乳腺癌干细胞的富集及相关基因表达

目的通过微球体培养富集乳腺癌干细胞,并检测其相关基因的表达。方法将MCF-7乳腺癌细胞进行第一代微球体培养,7d后消化微球体获得单细胞悬液,取部分细胞进行第二代微球体培养,另一部分细胞则在胶原底物进行分化培养。于培养第11天收集第二代微球体细胞、分化细胞,采用流式细胞术进行干细胞比例分析;同时应用Real-time PCR技术检测β-catenin、CXCR4、SOX2、ALDH3A1 mRNA表达。结果流式细胞分析显示,微球体细胞和分化细胞的侧亚群细胞比例分别为(7.36±0.54)%和(4.32±0.42)%(P<0.05),CD55high比例分别为(17.41±1.09)%和(4.47±0.33)%(P<0.05)。Real-time PCR检测结果表明,微球体细胞与分化细胞相比,β-catenin、CXCR4、SOX2及ALDH3A1 mRNA表达分别上调了约1.5、5.0、4.0和5.7倍(P<0.01)。结论微球体细胞富集了较高比例的乳腺癌干细胞,且β-catenin、CXCR4、SOX2、ALDH3A1 mRNA呈现高表达。     

Enrichment of breast cancer stem cells using a keratinocyte serum-free medium

Background  Keratinocyte serum-free medium (K-SFM) is a defined medium used to support the growth of primary keratinocytes and embryonic stem cell. The aim of this research was to optimize enrichment of breast cancer stem cells (CSCs) using K-SFM.

Methods  A K-SFM was used to enrich CSCs from two breast cancer cell lines and a primary culture of breast cancer. RPMI-1640 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) was used as a control. CSCs were identified with flow cytometry using CD44⁺/CD24^– as molecular markers. The expression of a variety of CSC markers (Oct-4, ABCG2, Nanog, N-cadherin, and E-cadherin) was analyzed with real-time PCR.

Results  Much higher percentage of CSCs was achieved with K-SFM: 17.3% for MCF-7 cells, 17.4% for SKBR-3, and 20.0% for primary breast cancer culture. Less than 1% CSC was achieved using RPMI-1640 supplemented with 10% FCS. In comparison to the CSCs obtained with RPMI-1640, CSCs in the K-SFM expressed higher levels of Oct-4, ABCG2, Nanog and N-cadherin, and lower level of E-cadherin.

Conclusion  K-SFM is an optimal culture medium to maintain and to enrich breast CSCs.

     

乳腺癌干细胞在无血清培养基K-SFM中的有效富集

摘要:CD24+/CD24-已被证实是乳腺癌干细胞的标记,该群细胞具有致瘤性、克隆形成及转移潜能。但在癌组织中或细胞系中含量极小,对其有效分离及纯化方法的缺乏已成为研究干细胞的主要障碍。本研究应用改良的无血清培养基K-SFM能在乳腺癌原代细胞及已建立的乳腺癌细胞系中体外有效富集CD24+/CD24-细胞群,对乳腺癌干细胞相关基因的检测显示Oct-4、ABCG2、Nanog和N-cadherin显著上调,而E-cadherin显著下调。 方法 1．乳腺癌细胞系培养 人乳腺癌细胞系MCF-7、SKBR-3在含20 ng/ml 表皮生长因子(EGF; R and D Systems, Minneapolis, MN), 5 μg/ml 胰岛素, 0.4% 牛血清白蛋白 (Sigma, St. Louis, MO) 的K-SFM无血清培养基中培养,对照组为含10%小牛血清RPMI 1640培养基培养。37˚C、5%二氧化碳浓度下,恒湿培养箱培养。 2．乳腺癌组织标本原代培养 乳腺癌标本在离体30分钟内获取,进行机械分离,部分需酶消化。用30μm 柱状微孔过滤,制成单细胞悬液,以1000个/ml分别于RPMI-1640全培养基和K-SFM无血清培养基中培养。培养方法同上。 3．流式细胞分析与分选 收集上述方法培养的细胞系以及原代培养细胞,通过流式检测乳腺癌干细胞分子标记CD44+/CD24-/low,确定培养方法对于富集干细胞的有效性。同时通过荧光分选 (FACS),富集CD44+/CD24-/low样细胞制成单细胞悬液。 4．定量RT-PCR分析 收集流式细胞仪分选的K-SFM无血清培养基中细胞及对照分化细胞,提取RNA,通过实时定量 RT-PCR检测干细胞相关基因Oct-4, ABCG2, Nanog 和N-cadherin的表达,以GAPDH作为内参。 结果 在MCF-7细胞系观察到微球体的形成,制成单细胞悬液,应用乳腺癌干细胞表面标记CD44+/CD24-/low标记,经流式细胞仪分选发现MCF-7中干细胞标记细胞占17.3%,较含血清培养基中干细胞比例（0.5%）增加了34.6倍;而 SKBR-3干细胞比例占17.4%,较对照组（0.9%）高28倍。且实时定量 RT-PCR检测显示该群细胞大量表达干细胞相关基因Oct-4, ABCG2, Nanog 和N-cadherin。在人乳腺癌组织作原代培养也得出相似结论。     

曲古菌素A抑制乳腺肿瘤干细胞的自我更新

目的研究组蛋白乙酰化酶抑制剂曲古菌素A对乳腺肿瘤干细胞自我更新的影响;初步研究其抑制乳腺肿瘤干细胞自我更新的机制。方法悬浮培养乳腺癌细胞系MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF-7和SKBR3,用不同浓度曲古菌素A处理悬浮培养乳腺癌细胞7 d,用0.1%DMSO作对照;用次级细胞球形成率和乳腺癌细胞初级细胞球细胞中肿瘤干细胞即CD44+/CD24-细胞群的百分比评价曲古菌素A对乳腺癌干细胞自我更新的影响;乳腺癌细胞初级细胞球细胞中CD44+/CD24-细胞群的百分比用流式细胞仪检测,凋亡细胞百分比用Annexin-V法在流式细胞仪检测,Nanog、Sox2和Oct4 mRNA的表达用定量PCR法检测。结果100 nmol/L和500 nmol/L曲古菌素A均能部分抑制4个乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞的自我更新,但10 nmol/L不行;500 nmol/L曲古菌素A诱导乳腺癌细胞初级细胞球细胞凋亡;曲古菌素A能下调乳腺癌细胞初级细胞球细胞Nanog和Sox2 mRNA的表达。结论曲古菌素A能部分抑制乳腺癌干细胞的自我更新,其机制与其能下调乳腺癌初级细胞球细胞Nanog和Sox2表达相关联,提示临床可用低浓度组蛋白乙酰化酶抑制剂和其他抗癌药物联用以便获得较好的乳腺肿瘤干细胞自我更新抑制效果,胚胎干细胞核心转录因子Nanog和Sox2可能作为肿瘤治疗的新靶标。     

基于基因芯片的乳腺癌干细胞miRNAs检测分析

目的 利用流式细胞仪(FACS)细胞分选技术从乳腺癌细胞株MCF-7中分选乳腺癌干细胞,并利用基因芯片进行其miRNAs表达谱分析.方法 利用已知的乳腺癌干细胞的表面分子标志(CD44 ESA CD24-/low),以相应的荧光标记抗体对细胞加以标记,FACS细胞分选获得乳腺癌干细胞,NOD-SCID移植瘤实验进行干细胞功能鉴定;分别提取细胞总RNA以及小分子RNA,经荧光标记后与miRNAs基因芯片杂交,获得乳腺癌干细胞miRNAs表达谱.结果 从MCF-7中分选到约1%的CD44 ESA CD24-/low细胞,NOD-SCID移植瘤实验表明其具有干细胞特性,基因芯片杂交获得20个乳腺癌干细胞相关miRNAs,其中4个为低表达,16个为高表达.结论 乳腺癌干细胞具有自身特征性miRNAs,为进一步从干细胞层面研究乳腺癌发病机制及靶向治疗打下基础.     

磁探针标记乳腺癌干细胞的实验研究

目的 研究超顺磁性氧化铁(superparamgnetic iron oxides,SPIOs) 标记乳腺癌干细胞及其生物学特性.方法 乳腺癌干细胞分离、鉴定及培养;用Feridex(一种SPIOs)标记乳腺癌干细胞,制备磁标记乳腺癌干细胞;利用MTT、透射电镜和Prussian blue染色等方法对磁标记的乳腺癌干细胞生物学特性进行研究.结果 在原代培养的乳腺癌细胞中分离出乳腺癌干细胞.Feridex与乳腺癌干细胞共同孵育后,Prussian blue染色及透射电镜均显示乳腺癌干细胞胞浆中含有氧化铁颗粒.随Feridex浓度的增高(15～25μg/mL),Feridex对乳腺癌干细胞存活、繁殖能力的影响差异无统计学意义(P>0.05).当Feridex的浓度大于35μg/mL时,影响其存活和繁殖(P<0.05).结论 本实验利用Feridex作为磁标记探针,对乳腺癌干细胞进行成功磁标记,为进一步利用核磁共振(MRI)对乳腺癌干细胞活体追踪奠定实验基础.     

微小RNA可在人骨髓间充质干细胞分化来源的心肌样细胞中表达

目的研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）分化来源的心肌样细胞中代表性微小RNA（miRNAs）的表达。方法利用FITC-偶联的CD29、CD34和CDllb抗体在流式细胞仪上检测分离的hMSCs的抗原表型。分别用5-氮胞苷（5-aza）和乳鼠心肌非接触共培养法诱导传至3代的hMSCs分化为心肌样细胞。用免疫化学法检测hMSCs分化来源的心肌样细胞中心肌特异的α-肌节辅肌动蛋白和心肌肌钙蛋白（cTnI）的表达：利用逆转录PCR和DNA测序鉴定5个代表性的心脏特异的初级微小RNA（pri-miRNAs）的表达。结果hMSC标志分子CD29表达率为98．87％．而造血细胞标志分子CD34和CDllb的表达率只是5％和0．4％。免疫化学分析显示．分别经5-aza和乳鼠心肌非接触共培养诱导的hMSC均可表达α-肌节辅肌动蛋白和cTnI,而在未分化的hMSCs中无表达。miRNA-143,-181可在5-aza诱导的hMSCs中表达,miRNA．143,-181,-206,-208可在乳鼠心肌非接触共培养的hMSCs中表达．而两种诱导方法均未能诱导miRNA-1-2在hMSCs中表达。结论利用5-aza和乳鼠心肌非接触共培养法诱导hMSCs分化的心肌样细胞中可以表达不同的心脏特异的pri-miRNAs。     

乳腺癌干细胞模型的筛选

目的:研究不同细胞系中乳腺癌干细胞的比例,为临床根治肿瘤和研发靶向性治疗药物提供理想的乳腺癌干细胞模型。方法:采用流式细胞仪对乳腺癌细胞亚系MCF7、SKB r3和人胚肾293细胞中CD44 CD24的表达情况进行检测;同时对化疗前后各细胞CD44 CD24的表达进行比较。结果:CD44 CD24-细胞在MCF7、SKBR3及人胚肾293细胞中的比例分别为0.20%±0.10%;1.37%±0.20%;36.27%±3.44%;CD44 CD24-细胞在293细胞中所占比例最多。化疗后CD44 CD24-在293细胞中比例升高明显,而在MCF7、SKBR3细胞中CD44 CD24-细胞的比例未发生明显改变。结论:MCF7、SKB r3、293细胞均存在乳腺癌干细胞,而人胚肾293细胞是临床开展乳腺癌治疗的理想乳腺癌干细胞模型。     

化疗后乳腺癌组织中干细胞微球体的分离、培养及鉴定

目的：对从接受新辅助化疗的乳腺癌患者的乳腺癌组织中分离出的化疗微球体（CMSs）进行培养和鉴定,为获取乳腺癌干细胞的新方法的建立提供理论依据。方法：①将获得的CMSs接种在添加生长因子的DMEM/F12培养基中,观察CMSs的生长情况;②通过单克隆形成实验检测化疗微球体细胞(CMSDCs)的克隆形成和自我更新能力;③CMSDCs贴壁培养在含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,观察其分化能力;④免疫细胞化学检测CMSDCs及其分化细胞CK14、CK18和CK19的表达;⑤流式细胞术（FCM）检测CMSDCs及其分化细胞中ALDH1+细胞的含量;⑥ 构建NOD/SCID小鼠移植瘤模型,观察CMSDCs的致瘤能力。结果：CMSs在无血清培养基中继续呈球状生长,3 d后球体表面出现坏死的细胞层;CMSDCs可以连续传代形成新的CMSs,新生球体折光性强,表面无坏死层;在添加血清的培养基中的CMSDCs可以分化产生梭形的单层细胞;CMSDCs表达乳腺干细胞标记物CK19,不表达分化标记物CK14和CK18;CMSDCs和分化细胞中ALDH1+细胞的比例分别为为17.41%～23.57%和0.50%～1.28%;103个CMSDCs即可在NOD/SCID小鼠体内形成与原发肿瘤性质相同的移植瘤。结论：CMSs富含乳腺癌干细胞,与悬浮培养所获得的乳腺癌干细胞微球体类似,提示从化疗后的乳腺癌组织中分离癌干细胞微球体可能成为乳腺癌干细胞获取的新途径。     

干细胞在实体肿瘤转移中的作用与地位

 肿瘤干细胞 (cancer stem cell,CSC)被认为是治疗失败、药物耐受和转移复发的原因所在。CSC具有自我更新 (self-renewal)和高侵袭潜能的特性,并最终组成肿瘤的异质性 (heterogeneity)。无论是在原发瘤、循环肿瘤细胞 (circulating tumor cell),还是在转移灶的形成中,CSC都发挥着重要作用,且与患者预后密切相关。因此,更好地认识CSC在转移过程中的重要作用,研发有效的靶向CSC及其微环境 (microenvironment)的治疗药物,将有望使之成为抗转移的理想途径。     

Implication of expression of Nanog in prostate cancer cells and their stem cells

Recent studies suggested that the prostate cancer may arise from prostate cancer stem cells that share some same characteristics with normal stem cells. The purpose of this study was to detect the differences of Nanog expression between PC3 prostate cancer cell line and its tumor stem cells, and the relationship was preliminarily examined between Nanog and prostate cancer and its tumor stem cells. By using magnetic active cell sorting (MACS), we isolated a population of CD44+/CD133+ prostate cancer cells that display stem cell characteristics from PC3 cell line. Immu-nohistochemistry revealed positive expressions of CD44, CD133 and α2β1-integin in the isolated cells. CCK-8 analysis showed that isolated cells had a strong proliferative ability. The formation of the cell spheres in serum-free medium and holoclones in serum-supplied medium showed that the cells were capable of self-renewing, indicating that the isolated cells were a population of cancer stem-like cells derived from PC3 cell line. Western blotting exhibited that the isolated cells had higher experession of Nanog, an embryonic stem marker, as compared with PC3 cells. Our study showed that Nanog might be helpful in sustaining the self-renewal and the undifferentiation of prostate cancer stem cells, and may serve as a marker for prostate cancer stem cells for isolation and identification.     

Effects of notch-1 down-regulation on malignant behaviors of breast cancer stem cells

This study examined the effect of Notch-1 signaling on malignant behaviors of breast cancer cells by regulating breast cancer stem cells （BCSCs）. BCSCs were enriched by using serum-free me- dium and knocked out of Notch-1 by using a lentiviral vector. Real-time polymerase chain reaction （RT-PCR） and Western blotting were used to detect the Notch-1 expression levels in breast cancer cell lines and BCSCs, and fl0w cytometry to detect the proportion of BCSCs in BCSC spheres. The BCSC self-renewal, migration, invasion, and tumorigenicity were examined by the tumor microsphere-forming assay and transwell assay and after xenotransplantation. The results showed that the Notch-1 silencing reduced the number of BCSC spheres, the proportion of BCSCs, and the number of cells penetrating through the transwell membrane. It also decreased the size of tumors that were implanted in the nude mice. These results suggest that Notch-1 signaling is intimately linked to the behaviors of BCSCs. Blocking Notch-1 signaling can inhibit the malignant behaviors of BCSCs, which may provide a prom- ising therapeutical approach for breast cancer.     

AURKA蛋白激酶在三阴乳腺癌干细胞形成血管拟态中的实验研究

目的：探讨AURKA蛋白激酶在三阴乳腺癌干细胞形成血管拟态中的作用.方法：用无血清悬浮培养法从三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231分离获得干细胞,RT-PCR检测干细胞转录因子c-myc、sox-2的表达状态;三维培养观察干细胞形成血管能力;Western blot检测AURKA蛋白激酶在干细胞和常规培养细胞的表达;利用干细胞进行三维培养并加入AURKA蛋白激酶抑制剂观察对成血管能力的影响.结果：（1）利用干细胞无血清悬浮培养可获得MDA-MB-231干细胞,其干细胞转录因子c-myc、sox-2表达高于常规培养细胞.（2）AURKA蛋白激酶在乳腺癌干细胞球中较常规培养细胞表达升高.（3）干细胞三维培养可形成血管管道,加入AURKA蛋白激酶抑制剂后成血管能力减弱.结论：AURKA蛋白激酶可促进三阴乳腺癌干细胞形成血管拟态,抑制其表达能减弱形成血管拟态能力.     

Tamoxifen-resistant breast cancer cells possess cancer stem-like cell properties

Background Cancer stem cells （CSCs） are the cause of cancer recurrence because they are resistant to conventional therapy and contribute to cancer growth and metastasis.Endocrinotherapy is the most common breast cancer therapy and acquired tamoxifen （TAM） resistance is the main reason for endocrinotherapy failure during such therapy.Although acquired resistance to endocrine treatment has been extensively studied,the underlying mechanisms are unclear.We hypothesized that breast CSCs played an important role in TAM-induced resistance during breast cancer therapy.Therefore,we investigated the biological characteristics of TAM-resistant （TAM-R） breast cancer cells.Methods Mammosphere formation and tumorigenicity of wild-type （WT） and TAM-R MCF7 cells were tested by a mammosphere assay and mouse tumor xenografts respectively.Stem-cell markers （SOX-2,OCT-4,and CD133） and epithelial-mesenchymal transition （EMT） markers were tested by quantitative real-time （qRT）-PCR.Morphological observation was performed to characterize EMT.Results After induction of TAM resistance,TAM-R MCF7 cells exhibited increased proliferation in the presence of TAM compared to that of WT MCF7 cells （P ＜0.05）,indicating enhanced TAM resistance of TAM-R MCF7 cells compared to that of WT MCF7 cells.TAM-R MCF7 cells showed enhanced mammosphere formation and tumorigenicity in nude mice compared to that of WT MCF7 cells （P ＜0.01）,demonstrating the elevated CSC properties of TAM-R MCF7 cells.Consistently,qRT-PCR revealed that TAM-R MCF7 cells expressed increased mRNA levels of stem cell markers including SOX-2,OCT-4,and CD133,compared to those of WT MCF7 cells （P ＜0.05）.Morphologically,TAM-R MCF7 cells showed a fibroblastic phenotype,but WT MCF7 cells were epithelial-like.After induction of TAM resistance,qRT-PCR indicated that MCF7 cells expressed increased mRNA levels of Snail,vimentin,and N-cadherin and decreased levels of E-cadherin,which are considered as EMT characteristics （P ＜0.05）.Conclusion TAM-R MCF7 cells possess CSC characteristics and may be responsible for TAM resistance during breast cancer therapy.     

乳腺癌新辅助化疗后的癌干细胞分离培养

目的从不同周期新辅助化疗后的乳腺癌组织中分离培养乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs),观察其体外增殖和分化特性,研究新辅助化疗对BCSCs分离培养的影响。方法在添加生长因子的无血清培养基(serumfree media,SFM)中悬浮培养细胞获得富含BCSCs的微球体(mammospheres,MSs),通过克隆形成实验研究微球体细胞(mammospheres-derived cells,MSDCs)的自我更新能力;在添加5%胎牛血清的培养基中培养MSDCs诱导其分化,研究其分化能力;免疫细胞化学检测ESA和Nestin在MSDCs中的表达;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测MSDCs中的AL-DH1+细胞含量。结果化疗1个周期的5例乳腺癌标本经培养均无MSs形成,化疗2个周期的6例标本经培养其中3例有MSs形成,化疗3个周期以上的9例标本中的5例可以直接分离出MSs,其余4例仅得到少量坏死的细胞和组织碎片;MSDCs在含血清的培养基中贴壁分化;MSDCs均含有ALDH1+细胞。结论从新辅助化疗后的乳腺癌组织中分离BCSCs宜选取化疗2个周期后的标本...     

E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒对乳腺癌干细胞的作用

目的研究E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒(E1B--OLV)对乳腺癌干细胞的作用。方法E1B--OLV感染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞(实验组),常规培养MCF-7细胞作为对照组。两组细胞分别行流式细胞仪(FCM)分析CD44 CD24-细胞的表型比例。两组细胞同时行微球体培养,观察微球体形成的大小及数量,计算微球体形成率(MFE),用FCM分析微球体CD44 CD24-细胞的比例。结果实验组MCF-7细胞的CD24-、CD44 和CD44 CD24-比例分别为43.90%、63.26%和22.19%,对照组为6.74%、88.30%和2.30%。实验组中微球体成球时间早于对照组,球体体积大于对照组,MFE高于对照组(1.26%和0.9%);实验组和对照组微球体中CD44 CD24-细胞的比例分别为38.08%和23.35%。结论ElB--OLV在短期内杀死MCF-7细胞,但主要是乳腺癌分化细胞,可能促进了乳腺癌干细胞的生长,加快了其自我更新和分化速率。     

单克隆抗体C225对乳腺癌干细胞的抑制作用

目的 研究表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体西妥昔单抗(C225)对乳腺癌细胞系MCF-7中乳腺癌干细胞的抑制作用。方法 MTT法检测C225对MCF-7细胞增殖的影响。将MCF-7进行微球体培养,根据培养液中是否加入表皮生长因子(EGF)和C225分为对照组、C225组、EGF组、EGF+ C225组;培养13 d,观察四组微球体形成大小及数量,计算微球体形成率(MFE);流式细胞术检测微球体细胞及常规培养MCF-7中CD44+CD24－细胞比例。结果 MCF-7细胞增殖抑制率随C225质量浓度的增加而上升。与对照组比较,C225组微球体体积明显减小,且MFE和微球体中CD44+CD24－细胞比例明显降低,分别为(0.61±0.04)% vs (1.44±0.09)% (P<0.01)和(3.50±0.29)% vs (9.07±0.52)% (P<0.01)。与EGF组比较,EGF+C225组微球体体积明显减小,且MFE和微球体中CD44+CD24－细胞比例明显降低,分别为(0.68±0.04)% vs (1.61±0.05)% (P<0.01)和(4.00±0.58)% vs (10.47±0.79)% (P<0.01)。常规培养MCF-7中CD44+CD24－细胞比例为（2.03±0.15）%,与EGF组和对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。EGF组与对照组微球体形成大小、MFE以及微球体中CD44+CD24－细胞比例的比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 C225对MCF-7中CD44+CD24－细胞有明显抑制作用。     

血管拟态在乳腺癌中的研究进展

血管拟态是一种特殊的血管生成模式,其管样结构由肿瘤细胞而非传统的内皮细胞构成,为肿瘤的生长、侵袭和转移提供营养。近年来,人们发现血管拟态与多种恶性肿瘤的预后、侵袭、转移和耐药性有关。目前普遍认为血管拟态和血管生成依赖于一些共同的机制。而且也有人认为血管拟态的形成是导致抗血管生成药物产生耐药性的原因之一。现对目前对乳腺癌中血管拟态形成的机制,包括相关的信号通路以及肿瘤干细胞、上皮间质化和抗血管生成治疗等研究成果做一综述,并且将对血管拟态作为乳腺癌治疗靶点的意义以及未来的发展方向进行展望。     

乳腺癌干细胞中活性氧簇水平的研究

目的 探讨乳腺癌MCF-7细胞中CD44+CD24-/low表型乳腺癌干细胞活性氧簇水平.方法 用悬浮培养的方法富集乳腺癌干细胞.用流式细胞仪检测CD44+CD24-/low表型乳腺癌干细胞含量,体内成瘤实验验证其干细胞特性,克隆形成实验检测其辐射敏感性,2′-7′-二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)法检测其活性氧簇...