差异无统计学意义（P=0．084）;且BrdU／DCX阳性细胞较2VO组和假手术组均显著增多（均P〈0．05）。T3作用14d后,T3干预组BrdU阳性细胞和BrdU／DCX阳性细胞均显著多于2VO组和假手术组（P〈0．01）。与2VO7d组相比,2VO14d组BrdU阳性细胞和BrdU／DCX阳性细胞显著减少（P〈0．05）。免疫印迹法也显示T3组DCX蛋白的表达水平较多、结论：T3可促进慢性脑缺血大鼠侧脑室下区新生神经元的增殖,提高存活率,促进神经再生。     

大鼠脑出血后行为学改变和室管膜下区细胞增殖规律

目的：研究成年大鼠脑出血（intracerebral hemorrhage,ICH）后行为学改变和室管膜下区（subventricular zone,SVZ）神经前体细胞增殖的关系。方法：40只雄性SD大鼠随机分为行为学检测组 (n=19)和Bromodeoxyuridine (Brdu)免疫组织化学染色组(n= 21)。立体定向注射Ⅶ型胶原酶建立大鼠纹状体ICH模型。脉冲法腹腔注射Brdu标记增殖细胞。在ICH后第2,7,14及28天处死大鼠,分别行行为学检测和Brdu免疫组织化学染色,行为学评分采用前肢放置实验、Berderson评分法及角落转向实验;对SVZ Brdu免疫阳性细胞作细胞计数。结果：ICH后第2天大鼠出现严重的神经功能障碍,其神经功能在4周内逐渐恢复;大鼠ICH后第2天双侧SVZ Brdu阳性细胞数开始增加,7 d时达高峰,14 d仍可见较多的增殖细胞,28 d时Brdu阳性细胞数降至对照水平。结论：大鼠ICH后神经功能与SVZ细胞增殖存在时间上的相关性,提示SVZ细胞可能参与ICH后组织修复过程。     

3日龄SD大鼠慢性脑缺血后脑室下区细胞的凋亡

目的观察3日龄SD大鼠慢性缺血脑损伤后脑室下区细胞凋亡情况,了解早产儿缺血后脑进一步损伤的发病机理,为干预治疗提供时间窗实验依据。方法3日龄新生SD大鼠随机分为对照组和实验组。实验组结扎双侧颈总动脉,造成未成熟鼠慢性脑缺血脑损伤模型;对照组双侧颈总动脉不结扎,组织切片HE染色定位,采用TUNEL法分别观察脑室下区背侧、前端细胞凋亡变化。结果脑室下区背侧、前端凋亡细胞分别计数发现在缺血48、72h和1周后较对照组增多(P<0.01),于72h时间点两组差异最为显著(背侧:实验组87.0±11.5,对照组60.9±7.1;前端(冠状位):实验组86.1±5.5,对照组56.4±5.6;前端(矢状位):实验组69.1±3.5,对照组44.0±2.3,P<0.01),损伤后2周两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论3日龄SD大鼠慢性脑缺血后脑白质损伤外,神经生发区之一:脑室下区细胞对缺氧缺血敏感,易发生凋亡,其可能为早产儿脑白质进一步损伤的机制之一,同时此模型提示慢性缺血缺氧可致神经元再生不足,提示缺血后48~72h可能为防止脑室下区损伤的时间窗。     

局灶性脑缺血后室管膜 /室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化为神经元和星形胶质细胞

目的 研究局灶性脑缺血后室管膜/室下区细胞的迁移分化,揭示梗塞区周围新生细胞的来源。方法 大脑中动脉阻塞前,将10μl0.2%的荧光染料DiI注射于体质量250~350g的雄性SD大鼠侧脑室以预标记室管膜/室下区细胞。脑缺血后,采用累积式的BrdU标记方法标记新生细胞并通过双重免疫荧光染色确定细胞分化。标记的细胞通过激光共聚焦显微镜观察。结果 在非缺血对照大鼠,DiI标记细胞定居于室管膜/室下区。局灶性脑缺血后,DiI标记细胞出现于胼胝体,邻近的纹状体和皮质。此外,缺血14d后,梗塞区周围纹状体和皮质内可见一些DiI/BrdU/GFAP或DiI/BrdU/NeuN三重标记阳性细胞。结论 局灶性脑缺血后,室管膜/室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化成神经元和星形胶质细胞,这一发现对于理解成体神经干细胞的起源和开发促进脑损伤后内源性神经发生的新措施具有重要意义。     

局灶性脑缺血后室管膜/室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化为神经元和星形胶质细胞

目的研究局灶性脑缺血后室管膜/室下区细胞的迁移分化,揭示梗塞区周围新生细胞的来源.方法大脑中动脉阻塞前,将10μl 0.2%的荧光染料DiI注射于体质量250～350 g的雄性SD大鼠侧脑室以预标记室管膜/室下区细胞.脑缺血后,采用累积式的BrdU标记方法标记新生细胞并通过双重免疫荧光染色确定细胞分化.标记的细胞通过激光共聚焦显微镜观察.结果在非缺血对照大鼠,DiI标记细胞定居于室管膜/室下区.局灶性脑缺血后,DiI标记细胞出现于胼胝体,邻近的纹状体和皮质.此外,缺血14 d后,梗塞区周围纹状体和皮质内可见一些DiI/BrdU/GFAP或DiI/BrdU/NeuN三重标记阳性细胞.结论局灶性脑缺血后,室管膜/室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化成神经元和星形胶质细胞,这一发现对于理解成体神经干细胞的起源和开发促进脑损伤后内源性神经发生的新措施具有重要意义.     

大鼠创伤性颅脑损伤后脑室下区内源性神经干细胞的增殖与分化

目的探讨创伤性脑损伤后脑室下区（SVZ）神经干细胞（NSCs）的增殖分化的时程变化。方法采用随机数字表法将大鼠 分为3组,对照组不做任何处理,假手术组仅切开头皮和颅骨开窗,实验组采用Feeney氏法造成颅脑损伤（TBI）。选用Nestin与 BrdU两种细胞标志物及神经元特异标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）及胶质细胞标志物GFAP,采用免疫荧光化学方法对3 组脑组织标本分别行双标蛋白抗体免疫荧光染色,检测TBI 后SVZ 内源性NSCs 的增殖、分化变化。结果TBI 后,伤侧 SVZNestin/NSE 、Nestin/GFAP、BrdU/NSE、BrdU/GFAP标记阳性细胞均明显增多,伤后第1天开始升高,第3天达峰值,第14天 恢复正常,实验组4个时间点间及实验组与对照组对应时间点间的比较差异均有显著性意义,其中以Nestin/GFAP标记的增殖分 裂阳性细胞升高最显著。结论TBI后,动员了伤侧SVZ中的NSCs,诱导该区内源性NSCs的增殖分化,提示SVZ是NSCs增殖 分化的重要的生发中心之一。     

成年大鼠脑出血后室管膜下区、血肿周围神经前体细胞增殖研究

目的 研究成年大鼠脑出血后室管膜下区、血肿周围组织神经前体细胞增殖的规律.方法 立体定向注射胶原酶建立大鼠纹状体脑出血模型.脉冲法或连续法腹腔注射Brdu标记增殖细胞.在脑出血后第2、7、14及28天处死大鼠,行Brdu免疫组化染色.对室管膜下区、血肿周围的Brdu免疫阳性细胞作细胞记数.结果 脉冲法Brdu标记.大鼠脑出血后第2天双侧室管膜下区和血肿周围Brdu阳性细胞数增加,第7天时达高峰,第14天仍可见较多的增殖细胞;连续法Brdu标记.在脑出血后第14天时室管膜下区和血肿周围可见较多Brdu阳性细胞,第28天时室管膜下区Brdu阳性细胞数降至对照水平.但血肿周围仍可见较多的Brdu阳性细胞.结论 成年大鼠脑出血后可诱导双侧室管膜下区和血肿周围神经前体细胞增殖增加;室管膜下区增殖细胞可能向血肿周围迁移.     

青蒿琥酯通过PI3K-Akt通路促进大鼠室管膜下区神经干细胞增殖的体外研究

目的 探讨青蒿琥酯(artesunate,ART)对室管膜下区(subventricular zone,SVZ)神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的影响.方法 不同浓度的ART(400 nmol/L、800 nmol/L、1.6 μmol/L、3.2 μmol/L)作用于NSCs 24 h后,采用CCK-8法检测其对NSCs增殖的影响.促增殖作用明显的800 nmol/L ART组加入10 μmol/L PI3K-Akt通路阻断剂(LY294002),采用CCK-8法检测该通路对NSCs增殖的影响;分别设置空白对照组、LY294002组、800 nmol/L ART组、800 nmol/L ART+ LY294002组,待细胞培养24h时,行Ki-67免疫荧光染色观察ART对NSCs增殖的影响及PI3K-Akt通路在其中的作用,同时采用Western blot检测各组Nestin、Akt及p-Akt蛋白的表达水平.结果 ①CCK-8法检测结果显示800 nmol/L ART组在波长450 nm处的光密度值较空白对照组明显升高,在加入LY294002后,其光密度值明显下降(P＜0.05),与空白对照组水平相当;②Ki-67免疫荧光染色结果提示800 nmol/L ART可促进NSCs增殖,LY294002可抑制这一作用;③Western blot检测结果显示:神经干细胞表面标志蛋白Nestin及p-Akt蛋白表达水平在800 nmol/L ART组明显上调,在加入LY294002后两者表达水平均下调(P＜0.05).结论 ART可在体外促进SVZ区NSCs的增殖,其机制与PI3K-Akt信号通路相关.     

成年小鼠脑室下区神经干细胞培养与鉴定体系的建立

目的 建立系统的成年小鼠脑室下区神经干细胞分离、培养及鉴定体系.方法 用无血清方法分离培养成年小鼠脑室下区来源的神经干细胞;用克隆培养、BrdU整合的方法检验培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学方法检测Brdu、神经干细胞标记物nestin和SOX2,分化的细胞标记物Tuj1、GFAP、NG2.用Western boltting和RT-PCR方法进一步检测神经干细胞标记物nestin和SOX2的表达.结果 从成年小鼠脑室下区分离培养出具有自我更新、增殖的神经球,构成神经球的细胞nestin和SOX2呈阳性,它们分化后产生Tujl阳性的神经元、GFAP阳性的星型胶质细胞、NG2阳性的少突胶质细胞.结论 建立了简单、稳定的培养成年小鼠脑室下区神经干细胞方法.     

成年大鼠脑内具有神经生发功能的脑室下区细胞核三维数字化形态观察

目的 研究成年大鼠脑内具有神经生发功能的侧脑室外侧壁脑室下区（subventricular zone, SVZ）和室管膜（ependymal layer, EL）各种细胞的形态学特征及其空间排布规律.方法 采用半薄切片染色技术和计算机三维重建技术,利用3D Slicer工具软件构建SVZ-EL区各细胞核三维表面模型,并建立相应的数据库.结果 ①在EL,主要是体积较大且呈球形的成熟室管膜细胞核;另有体积更大的球形细胞核贴近室管膜细胞深方;此外,还有体积较小而形状不规则的细胞核散在镶嵌于室管膜细胞之间.②在SVZ,可见特异性的同型细胞核聚集现象,此类细胞核体积较大且都呈椭圆体,具有迁移中成神经细胞核特征,故称之为成神经样细胞核.它们有的邻近EL、有的邻近纹状体,其周围的细胞核分属不同类型;另有散在分布的大而似球体的未分化细胞特征性细胞核,它们与聚集的成神经样细胞核间无特定空间位置关系.此外,还有大量散在分布的中、小型不规则细胞核.结论 在SVZ-EL区含有不同类型细胞核,其中成神经样细胞核呈聚集分布,但其周围没有特定结构包裹现象.此外,本研究实现了成年哺乳动物脑内神经生发区SVZ细胞核形态及其空间位置的数字化,可作为进一步研究SVZ神经生发的基础.     

川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤脑室下区细胞增殖的影响

目的:观察川芎嗪(ligustrazine)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤侧脑室室下区(subventricular zone,SVZ)细胞增殖的影响.方法:将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为正常组、假手术组、川芎嗪治疗组和对照组.采用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型,5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记增殖细胞并用免疫组织化学方法检测BrdU阳性细胞并对SVZ区BrdU阳性细胞计数.采用Western blot检测神经元型一氧化氮合酶(neuro nitric oxide synthase,nNOS)的表达,并测定吸光度值.结果:正常组、假手术组SVZ有少量BrdU阳性细胞,川芎嗪治疗组、对照组SVZ区BrdU阳性细胞再灌注后1 d开始出现,逐渐增加,7 d达到峰值,持续至14 d,在21 d时下降.川芎嗪治疗1 d和3 d组BrdU阳性细胞明显多于对照组(P＜0.01).在缺血对侧SVZ也有细胞增殖,川芎嗪治疗组、对照组在各时间点的变化与缺血侧相似.川芎嗪治疗1 d,3 d组nNOS表达量明显低于对照组(P＜0.05),川芎嗪治疗7 d组与3 d组相比nNOS表达量增加,但与缺血对照组相比无统计学差异.结论:川芎嗪促进局灶性脑缺血再灌注损伤后SVZ区的细胞增殖,其机制可能与nNOS的表达下降有关.     

葛根素对去卵巢雌性大鼠脑内BDNF表达和神经干细胞增殖的影响

目的:观察葛根素对去卵巢雌性大鼠脑内脑源性神经营养因子(BDNF)表达和神经干细胞增殖的影响。方法:将60只去卵巢雌性大鼠随机分为三组:空白对照组(腹腔注射生理盐水)、阳性对照组(腹腔注射17β雌二醇)、药物干预组(腹腔注射葛根素注射液)。4周后处死大鼠,比较各组大鼠脑内双侧脑室管膜下区(SVZ)BDNF免疫组化阳性细胞数、BrdU阳性细胞数的差别。结果:雌激素组和葛根素组SVZ区BDNF免疫组化阳性细胞数、BrdU阳性细胞数较生理盐水组明显增多。结论:葛根素能增加去卵巢大鼠(SVZ)区神经干细胞的增值,机制可能是依靠其雌激素样作用促进脑源性神经营养因子达到。     

外加直流电场对脑卒中大鼠侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖与迁移的影响

目的观察外加直流电场对脑卒中大鼠侧脑室室管膜下区(SVZ)神经干细胞增殖与迁移的影响,为将直流电场刺激法用于脑修复治疗提供理论依据。方法将60只Sprague Dawley雄性大鼠随机分为正常对照组、假手术组、假手术+直流电场组、缺血再灌注组和缺血再灌注+直流电场组,每组12只。正常对照组:不做任何特殊处理;假手术组:进行缺血手术操作,不留置线栓但放置电极;缺血再灌注组:仅进行缺血再灌注手术操作;假手术+直流电场组:进行缺血手术操作,并予以直流电场刺激,参数50μA,每天60 min;缺血再灌注+直流电场组:进行缺血再灌注手术操作,并予以直流电场刺激,参数50μA,每天60 min,各组取材时间为缺血后14 d(6只),缺血后42 d(6只)。免疫荧光细胞化学技术检测SVZ神经干细胞的增殖与迁移,尼氏染色方法检测脑缺血区神经元损伤情况,采用动物行为学实验方法检测直流电场刺激后脑卒中动物神经功能恢复状况。结果与无电场刺激的假手术组和缺血再灌注组相比,直流电场刺激明显增加假手术组和缺血再灌注组神经干细胞在SVZ的增殖(P<0.05);与无电场刺激的缺血再灌注组相比,直流电场刺激明显增加缺血再灌注组SVZ神经干细胞向缺血区(即电极负极放置方向)迁移(P<0.05);与无电场刺激的假手术组和缺血再灌注组相比,直流电场刺激明显减轻缺血区神经元损伤(P<0.05);与无电场刺激的假手术组和缺血再灌注组相比,直流电场刺激明显改善脑卒中动物的神经行为学表现(P<0.05)。结论直流电场刺激能够明显改善脑卒中动物神经功能的恢复,可用于脑修复治疗。     

神经干细胞治疗缺血性脑卒中的进展

神经干细胞是一类具有自我复制更新能力、高度增殖潜能和多向分化潜能的细胞,通过外源性或内源性途径的神经干细胞疗法为缺血性脑卒中的治疗提供了一种新的途径。该文就神经干细胞及其治疗缺血性脑卒中的研究进展进行综述。     

嗅球损伤对成年大鼠脑室下区神经干细胞增殖和NMDA受体亚单位2B表达的影响

目的 研究嗅球损伤对成年大鼠脑室下区（SVZ）神经干细胞增殖和NMDA受体亚单位2B表达的影响.方法 正常成年雌性SD大鼠60只,随机分成正常对照组、生理盐水组、嗅球损伤组,嗅球内局部注射N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）制作嗅球损伤模型,术后分3d、7d、14 d、28 d四个时间点取脑.行免疫组织化学染色观察神经干细胞（Nestin）、增殖细胞（Ki67）及NMDA受体亚单位NR2B阳性细胞数.结果 （1）各组大鼠SVZ均可见Nestin阳性细胞,嗅球损伤后7 d Nestin IOD值增加[（29601±1788）/0.01 mm2,P＜0.05],14 d达到高峰[（31400±3435）/0.01 mm2,P＜0.05],28 d后有所下降[（27600±3209）/0.01 mm2,P＜0.05].（2）各组大鼠SVZ均表达Ki67阳性细胞,嗅球损伤后7d、14 d和28 d SVZ Ki67阳性细胞数分别为[（28.60±2.41）/0.01 mm2]、[（34.00±2.55）/0.01 mm2]、[（30.40±1.14）/0.01 mm2],显著高于正常组和生理盐水组阳性细胞数（P＜0.05）.（3）各组大鼠SVZ均表达NR2B阳性细胞,嗅球损伤3d,NR2B阳性细胞数开始增加[（58.80±2.95）个/0.01 mm2,P＜0.05],14 d达到高峰[（68.40±4.04）个/0.01 mm2,P＜0.05],28 d阳性细胞数有所下降,但维持较高的水平[（62.20±3.56）个/0.01 mm2,P＜0.05].（4）嗅球损伤后不同时间点NR2B阳性细胞数与Ki67阳性细胞数有高度正相关性,r=0.968,P＜0.05.结论 （1）嗅球损伤能刺激成年大鼠SVZ神经干细胞的增殖;（2）嗅球损伤后NDMA受体亚单位NR2B表达增加,并且与神经干细胞的表达变化趋于一致,因此推断NR2B可能参与SVZ神经干细胞的增殖过程.     

脑室下层细胞形态及分布的研究

目的 观察侧脑室脑室下层细胞的形态及分布。方法 制作成年大鼠侧脑室脑室下层的超薄切片和全脑连续石蜡切片。结果 脑室下层细胞主要分布在侧脑室外侧壁，从侧脑室出现平面延续到尾壳核消失平面。其中的神经元前体细胞的质游离核糖体较多，核大，核内的染色质疏松。结论脑室下层以细胞和尾壳核及伏隔核相邻，其中的细胞多数具有未成熟形态特点。     

大鼠短暂性局灶性脑缺血后侧脑室室下带神经细胞再生的观察

目的：观察大鼠短暂性局灶性脑缺血后侧脑室嘴侧的室下带(SVZ)神经细胞再生的时间规律。方法：行线栓法制作局灶性脑缺血模型，用BrdU标记再生的神经细胞，再用免疫组织化学SP法检测含BrdU的细胞。观察短暂性局灶性脑缺血后1、4、7、10、14天SVZ神经细胞再生的数量。结果：缺血后4天BrdU阳性细胞明显增加，7天时达到峰值，随后开始下降，在14天时明显下降，但仍高于正常组。结论：短暂性局灶性脑缺血可促进室下带的神经细胞再生，提示脑有自我修复的潜在能力。     

不同强度电刺激诱发丘脑激活的功能磁共振成像

目的:采用功能磁共振成像技术(functional magnetic resonance imaging,fMRI)研究受试者在不同强度电刺激作用下丘脑各亚区的激活规律,探讨该区参与痛觉调控的机制.方法:对10名健康右利手志愿者分别施加1倍痛阈、2倍痛阈、3倍痛阈3个不同强度的电刺激任务,同期采用GE 1.5T超导型磁共振扫描系统进行全脑fMRI扫描.应用功能性神经图像分析(analysis of functional neuroimages,AFNI)软件包对原始数据进行后处理以获得丘脑活动的脑功能图像.结果:双侧丘脑外侧部的激活信号与刺激强度基本呈线性正相关,提示该区可能与痛觉的感觉辨别方面有关;双侧丘脑内侧部的激活信号(BOLD信号)与刺激强度类似于指数关系,提示该区可能参与痛觉的注意与情绪活动.同时,在相同强度电刺激作用下,对侧丘脑外侧部的激活信号均强于同侧丘脑外侧部,表现出对侧优势现象,而双侧丘脑内侧部则缺乏此表现.结论:丘脑应为痛觉调控网络中的重要组成部分,该区表现出分离性激活现象,各亚区均有各自独特的刺激反应特性,这有助于了解丘脑在处理痛觉信息时所发挥的作用.     

成年和老年大鼠局灶性脑缺血后室管膜下区细胞增殖的比较研究

目的：比较老年和成年大鼠局灶性脑缺血后室管膜下区(the subventricular zone，SVZ)神经干细胞的增殖情况。方法：制作大脑中动脉梗塞模型，用免疫组织化学方法动态检测室管膜下区5-溴脱氧尿嘧啶(bromndeoxyuridine，BrdU)标记的阳性细胞数的变化：结果：正常组和假手术组成年大鼠SVZ的BrdU阳性细胞明显多于老年大鼠。实验组成年和老年大鼠SVZ的BrdU阳性细胞均在缺血后3d开始增加，7d时达到高峰，28d时仍高于正常水平，且成年大鼠各时间点SVZ的BrdU阳性细胞均明显高于老年大鼠。结论：大鼠脑缺血激活SVZ神经干细胞增殖，成年大鼠干细胞增殖能力强于老年大鼠。