源于新型PNP/Mep-dR系统的融合及单自杀基因载体的构建和表达检测

目的 构建源于PNP/Mep-dR系统的融合及单自杀基因表达载体并检测二者表达。方法 经DNA重组技术制备融合基因PNP-TK，将其及PNP基因分别插入真核表达载体pcDNA3.0，构建两真核表达载体pcDNA3.0/PNP-TK和pcDNA3.0/PNP；酶切，PCR及测序鉴定两重组体，结果，成功构建了两个新型自杀基因表达载体并在HepG2细胞株中检测到二者表达，结论，两个重组体，尤其是pcDNA3.0/PNP-TK，是肿瘤基因治疗中高效，广谱的理想载体。     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：采用基因工程技术，将转化生长因子B前体相关蛋白（LAP）通过基质金属蛋白酶（MMP）水解部位与人可溶性TNFI型受体（hsTNFRI）连接，构建pcDNA3，1／LAP-MMP-hs TNFRI融合蛋白真核表达载体，获得LAP-MMP-hsTNFRI融合蛋白。方法：将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），得到pcDNA3．1／MMP重组体；将TGF-β1的LAP段和hsTNFRI与MMP水解部位连接，获得pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI真核表达载体。测序鉴定后，脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞，通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果：酶切及测序结果证实pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI重组载体构建成功，转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论：成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3，1／LAP-MMP-hsTNFRI，并获得融合基因的瞬时表达，为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

结核杆菌含信号肽的Mtb8.4真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆结核杆菌含信号肽的Mtb8．4(MS)基因，导入真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组质粒pcDNA3．1( )-MS，并在真核细胞中进行表达。方法：提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR圹增，获得含信号肽的Mtb8．4(MS)基因后，与pcDNA3．1( )载体进行连接重组，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定；重组质粒转染COS-7细胞48h后，用RT—PCR方法鉴定MS在转录水平的表达情况。结果：pcDNA3．1( )-MS真核表达载体构建成功；转染COS-7细胞后，MS在转录水平成功表达。结论：pcDNA3．1( )-MS真核表达质粒的构建以及MS在COS-7细胞中的成功表达，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3．1( )-MSDNA疫苗奠定了基础。     

梅毒螺旋体膜蛋白Tp92真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的 以梅毒螺旋体(Trepondmapallidum，Tp)外膜蛋白基因Tp92为目的基因，构建Tp真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92，并鉴定其在Hela细胞能否正确表达，为进一步开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。方法 应用PCR技术从TpNichols株基因组模板中扩增Tp92基因，定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92，脂质体介导将pcDNA3．1( )-Tp92转染入Hela细胞，以免疫酶标法和一步法RT～PCR检测pcDNA3．1( )Tp92在Hela细胞中的表达情况。结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建Tp真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92，DNA测序显示重组质粒含有2103bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。测序后结果经与GenBank登录的序列做blast比较，载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的Nichols株Tp92基因序列完全一致，同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为95．5％～100％，证实本研究所得到的基因为所需基因，同时也表明该基因为Tp的保守性基因。免疫酶标法结果显示该重组体在Hela细胞能有效表达目的蛋白与梅毒阳性标准血清中相应抗体反应；RT-PCR检测结果显示RT-PCR扩增产物与Tp92基因片段大小相符，确实源于重组质粒转录后的mRNA。结论 TD真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92的成功构建及在体外真核细胞中的有效表达，为进一步研制梅毒DNA疫苗及其生物学功能的研究奠定了一定的实验基础。     

乙肝病毒preS1基因与截短C基因真核表达载体构建及表达

目的建立乙型肝炎病毒（HCV）preS1基因与截短C基因真核表达载体，并在CHO细胞中瞬时表达。方法PCR方法扩增HBV核心区羧基端部分缺失的基因片段和preS1全基因，克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-）后测序鉴定，并通过脂质体瞬时转染CHO细胞。结果构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-Ct-preS1，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT—PCR证实pcDNA3．1（-）-Ct-preS1在CHO中表达截短的核心基因和preS1基因融合蛋白。结论成功构建preS1基因与截短C基因真核表达载体，可在CHO细胞中瞬时表达，为深入研究HBV基因免疫奠定了基础。     

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2的构建

目的构建白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2．为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法从白假丝酵母菌中提取基因组DNA，以其为模板采用聚合酶链反应（PCR）法获取SAP2基因，将真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC和SAP2基因行EcoRI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶纯化，连接酶切产物，转化TOP10感受态细菌，筛选菌落和测序鉴定。结果经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同，并定向插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）myc-HisC，电泳获得预期的SAP2条带,测序证实为正确的SAP2序列。结论利用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC可以方便而高效地构建pcDNA3．1／SAP2重组质粒，该质粒能直接激活抗原提呈细胞，可以使重组质粒具有较强的免疫原性和免疫反应性。     

帕金森病PINK1蛋白真核表达载体pcDNA3．1-myc／PINK1的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的：构建真核表达质粒pcDNA3／gD，并在体外COS-7细胞中进行表达。方法：体外PCR扩增出gD糖蛋白基因，克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后，转染COS-7细胞，用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果：构建了pcDNA3／gD真核表达质粒，经原位ELISA证实，转染，COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合，证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论：柯建的重组真核表达质粒pcDNA3／gD能够在COS-7细胞中表达。     

人神经病靶标酯酶RNAi表达载体的构建及其对哺乳动物细胞中NTE表达的抑制

目的构建人神经病靶标酯酶（NTE）双链RNA的稳定表达载体。方法用SpeI和XhoI将pSUPER质粒中的H1 RNA聚合酶Ⅲ启动子及多克隆位点部分切下替换pcDNA3．1（＋）载体中的巨嗜细胞病毒（CMV）启动子及其多克隆位点，构建了适合在哺乳动物细胞中表达具有干涉作用的小RNA的载体pSUPER／neo，进而将针对NTE表达的双链DNA插入到Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切的载体pSUPER／neo中构建NTE的双链RNA表达载体pSUPER/neo-NTE，后者被转染到COS7和SH-SYSY细胞中，采用蛋白质杂交和酶活力测定的方法，检测其表达效率并验证载体构建的TF确性。结果构建了适合在真核细胞用抗生素筛选的NTE双链RNA表达载体pSUPER／neo-NTE。蛋白质杂交检测显示，转染细胞能有效抑制外源性NTE的表达；酶活力测定则显示其能有效地抑制内源性NTE的表达．结论采用启动子替换的策略，成功构建了NTE双链RNA的表达载体并在哺乳动物细胞内有效抑制NTE的表达。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

丙型肝炎病毒基因1b型F蛋白对人肝细胞癌细胞株凋亡的影响

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因1b型F蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 构建真核表达重组质粒pcDNA3.0-F-EGFP,并利用Lipofectamine 2000转染人肝细胞癌细胞系HepG2,同时设pcDNA3.0-C-EGFP-HepG2阳性对照、pcDNA3.0-HcpG2为阴性对照及未转染HepG2为空白对照,以Act-D、TNFα诱导四组细胞系发生凋亡,Annexin V-FITC/PI双染检测肿瘤细胞凋亡率,并使用细胞凋亡DNALadder检测,进一步验证HCV 1b型F蛋白在肝细胞凋亡的生物学功能效应.结果 pcDNA3.0-F-EGFP-HepG2细胞系在发生凋亡的时间上比peDNA3.0-C-EGFP-HepG2快,但相对空白质粒转染组及未转染HepG2细胞系有明显延迟,凋亡的发生率也明显低于阴性对照及空白对照细胞系(P<0.001).结论 外源性基因HCV 1b型F的引入及表达,对HepG2细胞的凋亡有抑制作用.     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

端粒和端粒酶相互作用蛋白在真核细胞中的表达

目的从人肝癌细胞系HepG2中获得PinX1基因,构建真核表达载体,转染Hek293细胞。方法采用RT-PCR技术从HepG2中扩增PinX1,克隆入真核表达载体pcDNA3,重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化法检测蛋白的表达。结果RT-PCR方法扩增获得PinX1基因,构建真核表达载体pcDNA3-PinXl-vsv重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化检测结果表明在细胞核内有PinX1表达。结论成功获得PinX1基因,构建的重组载体可在Hek293细胞内表达,为探索PinX1在端粒、端粒酶调控中的作用机制奠定基础。     

真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的构建pcDNA3．1－RASSFl真核表达载体,并检测其对肝癌细胞系HepG2凋亡的影响。方法应用聚合酶链反应技术从人RASSFlcDNA中扩增出RASSF1基因后,以内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切,将其克隆人用相同酶处理的载体pcDNA3．1;将重组质粒pcDNA3．1－RASSF1转染肝癌HepG2细胞,应用Westernblot法检测RASSF1的表达水平;用AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡情况。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3．1．RASSF1构建成功;Westernblot法结果表明转染pcDNA3．1-RASSF1后HepG2细胞中RASSFl表达升高;AnnexinV／PI法用流式细胞术检测凋亡,空白组、pcDNA3．1组和pcDNA3．1-RASSFl组HepG2细胞的凋亡率分别为（5．8±0．42）％、（7．48±0．68）％和（35．1±3．15）％。结论真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1构建成功;RASSF1蛋白在HepG2细胞中高表达,并促进细胞凋亡。     

Rap2b基因表达对NIH3T3细胞集落形成及细胞伤口愈合能力的影响

目的了解Rap2b基因对NIH3T3细胞集落形成及细胞伤口愈合能力的影响,为探讨该基因在人肺癌发生中的作用提供实验依据。方法以人肺CDNA为模板克隆出Rap2b基因片段,构建pcDNA3.1-Rap2b真核表达载体,稳定转染NIH3T3细胞,利用集落形成试验和细胞伤口愈合试验,观察细胞集落形成及细胞伤口愈合能力的改变。结果与转染空质粒的细胞对比,转染pcDNA3.1-Rap2b质粒的细胞集落形成数目明显增加(P0.01),损伤修复愈合增快。结论 Rap2b基因表达可显著增加NIH3T3细胞集落形成,并增快该细胞的损伤愈合速度。提示Rap2b基因表达可能具有促进NIH3T3细胞增殖和恶性转化功能。     

恶性人脑胶质瘤的HSV-Tk/GCV自杀基因治疗系统的构建及应用研究

目的构建恶性人脑胶质瘤细胞株TJ899的单纯疱疹病毒的胸腺激酶/丙氧鸟苷（HSV-Tk/GCV）自杀基因治疗系统，探讨该体系在脑胶质瘤治疗中的作用。方法采用PCR、RT-PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建由自杀基因pcDNA3.1（-）CMVTK表达载体；用脂质体介导法将pCMVTK质粒转染进入TJ899恶性人脑胶质瘤细胞，并用M IT法检测感染后细胞对（GCV）的敏感性。结果pCMVTK质粒经测序证实含有TK目的基因；脂质体介导Pcmvtk质粒成功转染了TJ899细胞，并在体外实验研究中显示很好的治疗效果。结论建立了作用于恶性人脑胶质瘤细胞株TJ899的HSV-Tk/GCV自杀基因治疗系统，为脑胶质瘤的临床研究打下了基础。