复合培养人工皮移植12例疗效观察

目的 在体外培养表皮细胞及成纤维细胞并与人工真皮复合培养,用以修复患者皮肤缺损创面.方法 从12例皮肤缺损患者体表切取皮肤标本,分离成单个表皮细胞和小块真皮组织进行体外培养、增殖,将收获的表皮细胞和成纤维细胞与人工真皮复合培养,形成人工皮,移植于患者皮肤缺损创面.结果 复合培养人工皮能存活,形成皮肤替代物,皮肤缺损创面得以修复.结论 复合培养人工皮能在新鲜创面上存活,形成皮肤替代物,性质比单纯培养表皮细胞膜片移植效果好,比自体皮片扩增速度快.     

利用PEG／PBT构建人工皮肤的试验研究

目的在聚乙二醇／聚对苯二甲酸丁二醇酯(PEG／PBT)嵌段共聚物中植入幼儿包皮成纤维细胞，构建人工真皮替代物，以研究细胞的生长、分化、增生及真表皮间的相互作用，为研制大面积创面覆盖物——复合皮奠定基础。方法(1)酶消化法培养幼儿成纤维细胞；(2)制备：PEG／PBT膜，接种成纤维细胞后于不同时间观察细胞的形态变化；(3)H．E染色；(4)扫描电镜观测PEG／PBT膜的表面是否有成纤维细胞附着；(5)透射电镜观察膜上成纤维细胞形态及结构特点。结果(1)利用PEG／PBT膜构建的人工真皮形成后质地与颜色近似真皮组织，有一定的弹性，可出现较明显的细胞增殖，未见人工真皮收缩现象。(2)H．E染色可见PEG/PBT膜呈较均一的淡红色网状分布，成纤维细胞主要分布于胶原膜表面。(3)扫描电镜下可见PEG／PBU膜表面有梭形的成纤维细胞出现，且成纤维细胞紧密贴附于PEG／PBT膜上。(4)透射电镜下见成纤维细胞功能活跃。结论成纤维细胞在PEG／PBT膜中有着活跃的生物学特性，以PEG／PBT膜为支架构建的人工真皮具有同正常真皮相似的结构与功能。     

肢体复合皮移植术后中远期病理及电镜结构特征

目的 观察对比肢体正常皮肤与脱细胞异体真皮加自体刃厚头皮复合皮移植术后中远期病理及电镜结构,为复合皮移植远期疗效提供组织学依据.方法 收集2003年3月～2006年8月17例行四肢挛缩瘢痕切除,缺损皮肤创面采用脱细胞异体真皮加自体刃厚头皮复合皮移植修复术后9月～2年的组织标本.取复合皮组织标本23份为观察组,并取患者临近正常皮肤组织标本23份为对照组.分别进行HE染色及扫描电镜观察,观察表皮细胞层数、基底膜厚度、真皮结构成分、成纤维细胞及血管计数等.结果 HE染色:复合皮组织结构完整,具备正常表皮及真皮各种结构成分,基底膜再生完整.复合皮及正常皮肤的表皮细胞层数分别为16.33±5.89和26.57+3.46(P=0.007);基底膜厚度(μm)分别为1.05～0.21和1.13±0.17(P=0.168).扫描电镜观察:复合皮半桥粒、成纤维细胞及再生毛细血管计数与正常皮肤组织十分接近.分别为6.33±2.31和6.79±1.57(P=0.127),7.59±2.06和8.02+9.85(P=0.067),以及14.03+9.60和13.34±3.52(P=0.369).结论 肢体复合皮移植后中远期组织结构接近正常皮肤,移植效果满意.     

组织工程皮肤修复动物皮肤缺损的实验研究

目的利用表皮细胞复合脱细胞真皮构建组织工程皮肤，探讨其用于修复动物皮肤缺损的可行性。方法将扩增的人表皮细胞复合异种（猪）脱细胞真皮支架构建组织工程皮肤，将制备的人工皮肤移植于裸鼠全层皮肤缺损，观察创面愈合情况并进行直接免疫荧光鉴定。结果构建的组织工程皮肤可用于修复裸鼠全层皮肤缺损，创面愈合良好，新生的表皮由移植的人表皮细胞增殖形成。结论利用表皮细胞复合脱细胞真皮构建的组织工程皮肤可用于修复动物全层皮肤缺损。     

组织工程化皮瓣的构建

目的应用脂肪组织来源干细胞(ASCs)在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法(1)构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。(2)构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞(Kc)和成纤维细胞(Fb)。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。(3)构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果(1)ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。(2)经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。(3)组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

含转表皮细胞生长因子基因人表皮细胞复合皮的构建与移植

目的探讨转染表皮细胞生长因子(EGF)基因的人表皮细胞移植后EGF的表达及对细胞增殖的影响。方法将Balb/c小鼠的表皮细胞和转染EGF基因的人表皮细胞按1∶1、1∶3、1∶5的比例混合,种植于脱细胞真皮替代物表面,于体外培养后形成复合皮,将复合皮移植于Balb/c小鼠全层皮肤缺损创面,抗EGF抗体免疫组织化学染色观察移植后EGF的表达,抗增殖性细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色观察表皮细胞的增殖情况。结果小鼠表皮细胞与转EGF基因的人表皮细胞按1∶5混合构建的复合皮移植后1～2周,抗EGF染色阳性,1周时,新生表皮基底层中PCNA阳性细胞比含单纯小鼠表皮细胞的复合皮移植后显著增多(P<0.01)。结论转染EGF基因的人表皮细胞在移植后早期可表达外源基因产物,并促进表皮细胞增殖。     

皮耐克组织工程皮肤修复皮肤创面的研究

【目的】探讨采用皮耐克真皮支架与大鼠表皮干细胞、成纤维细胞构建组织工程皮肤修复皮肤缺损的可行性。【方法】分离培养大鼠表皮干细胞、成纤维细胞并进行免疫荧光鉴定。成纤维细胞接种于皮耐克敷料构建类真皮,表面种植表皮干细胞构建组织工程皮肤。将BALB/c裸鼠复制背部皮肤缺损模型,随机分为3组,单纯支架组移植皮耐克敷料,成纤维细胞支架组移植皮耐克成纤维细胞复合物,组织工程皮肤组移植皮耐克组织工程皮肤。术后记录创面愈合情况,并分别取5、7d创面组织进行病理学检查。【结果】表皮干细胞角蛋白15(CK15)、β1整合素表达阳性,成纤维细胞层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)表达阳性。组织工程皮肤组愈合情况最好,移植物处成纤维细胞增生,新生毛细血管明显,表皮细胞分层排列规则。【结论】皮耐克组织工程皮肤促进裸鼠皮肤创面修复效果良好。     

人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究

目的建立人皮肤角质形成细胞(keratinocyte)成纤维细胞(fibmblast)原代培养和体外连续培养的模型，为组织工程化皮肤提供充足的种子细胞。方法以5-15岁小儿包皮为材料，胰蛋白酶消化后，分离两种细胞，分别用无血清表皮培养液(K-SFM)、DMEM(10％血清)培养，对年轻细胞(2-4代角质形成细胞，10-40代成纤维细胞)均用倒置显微镜进行大体观察，透射电镜进行超微结构观察，并拍照记录，同时进行免疫细胞化学鉴定。结果消化后得到大量细胞，在培养2周后开始传代，光镜下角质形成细胞呈典型铺路石状，透射电镜下呈多边形，符合角质形成细胞特征；成纤维细胞光镜下呈梭形，放射状或漩涡状排列，电镜证实是成纤维细胞。免疫细胞化学检测：角质形成细胞鼠抗人角蛋白(AE1／AE3)单克隆抗体(mouse anti-cytokeratin)染色阳性；成纤维细胞鼠抗人Ⅰ型，Ⅲ型胶原单克隆抗体(mouse anti-TypeⅠ，ⅢCollagen)和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(mouse anti-vim-entin)染色阳性。结论用简便易行，经济实用的方法在体外对角质形成细胞和成纤维细胞进行分离、培养和传代，能同时得到足够数量的组织工程皮肤的种子细胞。     

异体表皮细胞和成纤维细胞库的建立

目的 寻找表皮细胞和成纤维细胞体外培养、鉴定、冻存与复苏的可行方法.方法 酶消化法分离表皮细胞和成纤维细胞,分别进行原代、传代培养,并对细胞进行冻存与复苏.表皮细胞进行广谱角蛋白-异硫氰酸荧光素(PAN-FITC)免疫荧光染色,成纤维细胞行波形蛋白-FITC免疫荧光染色.结果 表皮细胞呈克降样增长,以后细胞逐渐互相融合.PAN-FITC染色均为阳性.成纤维细胞的体外生长活力强,波形蛋白-FITC染色呈阳性.结论 酶消化法是表皮细胞和成纤维细胞体外培养的重要方法,本实验为构建组织工程皮肤奠定了基础.     

应用胶原蛋白构建组织工程皮肤的实验研究

目的 探讨以胶原蛋白为支架构建组织工程皮肤的体外培养理想方法.方法 体外分离、培养、鉴定角朊细胞和成纤维细胞;利用本室自制胶原蛋白,制备胶原凝胶和胶原海绵两种组织工程支架;在成功构建人工真皮的基础上,种植角朊细胞,构建人工复合皮肤,并进行组织学及免疫组化检查.结果 制备的胶原海绵孔径平均100～150μm,孔隙率89%,组织相容性良好;两种皮肤替代物免疫组化染色显示Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白(Laminin)阳性,HE染色可见均具有表皮和真皮双层结构,厚度约3mm,在形态结构上与正常皮肤相似.结论 培养的人角朊细胞和成纤维细胞种植于胶原蛋白支架上气-液界面培养可构建出具有类似天然皮肤结构的组织工程皮肤.     

组织工程化皮瓣构建的初步研究

应用脂肪组织来源干细胞（ASCs）在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法（1）构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。（2）构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞（Kc）和成纤维细胞（Fb）。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。（3）构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果（1）ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。（2）经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。（3）组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论 分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

复合壳多糖人工皮肤的初步实验研究

目的探讨复合壳多糖人工皮肤移植家兔后表皮层角蛋白的表达以了解移植后皮肤表皮的分化情况.方法分别将复合壳多糖人工皮肤移植前、移植后1个月、移植后2个月、正常人皮肤、正常兔皮肤石蜡块切片,用抗广谱角蛋白多抗、抗角蛋白K5和K10单抗进行免疫组化染色,观察表皮层角蛋白的表达和表皮分化情况.结果复合壳多糖人工皮肤移植后1个月及2个月表皮层均有较强的角蛋白表达,与正常皮肤相似;基底层以上细胞有角蛋白K10表达,且越接近表皮表面表达越强,与正常人皮肤相似,基底层细胞有角蛋白K5表达,但明显弱于正常人皮肤.结论复合壳多糖人工皮肤移植家兔后表皮层均有角蛋白表达,有增生性细胞和分化细胞,表皮分化良好、层次清楚,与正常皮肤相近.     

组织工程化表皮膜片修复裸鼠创面的实验研究

目的 构建组织工程化表皮细胞膜片并应用于修复裸鼠全层皮肤缺损创面。方法 体外分离、培养、扩增人类表皮细胞，与壳聚糖—明胶膜构建表皮细胞膜片，用于修复裸鼠背部全层皮肤缺损创面，以单纯壳聚糖／明胶膜作为对照；术后行大体、组织学观察及免疫组织化学检测。结果 表皮细胞可以壳聚精—明胶膜作为载体在体外培养，达到60％～70％亚融合状态时，移植人表皮细胞／壳聚糖—明胶膜到裸鼠全层皮肤缺损创面，人表皮细胞可以在创面存活并继续增殖分化，形成连续的表皮覆盖创面。结论 人表皮细胞／壳聚糖—明胶膜是一种理想的组织工程表皮替代物。     

组织工程化皮瓣的构建

摘要：目的应用脂肪组织来源干细胞（ASCs）在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组
织工程化皮瓣。方法（1）构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并
进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。（2）构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮
细胞（Kc）和成纤维细胞（Fb）。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液
界面继续培养10 d形成复合皮。（3）构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结
构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果（1）ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂
诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。（2）经过气-液界面培养后,
Kc成层分化,形成基底上层。（3）组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞
聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组
装培育,可构建出组织工程化皮瓣。
     

在体诱导表皮细胞去分化的初步实验研究

目的 在体诱导表皮细胞去分化,探索与表皮细胞去分化有关的信号通路.方法 包皮皮片去除皮下组织,用中性蛋白酶分离表皮,Ⅳ型胶原反复粘贴并牵拉表皮去除基底细胞层.处理后表皮片移植于裸鼠全层皮肤下,分别于3、5、7 d取出移植皮片,采用免疫组织化学染色、流式细胞仪检测、Western blot和RT-PCR等方法检测皮片移植前后表型的改变和ERK MAPK通路各信号分子表达的变化情况.结果 去基底细胞层处理的表皮片干细胞标志物CK19和β1整合素染色阴性;移植后5 d,存活皮片CK19和β1整合素染色呈多层分布,而不是正常表皮中的单层分布.流式细胞仪检测结果显示,表皮片移植后CK19阳性细胞和β1整合素阳性细胞由移植前的0.00%分别增加到7.54%和5.24%,而CK10阳性细胞由99.62%下降为86.56%.Western blot和PCR检测也证实CK19和β1整合素蛋白水平和mRNA水平表达在移植后明显增强.ERK及上下游信号分子(p-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2和c-myc)表达增强.t-MEK1/2和t-ERK1/2移植前后表达无显著差异(P＞0.05).结论 处于终末分化阶段的表皮细胞可以向干细胞状态逆转,这个过程可能与ERK MAPK信号通路有关.     

表皮细胞和成纤维细胞在异种无细胞真皮上的生长和增殖

及时封密创面是烧伤治疗的关键,但大面积深度烧伤患者常存在自体皮源不足的问题.近年来,组织工程技术的应用为提供充足的皮源带来了希望,如在胶原-GAG(氨基葡聚糖)膜及PGA/PGL(聚羟基乙酸/聚乳酸)网上种植表皮细胞和(或)成纤维细胞,经体外培养后可形成复合皮,并初步用于烧伤创面的修复.本研究观察了表皮细胞和成纤维细胞种植于无细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)上的生长和增殖情况,为进一步移植试验奠定基础.     

脱细胞异种真皮皮下埋植的实验研究

目的 :观察胰蛋白酶及冻融法制备的脱细胞真皮能否为构建人工复合皮提供一种理想的真皮替代物。方法 :将胰蛋白酶消化和冻融法制备的脱细胞异种真皮 ( 2cm× 2cm)埋入SD大鼠皮下 ,分别于术后 2、4、6、8周活检行组织学检查。结果 :术后 4周脱细胞真皮内有明显的微血管和成纤维细胞长入。结论 :胰蛋白酶消化和冻融法制备的脱细胞异种真皮能诱导宿主微血管和成纤维细胞长入 ,为其上培养的表皮或重叠移植的自体薄皮片提供营养 ,是一种理想的真皮替代物。     

永久性皮肤替代物的研究现状及展望

表皮细胞培养与扩增技术使得表皮替代物的构建和应用成为可能,但其远期效果欠佳。真皮基质和成纤维细胞的引入可促进表皮细胞的生长、分化和基底膜的形成,诱导血管内皮细胞生长,提高移植成功率,改善修复质量,但与理想的皮肤替代物仍有一定差距。未来主要在表皮干细胞的分离和培养、表皮细胞和成纤维细胞的基因修饰、表皮层与真皮层的有效整合、真皮的血管化,以及皮肤附件的构建等方面展开深入的研究。     

组织工程皮肤种子细胞生物学特性的研究

目的建立一种分离培齐组织工程皮肤种子细胞的方法,并对细胞的生物学特性进行研究。方法分别通过Dispase-胰蛋白酶消化法和组织块法对表皮干细胞和成纤维细胞进行分离培养,利用倒置相差显微镜和扫描电镜等对其进行形态学观察,MTT比色法对细胞的增殖动态进行测定,免疫组化法对两种细胞进行鉴定。结果分离的表皮细胞和成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖,活力较好,免疫组织化学染色为阳性。结论通过Dispase-胰蛋白酶消化法和组织块法分别获得的表皮干细胞和成纤维细胞在体外能够快速扩增、培养,可为下一步组织工程皮肤的构建提供充足、可靠的细胞源。     

组织工程化表皮膜片修复裸鼠创面的实验研究

目的构建组织工程化表皮细胞膜片并应用于修复裸鼠全层皮肤缺损创面.方法体外分离、培养、扩增人类表皮细胞,与壳聚糖-明胶膜构建表皮细胞膜片,用于修复裸鼠背部全层皮肤缺损创面,以单纯壳聚糖/明胶膜作为对照;术后行大体、组织学观察及免疫组织化学检测.结果表皮细胞可以壳聚糖-明胶膜作为载体在体外培养,达到60%～70%亚融合状态时,移植人表皮细胞/壳聚糖-明胶膜到裸鼠全层皮肤缺损创面,人表皮细胞可以在创面存活并继续增殖分化,形成连续的表皮覆盖创面.结论人表皮细胞/壳聚糖-明胶膜是一种理想的组织工程表皮替代物.