亮氨酸拉链促进蛋白质剪接介导的双载体转凝血VIII因子基因

作者最近基于蛋白内含子 (intein) 的双载体转B区缺失型凝血VIII因子 (BDD-FVIII) 基因研究证明, 表达后的重、轻链可通过蛋白质反式剪接成为共价连接的完整BDD-FVIII分子并发挥凝血生物活性, 但存在不完全剪接的前体蛋白。本文试图通过将具有特异性强相互作用的亮氨酸拉链引入intein序列, 提高反式剪接的效率, 用双载体系统向培养的COS-7细胞共转融合intein的重链和轻链基因, 通过瞬时表达观察了细胞内BDD-FVIII的剪接和分泌至培养上清液的剪接BDD-FVIII量和生物活性。结果显示, Western blotting检测到共转基因细胞内明显增强的BDD-FVIII剪接, 表现为前体蛋白的减少; 分别用ELISA和Coatest法分析共转基因细胞培养上清液中分泌的剪接BDD-FVIII蛋白量和生物活性为 (106 ± 12) ng·mL⁻¹和 (0.89 ± 0.11) U·mL⁻¹, 明显高于无亮氨酸拉链的intein融合重链和轻链基因共转基因细胞 [ (72 ± 10) ng·mL⁻¹和 (0.62 ± 0.07) U·mL⁻¹], 而且不依赖细胞机制的蛋白质剪接反应明显增强, 表现为混合培养的转重链和轻链基因细胞上清液中增加的剪接BDD-FVIII蛋白量和生物活性 [ (36 ± 11) ng·mL⁻¹和 (0.28 ± 0.09) U·mL⁻¹]。结果表明, 亮氨酸拉链可通过增强融合于重链和轻链的intein间的相互作用提高蛋白质反式剪接的效率, 改善基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FVIII基因的效果, 为进一步的动物体内基于蛋白质剪接的双腺相关病毒 (AAV) 载体转FVIII基因研究提供了实验依据。     

轻链二硫键缺失突变促进链间重组二硫键BDD-FVⅢ变构体分泌

凝血VⅢ因子(coagulation factor VⅢ, FVⅢ)分子内含有8对二硫键,参与维持其结构和功能,轻链A3结构域中Cys¹⁸⁹⁹/Cys¹⁹⁰³间的二硫键阻碍分泌,本室曾通过在FVⅢ重链和轻链间引入重组二硫键,证明其可促进消除B结构域的FVⅢ (B domain-deleted FVⅢ, BDD-FVⅢ)重、轻链异源二聚体的组装和分泌。本文在此基础上将BDD-FVⅢ的重链A2区Met⁶⁶²和轻链A3区Asp¹⁸²⁸突变为Cys,从而构建可形成链间二硫键的变构体F8C。将F8C轻链A3区Cys¹⁸⁹⁹和Cys¹⁹⁰³突变为Gly,从而消除内源性二硫键,得到变构体F8CG,并探索这两种BDD-FVⅢ变构体的分泌促进作用。通过HEK293和COS-7细胞的基因瞬时转染实验,检测细胞表达变构体多肽的二硫键形成情况和培养上清中变构体多肽的分泌量和凝血活性,并检测变构体的血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)结合力。结果...     

vWF和vWF裂解酶水平对糖尿病肾病的影响

目的 探讨糖尿病肾病（DN）患者血清血管性血友病因子（vWF）、vWF裂解酶（ADAMTS13）的水平及其作 用。方法 选取健康体检者（正常对照组）50例和2型糖尿病（T2DM）组合并DN患者144例,根据尿微量白蛋白与尿 肌酐比值（ACR）,将患者分为单纯T2DM组（42例,ACR＜30 mg/g）、微量白蛋白尿组（56例,30 mg/g≤ACR˂300 mg/g）, 大量白蛋白尿组（46例,ACR≥300 mg/g）。采用免疫透射比浊法检测vWF水平;双抗体夹心法检测ADAMTS13水平, 并检测血肌酐（sCr）、尿素氮（BUN）、糖化血红蛋白（HbA1c）、D-二聚体和纤维蛋白原（Fib）等,计算估计的肾小球滤 过率（eGFR）。结果 正常对照组、单纯T2DM组、微量白蛋白尿组、大量白蛋白尿组HbA1c、Fib、D-二聚体及vWF依 次增加,而ADAMTS13依次降低（P＜0.05）。多元线性回归分析显示,白蛋白与D-二聚体是血清vWF的影响因素,而 D-二聚体是ADAMTS13水平的影响因素。ROC曲线分析显示,vWF诊断DN肾脏损伤敏感度较高,D-二聚体诊断 DN肾脏损伤敏感度和特异度较均衡,特异度更有优势。结论 血清vWF、ADAMTS13在糖尿病肾病的发生及发展中 可能起着重要作用,其水平可以成为DN早期的诊断和预测的参考指标。     

代谢综合征幼鼠血管VEGF和vWF的表达及意义

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)和血管性假血友病因子(vWF)在代谢综合征(MS)幼鼠血管壁和血清中的表达及意义.方法:3周龄SD大鼠随机分为普通饮食组(NC组)、高脂组(FC组)和高脂+高盐组(FSC组).实验4周末测体质量、腹围、血压、内脏脂肪质量、血脂,行口服葡萄糖耐量试验,计算胰岛素抵抗指数.取腹主动脉免疫组化法检测血管壁VEGF和vWF表达,ELISA方法检测血清VEGF和vWF表达.结果:FSC组体质量、腹围、血压、内脏脂肪、血糖、胰岛素水平均较NC组增加,血脂紊乱加重,并出现胰岛素抵抗.FC组仅体质量、内脏脂肪质量高于NC 组,其他上述指标差异无统计学意义.FSC组血管壁及血清中VEGF和vWF较NC组和FC组均升高.FC组较NC组血管VEGF及血清中VEGF和vWF均升高.结论:VEGF和vWF参与了血管壁的功能紊乱或损伤的病生理改变.     

Cys突变体凝血Ⅷ因子的蛋白质反式剪接

为改善蛋白质反式剪接效率,将B-区缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)重链的Tyr664和轻链的Thr1826突变为Cys,双载体共转COS-7细胞,观察了细胞内蛋白质剪接、二硫键形成和细胞培养上清液中分泌的剪接BDD-FVIII量和活性。Western blotting检测结果显示,Cys突变可在细胞内形成链间二硫键,剪接BDD-FVIII蛋白量明显增加;双夹心ELISA检测分泌的剪接BDD-FVIII为(128±24)ng.mL/1,明显高于对照(89±15)ng.mL/1;Coatest法检测结果显示,细胞分泌的凝血活性为(0.94±0.08)u.mL/1,也明显高于对照(0.62±0.15)u.mL/1。结果表明,链间二硫键形成可显著提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-Ⅷ基因作用,为进一步动物体内实验提供了依据。     

慢性心力衰竭患者凝血功能的研究

目的对慢性心力衰竭(CHF)患者血管内皮及凝血系统异常改变进行研究,分析其功能紊乱的机制。方法选择CHF患者152例(CHF组)和健康对照150例(对照组),检测所有研究对象血浆血管性血友病因子抗原(vWF∶Ag)含量、组织因子活性(TF∶A)及凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)水平。结果 CHF组的vWF∶Ag、TF∶A、TAT水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。Ⅱ度心衰患者vWF∶Ag、TF∶A高于Ⅰ度心衰患者,差异有统计学意义(P<0.01),Ⅲ度心衰患者vWF∶Ag、TF∶A、TAT高于Ⅱ度心衰患者(P<0.01)。CHF患者vWF:Ag与TF∶A和TAT无明显相关性(r分别为0.21、0.40,P>0.05),TF∶A与TAT呈正相关(r=0.69,P<0.01)。结论 CHF患者存在严重的血管内皮损伤,凝血系统发生显著活化,导致血栓风险增加。vWF∶Ag、TAT和TF∶A水平变化与患者心衰程度密切相关。     

老年脓毒症患者抗凝血纤溶系统功能改变的研究

脓毒症可导致患者发生弥散性血管内凝血、急性呼吸窘迫综合征或者多器官功能衰竭等致死性并发症,文献显示,患者年龄越大,预后越差[1]。在老年人群中,脓毒症病死率更高。有研究表明,患者凝血、抗凝血、内皮等系统功能的异常     

刺参酸性粘多糖SJAMP和HLAMP对凝血酶与内皮细胞反应的影响

本文研究了二种由刺参体壁提取的硫酸多糖SJAMP和HLAMP对凝血酶和内皮细胞相互作用的影响。凝血酶可以显著增加正常人脐静脉内皮细胞分泌von Willebrand因子和前列环素(PGI_2)的功能。后者利用放射免疫法测定其稳定的代谢产物6-酮-PGF_1α。经SJAMP、HLAMP或肝素预先保温,可以抑制凝血酶诱导的内皮细胞的上述分泌功能,而且这种抑制作用与SJAMP、HLAMP或肝素的浓度相关。     

脱氧萎镰菌醇通过下调GRP78提高双链转FVⅢ基因细胞分泌重链和生物活性

双链转凝血VⅢ因子(FVⅢ)基因是克服AAV载体容量限制的有效方法,但重链分泌的低效性带来链不均衡性。本文旨在用脱氧萎镰菌醇(deoxynivalenol,DON)降解内质网分子伴侣蛋白GRP78,通过减少重链与GRP78的结合提高重链分泌,改善双链转FVⅢ基因的功效。用DON处理双链共转基因细胞,观察了双链转FVⅢ基因293细胞分泌的重链和FVⅢ活性。结果显示,用500 ng.mL-1 DON处理细胞3 h后,GRP78蛋白水平明显降低,细胞的生长不受明显影响;单独转FVIII重链基因的DON处理细胞分泌的重链量[(59±11)ng.mL-1]明显高于对照细胞[(15±4)ng.mL-1],双链共转基因时重链的分泌量进一步增加,为(146±34)ng.mL-1,活性达到(0.66±0.15)U.mL-1,明显高于双链转基因对照细胞[分别为(76±17)ng.mL-1和(0.35±0.09)U.mL-1]。结果表明,DON可通过下调GRP78改善重链的分泌性,提高双链转FVⅢ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FVⅢ基因提供了实验依据。     

羟亚乙基拟肽类人β-分泌酶抑制剂的合成和活性

本文设计并合成了一系列含Leu*Ala羟亚乙基二肽电子等排体的β-分泌酶拟肽类抑制剂,并测定了β-分泌酶抑制活性.活性最强的化合物N9显示59.66％(10 mg/mL)抑制率.化合物N9可经计算化学方法进一步优化.     

中医乳房穴位按摩对减轻乳房胀痛和促进乳汁分泌的影响

目的研究分析中医乳房穴位按摩对减轻乳房胀痛和促进乳汁分泌的影响。并总结相关的经验和体会．为临床提供借鉴意义。方法选取2010年10月至2012年12月访视的200例分娩产妇作为研究对象．对其临床资料进行回顾性分析。将200例产妇分为观察组和对照组各100例。对照组产妇采用传统乳房护理。观察组在对照组基础上采用中医乳房穴位按摩,比较两组产妇在选用不同护理模式后,在减轻乳房胀痛和促进乳汁分泌方面的效果。结果观察组产妇乳房胀痛症状明显减轻,且乳汁分泌较为充足,相比于对照组具有显著优势,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论在产妇产后及时进行中医乳房穴位按摩可以有效地减轻乳房胀痛,且对于产妇的乳汁分泌具有一定的促进作用．适合在社区护理中使用。     

蛋白激酶C激活剂和抑制剂对肿瘤坏死因子杀瘤活性的影响

以小鼠成纤维细胞瘤L929细胞为靶细胞,研究蛋白激酶C(PKC)的激活剂和抑制剂对人重组肿瘤坏死因子(rHuTNF)杀瘤活性的影响.各种药物与rHuTNF 10 ng·ml~(-1)和放线菌素D 1 μg·ml~(-1)温育18 h,结果表明PKC的激活剂佛波醇-12-肉豆蔻酸盐-13-乙酸盐(PMA)2.5～160ng·ml~(-1)可浓度依赖性地抑制rHuTNF的杀瘤活性.Sc-10(1～16μg·ml~(-1))单独作用很弱,但可浓度依赖地增强PMA 10 ng·ml~(-1)或A23187 0.5μg·ml~(-1)的抑制作用,PKC抑制剂1-(5-异喹啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(H-7)单独作用对rHuTNF杀瘤活性无影响,但可减弱PMA 50ng·ml~(-1)的抑制作用.槲皮囊2～16μg·ml~(-1)则可直接抑制rHuTNF的杀瘤活性,钙调蛋白抑制剂N-(6-氨己基)-5-氯-1-萘磺酰胺(W-7)及其同系物也有微弱的抑制作用.结果提示PKC在rHuTNF杀瘤作用中起着重要作用.     

糖尿病大鼠肾皮质节活化正常T细胞表达与分泌因子和desmin表达及其干预的研究

目的：研究糖尿病大鼠肾皮质RANTES和desmin表达及雷公藤内酯醇对其干预作用。方法 SD大鼠随机分为正常组（ NG）、模型组（ DM）和小、大剂量雷公藤内酯醇组（T1,T2：0．2,0．4 mg? kg－1）,灌胃。实验第4,8,12周,检测各组5只大鼠的血糖、肾重、24 h尿白蛋白;同时观察肾皮质中RANTES和demin mRNA的表达。结果 DM组,肾皮质RANTES和demin的表达在第4,8,12周较NG组显著升高（ P ＜0．05）,且从第4周末起,逐渐增高到12周末（ P ＜0．05）;T1、T2组较DM组表达量显著降低（ P ＜0．01）;且T2组较T1组各周的表达更低（ P＜0．05）;从第4周末起,T1组的RANTES mRNA表达逐渐下降至12周末（ P＜0．05）;与第4周末相比,T2组的RANTES mRNA表达在第12周末显著下降（ P＜0．01）;T1组和T2组的desmin mRNA表达在第12周末均较第4周末均显著下降（ P＜0．05）。 DM组RANTES mRNA的表达与desmin mRNA的表达和24 h尿蛋白显著正相关。结论雷公藤内酯醇可能通过抑制糖尿病大鼠肾皮质RANTES的过度表达,缓解足细胞损伤,减轻蛋白尿。     

两种长效避孕针对抗凝血酶Ⅲ活性和含量影响的研究

９６名健康育龄妇女,随机分为Ｃｙｃｌｏｆｅｍ组（复方醋酸甲孕酮）和Ｍｅｓｉｇｙｎａ组（复方庚炔诺酮）,连续用针９个月,观察两针剂对抗凝血酶Ⅲ及Ｘ因子的影响,并以口服片Ｏｒｔｈｏ－Ｎｏｖｕｍ１／３５作对照。结果表明,Ｃｙｃｌｏｆｅｍ组,ＡＴ血活性变化不明显,其含量则呈现升高趋势．对Ｘ因子无明显影响。Ｍｅｓｉｇｙｎａ组,ＡＴⅢ活性略有下降．而其含量则无明显变化,同时,Ｘ因子明显下降（降低４．２％到１０．７％）．在ＯＣ组,ＡＴⅢ活性稍有下降,但不显著,其含量的基础值高于用什组（Ｐ＜０．０５）,服药期间呈下降趋势,Ｘ因子则显著增加（１６．８％到２３．５％）。认为商种避孕针剂对ＡＴⅢ的影响均无重要的临床意义。     

小儿急性肾小球肾炎血清内皮素和一氧化氮的变化

内皮素（endothelin,ET）由血管内皮细胞分泌的具有强烈血管收缩作用的活性物质,与肾小球肾炎的免疫发病过程中造成的肾脏损害有关。一氧化氮（nitric oxide,NO）作为一种血管舒张因子,是调节和参与机体生理和病理过程的重要细胞因子,具有广泛的生物学活性,与神经传导、免疫反应、炎性反应和血压控制等密切相关,舒张血管从而达到保护肾脏的作用。     

Kininogen D5和TRAIL融合蛋白的克隆表达及生物学活性的研究

用重组PCR技术得到Kininogen D5和TRAIL的融合编码序列,将该DNA片段克隆到原核表达载体pMAL-c2,重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,得到MBP-KT和MBP-TK,经AmyloseResin亲和层析柱层析,得到初步纯化的融合蛋白.结果表明MBP-KT对胰腺癌细胞1990有明显的杀伤作用其作用的ED5.为20 ng/ml,而MBP-TK对1990的抑制作用不明显;同时,MBP-KT和MBP-KD5对内皮细胞ECV304有明显的抑制作用,MBP/KT作用于ECV304的ED50为0.1μg/ml,MBP/KD5作用于ECV304的ED50为9.5μg/ml,但是MBP-TK和TRAIL几乎无作用,表明融合蛋白KT既具抗肿瘤作用又有抗新生血管的作用.本研究为进一步开发靶向性杀伤肿瘤药物奠定了基础.