新型融合基因hIFNα1—CB在大肠杆菌中表达

目的构建人干扰素α1和抗菌肽B的融合蛋白表达质粒pHC,并初步研究融合蛋白的抗病毒活性.方法重组质粒pHC转化E.coli JM83,温控诱导表达,SDS-PAGE制备蛋白质,病变抑制法测定其抗病毒比活性.结果得到分子量约为21ku的目的蛋白,抗病毒比活性为2.62×106IU/mg.结论成功构建了融合蛋白表达质粒pHC,重组蛋白的构象及C-端的β位酰胺化等因素可能影响重组蛋白的生物学活性.     

GM-CSF/IL-15融合基因原核表达载体的构建及表达

目的构建原核表达质粒pPROEX^TM HTb—GM—CSF／IL-15并在大肠杆菌DH5α中表达，以期获得具有GM—CSF／IL-15双重活性的融合蛋白。方法利用分子生物工程技术，构建重组原核表达载体pPROEX^TM HTb-GM-15，并转化进大肠杆菌DH5α IPTG诱导表达4h后，经SDS-PAGE、免疫印迹证实为GM-15融合蛋白。结果重组载体经转化大肠杆菌DH5α后，诱导表达出相对分子质量约为33kD左右的融合蛋白。结论构建了pPROEX^TM HTb—GM—CSF／IL-15融合基因表达系统，并诱导表达出GM-15融合蛋白。     

人可溶性4-1BB蛋白分子表达载体的构建

4-1BB分子是近年来发现的一种共刺激分子,属肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体(TNFR/NGFR)超家属成员,表达于活化的T淋巴细胞表面,以CD8+T细胞为主。4-1BB分子与其配体(4-1BBL)相互作用,其生物学功能主要是促进T细胞活化、增殖和分泌细胞因子,如可使CD8+T细胞产生IL-2和IFN-γ,还能使CD4+T细胞产生IL-2及IL-4,和增强细胞毒性T细胞(CTL)的功能,提供独立于CD28以外的共刺激信号,在调节机体免疫应答中有重要作用[1,2]。为此,我们构建了人可溶性4-1BB蛋白分子(hs4-1BB)的表达载体,为其进一步转化毕氏酵母获得hs4-1BB重组蛋白和研究其生物学功能奠定了基础。     

8R-MUC1核心肽融合蛋白的原核表达及纯化

目的：构建蛋白质转导结构域8个精氨酸聚合体（8R）与MUC1核心肽融合蛋白的原核表达载体,并表达、纯化出具有生物学活性的8R-MUC1核心肽融合蛋白。 方法：以PCR法从HSP65-MUC1-pET28a质粒中钓取MUC1核心肽2个重复序列片段,连入pMD18-T载体,然后用酶切、连接的方法从T载体上获得MUC1核心肽6重复序列片段(MUCPT),将其克隆入含8R的pET26b⁺原核表达载体中构建8R与MUCPT融合蛋白（8R-MUCPT）表达载体。用IPTG诱导转化8R-MUCPT表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化8R-MUCPT融合蛋白。 结果：构建了8R与MUC1核心肽6个重复序列片段的融合蛋白原核表达载体8R-MUCPT-pET26b⁺,并在BL21(DE3)中表达了8R-MUCPT融合蛋白,经镍螯合层析获得纯度为95.5%的8R-MUC1核心肽融合蛋白。 结论：构建了8R-MUC1核心肽融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出具有生物学活性的融合蛋白。     

结核分支杆菌Ag85B融合蛋白表达载体的构建及纯化

目的：构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP／Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法：常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0．3mmol／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D thiogalactoside,IPTG）诱导表达产生融合蛋白（MBP／Ag85B）,Western blot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂（Amylose resin）对MBP／Ag85B融合蛋白纯化。结果：重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ／HindⅢ酶切后,1％琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40％;Western blot显示,MBP／Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amylose resin纯化后,MBP／Ag85B融合蛋白的纯度可达95％以上。结论：成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。     

CD40-IgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建人CD40-IgG1Fc融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达.方法 应用T-A克隆技术和亚克隆技术,构建人CD40膜外段和IgG1Fc段融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),将其转染入CHO细胞株并筛选,进行稳定表达.通过RT-PCR、Western blot法及ELISA法证实融合基因的表达.结果 成功构建真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),并建立CHO细胞稳定表达株.Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达.结论 通过基因工程生产的人CD40-IgG1Fc融合蛋白,能够特异性阻断CD40-CD40L的相互作用.     

蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定

目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白 (GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究.方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a( );在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性.结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性.结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究.     

大鼠转化生长因子β型受体胞外区与γ干扰素融合蛋白真核表达载体的构建

目的 :在哺乳动物细胞中表达有生物学活性的大鼠转化生长因子β 型受体胞外区与γ干扰素(rs TGFβR - IFNγ)融合蛋白。方法 :提取大鼠肝脏 m RNA,用 RT- PCR方法分别扩增 s TGFβR 和 IFNγ基因并克隆至同一真核表达载体 p Sec Tag2 A,构建 p Sec Tag2 A/rs TGFβR - IFNγ重组体 ,以脂质体转染至 CHO细胞 ,用EL ISA及 Western印迹法检测 rs TGFβR - IFNγ表达 ,并检测该融合蛋白的生物学活性。结果 :转染 p Sec Tag2 A/rs TGFβR - IFNγ的 CHO细胞培养上清表达 rs TGFβR - IFNγ融合蛋白 ,该融合蛋白具有明显的抗病毒活性 ,能拮抗 TGFβ1对 CCL- 6 4细胞的增殖抑制作用 ,能抑制 TGFβ1诱导的体外培养的 HSC活化。结论 :本实验构建的p Sec Tag2 A/rs TGFβR - IFNγ表达质粒能在哺乳动物细胞中表达具有生物学活性的 rs TGFβR - IFNγ融合蛋白。     

大鼠转化生长因子βⅡ型受体胞外区与γ干扰素融合蛋白真核表达载体的构建

目的:在哺乳动物细胞中表达有生物学活性的大鼠转化生长因子βⅡ型受体胞外区与γ干扰素(rsTGFβRⅡ-IFNγ)融合蛋白.方法:提取大鼠肝脏mRNA,用RT-PCR方法分别扩增sTGFβRⅡ和IFNγ基因并克隆至同一真核表达载体pSecTag2A,构建pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ重组体,以脂质体转染至CHO细胞,用ELISA及Western印迹法检测rsTGFβRⅡ-IFNγ表达,并检测该融合蛋白的生物学活性.结果:转染pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ的CHO细胞培养上清表达rsTGFβRⅡ-IFNγ融合蛋白,该融合蛋白具有明显的抗病毒活性,能拮抗TGFβ1对CCL-64细胞的增殖抑制作用,能抑制TGFβ1诱导的体外培养的HSC活化.结论:本实验构建的pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ表达质粒能在哺乳动物细胞中表达具有生物学活性的rsTGFβRⅡ-IFNγ融合蛋白.     

人sBAFF-DT388融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性研究

目的 制备人B淋巴细胞刺激因子-白喉毒素融合蛋白(hsBAFF DT388),探讨其靶向B细胞活性。方法 根据优化合成的hsBAFF DT388基因序列设计引物,PCR扩增目的基因并插入克隆载体pMD19-T,采用菌落PCR、酶谱分析及DNA测序鉴定阳性克隆,重组克隆载体经双酶切后插入表达载体pColdⅡ,并鉴定重组表达载体。重组菌株经ITPG诱导,SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,经Ni2+ NTA层析柱纯化,检测重组蛋白的生物学活性。结果 获得hsBAFF-DT388高效表达菌株,目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右。重组蛋白与BAFF受体阳性细胞特异性结合并对人B细胞系Hmy2.CIR具有靶向细胞毒作用。结论 成功构建hsBAFF DT388表达载体,获得具有靶向B细胞活性的重组蛋白,为其在B细胞恶性肿瘤及自身免疫性疾病治疗中的应用研究奠定基础。     

重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α的分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的稳定表达。方法以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin。利用PCR从pGEM-T/tumstatin和PBV220-TNF-α载体中分别扩增出sig-tumstatin-linker和linker-TNF片段,将其克隆得到sig-tumstatin-linker-TNF片段,sig-tumstatin-linker-TNF片段经酶切后,插入经同样酶切pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tumstatin-linker-TNF基因片段及重组载体进行验证。将重组sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测。结果所获得的sig-tumstatin-linker-TNF片段(1.32kb)序列与报道的序列完全一致。酶切鉴定的结果表明含肿瘤抑素基因的重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF表达载体构建成功。转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF的CHO-K1表达了肿瘤抑素融合蛋白tumstatin-linker-TNF。从生长曲线结果来看,转染pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体和转染pIRESneo3的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢。结论成功地构建了重组人肿瘤抑素融合蛋白的真核表达载体,并获得能稳定表达人肿瘤抑素融合蛋白的CHO-K1。     

mTIGIT-mLumin跨膜融合蛋白慢病毒载体和真核表达载体的构建及体外的稳定表达

目的: 构建以mLumin荧光蛋白为指示系统的小鼠T细胞免疫球蛋白和结构域蛋白(mouse T cell Ig and ITIM domin,mTIGIT)胞外区真核表达载体,并表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。方法: 分别设计mTIGIT和mLumin的特异性引物,通过PCR技术扩增两个目的基因序列,经酶切、连接,克隆至plenti-puro和pcDNA3.1载体。将构建的plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体进行病毒包装并感染HEK-293T细胞,而pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达质粒转染非洲绿猴肾成纤维Cos7细胞,利用两种表达载体的药物抗性进行筛选感染或转染的细胞,检测融合蛋白的表达情况。结果： 通过PCR顺利扩增获得mTIGIT和mLumin,经酶切、连接插入至载体,基因测序结果证实克隆的mTIGIT和mLumin片段序列正确,并成功正确插入到plenti-puro载体和pcDNA3.1载体中;荧光显微镜和共聚焦显微镜观察显示,转染的HEK-293T细胞和Cos7细胞经过筛选能够稳定表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。 结论： 成功构建plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体和pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达载体,且能够在目的细胞中稳定表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。     

M2e-HBC融合蛋白的真核表达

目的:构建以乙肝病毒核心蛋白(HBC)为载体的甲型流感病毒M2基因胞外区(M2e)通用疫苗杆粒,利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,进行真核表达。方法:利用PCR技术将甲型流感病毒M2e基因序列与HBC相连。经酶切、酶联将融合基因插入pFastBacHTA载体,在DH10Bac细胞中进行同源重组,经测序鉴定后构建M2e-HBC杆粒,脂质体转染sf9昆虫细胞,收获并扩增含有M2e-HBC的杆状病毒,经扩增后获得高效价的重组杆状病毒,用SDS-PAGE、免疫荧光法和电镜检测目的蛋白的表达。结果:构建了以HBC为载体的M2e通用疫苗杆粒,通过转染sf9昆虫细胞得到M2e-HBC融合蛋白真核表达。结论:成功构建了HBC与甲型流感病毒M2e融合蛋白的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的：构建结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达．方法：采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合，定向克隆入pcDNA3．1( )中。采用脂质体转染法将pcDNA／Ag85B—MPT64(pcDNA／AM)转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：Ag85B-MPT64融合基因经双向DNA序列测定，碱基突变率为0．11％(2／1707)，突变为无意义突变；重组质粒转染COS-7细胞后经检测证实，该融合基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达，融合蛋白具有良好的抗原性。     

构建大肠杆菌表达GST兔防御素NP-1融合蛋白表达载体的研究

利用计算机软件对兔防御素基因进行分析,消除大肠杆菌不表达或低效表达密码子。同时利用相关软件对基因进行分析,消除可能影响融合基因表达的一些因素,构建兔防御素大肠杆菌高效表达载体。通过初步表达分析,融合蛋白表达量为菌体总蛋白的27.7％。     

人tau融合蛋白的原核表达及纯化

目的构建人His-tau和GST-tau融合蛋白表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达及纯化。方法以质粒pEGFP-tau为模板通过PCR扩增出人tau全长cDNA,并构建到原核表达载体pET28a和pGEX-5X-1中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE染色及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。分别使用His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B与融合蛋白结合来纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pET28a-tau和pGEX-5X-1-tau并在大肠杆菌BL21中诱导其大量表达。经His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B纯化后,可以得到较纯化的His-tau和GST-tau融合蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗tau单克隆抗体(tau-5)所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。结论构建了人tau两种原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该蛋白,为进一步的tau与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

弓形虫ZS株P22基因片段的克隆、表达与融合蛋白的纯化

目的 克隆弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因，构建原核重组表达质粒pThioHieA，B，C／P22，并在大肠杆菌(Top10)中进行表达及纯化融合蛋白。方法 PCR扩增及限制性内切酶Pst Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切496bp的弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段，胶回收纯化，插入表达质粒裁体pThioHisA，B，C多克隆位点，构建置组体pThioHisA，B，C／P22，并转化大肠杆菌(E.coli)Topl0，筛选阳性克隆，以限制性酶切分析及测序鉴定后，以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导，在E.coli Top10中表达，用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物并纯化．结果 PCR扩增出约496bp的P22编码基因目的片段，与预期片段大小相符；所构建的pThioHisA，B，C／P22重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定，与预期结果一致；SDS—PAGE与免疫印迹显示，表达融合蛋白产物约35．4kD．结论 成功构建弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因pThioHisA，B，C／P22表达质粒，诱导表达弓形虫表面抗原P22蛋白，并纯化该融合蛋白。     

融合蛋白TOP_3原核表达载体的构建、表达及纯化研究

目的:利用HIV病毒TAT蛋白转导结构域、人缺氧诱导因子1α氧依赖降解结构域以及CASPASE3构建融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法:分别构建原核表达质粒pET-28a(+)-TAT、pET-28a(+)-TAT-ODD、pET-28a(+)-TAT-ODD-CASPASE3(pET-28a(+)-TOP3);在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白TOP3进行纯化。结果:成功构建了pET-28a(+)-TOP3的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。结论:融合蛋白TOP3的成功表达及纯化,为该融合蛋白应用于肿瘤的治疗研究奠定了理论基础。     

致肾盂肾炎大肠埃希菌黏附素表达载体构建及表达产物抗原性检测

目的 构建致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)P菌毛黏附素PapG重组融合蛋白表达载体．检测该重组蛋白的免疫原性。方法 设计并合成一对P菌毛PapG黏附素结构基因的PCR扩增引物；筛选、鉴定重组质粒。以IPTG诱导PapG与GST重组融合蛋白表达．表达产物经亲和层析纯化后用Western blot分析。结果 成功地构建papG结构基因重组表达载体．所表达的重组蛋白相对分子质量约63kD．可为UPECP菌毛多克隆抗体所识别。结论 所获得的PapG-GST重组融合蛋白纯化产物保持了天然抗原性．可用于疫苗研制及其他免疫学研究。